缺氧缺血性腦病新生兒血清miR-139-5p，HDAC4和GFAP表達水平及其臨床價值研究

張麗蓉，林 艾，楊 麗（廣元市中心醫院新生兒科，四川廣元 628000）

缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是圍生期窒息導致的新生兒腦部缺氧缺血性腦損傷疾病。HIE 臨床主要表現為意識障礙、昏迷等[1]。腦損傷嚴重患兒可能發生新生兒智力障礙、多器官功能損傷等永久性神經系統后遺癥[2]，嚴重影響神經系統發育，因此腦損傷嚴重程度的早期判定是臨床研究熱點。微小核糖核酸（microRNA，miR）是非編碼RNA，可作為神經系統疾病診斷指標[3]。據報道，miRNA 與神經元損傷和神經炎癥有關，可能在HIE 的發病機制中起關鍵作用[4]。miR-139-5p 與神經系統疾病發展密切相關[5]。YAO 等[6]發現miR-13p-5p 可能與缺血性腦卒中患者腦缺血/再灌注損傷的減輕機制有關。SAHA 等[7]研究顯示，海馬組織組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylase-4，HDAC4）的異常表達與腦損傷后的焦慮、抑郁行為和記憶功能有關。膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）與新生兒窒息后腦損傷嚴重程度有關[8]。目前關于miR-139-5p，HDAC4 和GFAP 在HIE 患兒血清中的表達情況及其在之間關系的研究較少，基于此，本研究通過檢測miR-139-5p，HDAC4 和GFAP 在HIE 患兒血清中表達情況，并分析其與腦損傷嚴重程度的關系，以期為臨床預防HIE 腦損傷進展提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月～2022年3月廣元市中心醫院分娩的HIE 新生兒72 例為研究對象（研究組），其中男性32 例，女性40 例。納入標準：①符合HIE 診斷標準，參考2005年《新生兒缺氧缺血性腦病診斷標準》[9]；②患兒出生時存在神經系統癥狀；③胎齡≥37 周。排除標準：①先天性腦畸形患兒；②出生時伴隨有嚴重的心、肝、腎功能異常；③電解質紊亂、顱內出血和產傷等原因引起的抽搐；④血液系統疾病患兒；先天性遺傳代謝性疾病、宮內感染及其他先天性疾病所引起的腦損傷患兒；⑤中樞神經系統感染、膽紅素腦病。以同期健康的足月新生兒75 例為對照組，其中男性36例，女性39 例。二組基線資料比較見表1。家屬均知情同意，研究經廣元市中心醫院倫理委員會批準同意（倫理批號：2016-11-098）。

表1 研究組和對照組基線資料比較[n（%），±s]

表1 研究組和對照組基線資料比較[n（%），±s]

類別研究組對照組t/χ2P性別/男時體重（k32361.6360.201出生g） 3.02±0.443.12±0.511.2710.206分娩孕周（周） 39.14±6.64 38.54±7.150.5270.599日齡（天）3.64±0.423.72±0.531.0120.313

1.2 儀器與試劑 實時熒光定量PCR 儀（美國BIO-RAD 公司），總RNA 提取試劑盒[貨號：DP419，天根生化科技（北京）有限公司]，cDNA合成試劑盒[貨號：FP314，天根生化科技（北京）有限公司]，血清GFAP 水平用GFAP ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集：收集新生兒性別、胎齡、平均日齡、出生時體重、出生后1 min 內阿氏評分（Apgar 評分）、出生后5 min 內Apgar 評分、產婦基本情況（妊娠期高血壓、母體貧血、產程異常、胎盤異常、胎膜早破、羊水污染、母體高齡、產前發熱、分娩方式等）等。

1.3.2 血清樣本采集：在新生兒出生后24h 內采集股靜脈血2 ml，離心（3 500 r/min，15 min），留上清，置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 實時熒光定量PCR 檢測血清中miR-139-5p，HDAC4 表達水平：血清總RNA 用總RNA 提取試劑盒提取，然后用cDNA 合成試劑盒逆轉錄合成cDNA。用實時熒光定量PCR 儀對miR-139-5p，HDAC4 進行擴增。反應條件：95℃ 90s；95℃30s，63℃30s，72℃15s，40 個循環。反應引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，miR-139-5p，F：5’-i:TCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3’，R：5’-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3’；U6，F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；HDAC4，F：5’-GTGATGGGATTTCCATTGAT-3’，R：5’-CAGTGGTTCAGATTCCGGTGG-3’；β-actin，F：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，R：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。miR-139-5p以U6為內參，HDAC4以β-actin為內參。采用2-ΔΔCt算法計算miR-139-5p，HDAC4 的相對表達量。

1.3.4 血清GFAP 水平檢測：血清GFAP 水平用GFAP ELISA 試劑盒檢測，具體操作嚴格按照試劑說明進行。

1.3.5 HIE 分級標準[10]：輕度：瞳孔輕微放大，擁抱反射活躍，興奮與抑制交替發生，肌張力升高或正常，腦電圖正常，但未發生中樞性呼吸衰竭；中度：嗜睡，肌張力減退，患兒的吮吸和擁抱反射能力減弱，腦電圖低電壓，發生中樞性呼吸衰竭。重度：瞳孔放大，昏迷，存在意識障礙，肌肉松軟，無吮吸及擁抱反射，腦電圖抑制，發生驚厥和中樞呼吸衰竭。將HIE 患兒分為輕、中度（輕中度組，n=49）和重度（重度組，n=23）。

1.3.6 新生兒行為神經測定（neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）評分：新生兒出生后在安靜溫暖房間內10 min 內完成NBNA 評分[11]，包括5 個部分，總分40 分，NBNA 評分＜35 分為異常。

1.4 統計學分析 采用軟件SPSS 21.0 對數據進行分析，計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗。計量資料符合正態分布的以平均值±標準差（±s）表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗。計量資料不符合正態分布的以中位數（四分位間距）[M（P25，P75）]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。應用二元Logistic 回歸分析影響HIE 患兒重度腦損傷發生的因素。采用Pearson 法分析血清miR-139-5p 與HDAC4 及二者與GFAP 的相關性，Spearman分析miR-139-5p，HDAC4 與NBNA 評分、出生后1 min 內Apgar 評分相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組血清miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、GFAP 水平比較 見表2。與對照組相比，研究組血清GFAP 水平、HDAC4 相對表達水平較高，miR-139-5p 相對表達水平、NBNA 評分較低，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 研究組和對照組血清miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、GFAP 水平比較（±s）

表2 研究組和對照組血清miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、GFAP 水平比較（±s）

項目研究組（n=72）對照組（n=75）tP miR-139-5p0.63±DAC42.05±評分（分） 33.20±0.141.01±0.2212.436 0.000 H0.391.02±0.2120.046 0.000 NBNA 1.4339.85±2.2321.424 0.000 GFAP（ng/L）1.30±0.370.50±0.1517.304 0.000

2.2 不同腦損傷程度HIE 患兒血清miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、GFAP 水平比較 見表3。與輕中度組相比，重度組血清GFAP 水平、HDAC4相對表達水平較高，miR-139-5p 相對表達水平、NBNA 評分較低，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表3 不同腦損傷程度患兒血清miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、GFAP 水平比較（±s）

表3 不同腦損傷程度患兒血清miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、GFAP 水平比較（±s）

項 目輕中度組（n=49）重度組（n=23）tP miR-139-5p0.74±0.160.38±0.109.900 0.000 HDAC 41.87±（分） 34.460.402.43±0.375.669 0.000 NBNA 評分±1.3830.52±1.5410.884 0.000 GFAP（ng/L）1.16±0.331.61±0.474.690 0.000

2.3 輕中度組和重度組HIE 患兒臨床特征比較見表4。重度組產程異常比例、羊水污染比例高于輕中度組，重度組出生后1 min 內Apgar 評分、出生后5 min 內Apgar 評分低于輕中度組，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表4 輕中度組和重度組HIE 患兒臨床特征比較[n（%），±s，M(P25,P75)]

表4 輕中度組和重度組HIE 患兒臨床特征比較[n（%），±s，M(P25,P75)]

類 別輕中度組（n=49）重度組（n=23） χ2/t/ZP男 性24（48.98）12（52.17）0.064 0.800胎齡（周）39.42±1.3238.90±1.161.649 0.104平均日齡（天）3.54±0.613.62±0.540.537 0.593出生時體重（kg）2.71±0.302.62±0.321.162 0.249出生后1 min 內Apgar 評分（分）5（3，6）3（2，4）2.985 0.003出生后5 min pgar 評分（分內A）8（7，9）6（5，7）5.415 0.000妊娠期高血壓6（12.24）4（17.39）0.050 0.823母體貧血3（6.12）2（8.70）0.009 0.923產程異常2（4.08）6（26.09）5.608 0.018胎盤異常1（2.04）1（4.35）0.046 0.831胎膜早破3（6.12）2（8.69）0.009 0.923羊水污染1（2.04）5（21.74）5.581 0.018母體高齡5（10.20）3（13.04）0.002 0.964產前發熱6（12.24）3（13.04）0.082 13.04自然分娩44（89.80）20（86.96）0.002 0.964

2.4 影響HIE 患兒重度腦損傷發生的多因素Logistic 回歸分析 見表5。以HIE 患兒是否發生重度腦損傷為因變量（是=1，否=0），以miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、GFAP，出生后1 min 內Apgar 評分、出生后5 min 內Apgar 評分（均原值代入）、產程異常（是=1，否=0）、羊水污染（是=1，否=0）為自變量進行Logistic 回歸分析，結果顯示，miR-139-5p 低表達、HDAC4 高表達、低NBNA 評分、低出生后1 min 內Apgar 評分是影響HIE 患兒重度腦損傷發生的危險因素（均P＜0.05）。

表5 影響HIE 患兒重度腦損傷發生的多因素Logistic 回歸分析

2.5 HIE 患兒血清miR-139-5p 與HDAC4 相關性分析 生物信息學網站（targetscan）顯示，miR-139-5p 與HDAC4 存在結合位點，見圖1。Pearson分析顯示，血清miR-139-5p 表達水平與HDAC4 呈負相關（r=-0.579，P＜0.05）。

圖1 miR-139-5p 與HDAC4 結合位點

2.6 HIE 患兒miR-139-5p，HDAC4 與GFAP，NBNA評分、出生后Apgar 評分相關性分析 Pearson 分析顯示，血清miR-139-5p 表達水平與GFAP 呈負相關（r=-0.416，P＜0.05），血清HDAC4 表達水平與GFAP 呈正相關（r=0.437，P＜0.05）。Spearman 分析顯示，血清miR-139-5p 表達水平與NBNA 評分、出生后1 min 內Apgar 評分、出生后5 min 內Apgar 評分呈正相關（r= 0.398，0.367，0.348，均P＜0.05）；血清HDAC4 表達水平與NBNA 評分、出生后1 min 內Apgar 評分、出生后5 min 內Apgar 評分呈負相關（r=-0.364，-0.345，-0.332，均P＜0.05）。

3 討論

缺氧缺血性腦?。℉IE）是圍生期窒息引起的中樞神經系統疾病，治療不及時易導致新生兒神經系統后遺癥[12]。新生兒HIE 是新生兒殘疾或死亡的原因之一，根據病情的嚴重程度，一般可分為輕度、中度和重度，輕度一般對新生兒的神經發育不會產生影響或產生輕微影響，而中度和重度則會導致新生兒神經功能發生永久性缺損甚至死亡[13]。新生兒HIE 發展為永久性腦損傷前存在一段黃金治療時間，此時間段內有效進行神經功能保護可阻止神經元的凋亡和壞死，避免神經系統永久性損傷[14]。因此探究新生兒HIE 腦損傷嚴重程度的相關因素，對改善HIE 預后有重要意義。

miRNAs 可通過調控mRNA 翻譯和穩定性來介導各種蛋白質的表達[15]。大量研究為miRNA在新生兒HIE 中的作用提供了越來越多的證據。ZHANG 等[16]研究顯示，脊髓損傷大鼠神經細胞中miR-139-5p 表達下調，過表達的miR-139-5p 可改善脊髓損傷大鼠的運動功能、減輕痛覺及神經細胞凋亡。組蛋白去乙?；?（HDAC4）的失調與神經發育和神經退行性疾病相關[17]，HDAC4 在神經元細胞中可差異表達，其在缺血再灌注大鼠海馬CA1 區表達升高[18]。LUO 等[19]在培養細胞中通過氧-葡萄糖剝奪/再給氧（OGD/R）模擬腦缺血再灌注損傷，發現HDAC4 抑制劑丙戊酸（VPA）可以保護神經元免受OGD/R 損傷，本研究發現，研究組血清miR-139-5p 相對表達水平低于對照組，重度組血清miR-139-5p 相對表達水平低于輕中度組，研究組血清HDAC4 相對表達水平高于對照組，重度組血清HDAC4 相對表達水平高于輕中度組，提示miR-139-5p，HDAC4 均與新生兒HIE 的發生及病情嚴重程度有關，二者均可能參與了新生兒HIE 發生及病情進展。

膠質纖維酸性蛋白（GFAP）在腦組織中主要維持星形膠質細胞的結構和功能，當中樞神經受損后，星形膠質細胞迅速活化并促進GFAP 迅速合成，且新生兒窒息后腦損傷重度組血清GFAP 水平明顯高于輕、中度組[8]。MA 等[20]研究證實，抑制HDAC4 可通過降低肌生成素MYOG 表達來緩解去神經誘導的肌肉萎縮，HDAC4 抑制劑可能是治療神經源性肌肉萎縮的潛在藥物，表明低表達HDAC4 可能緩解神經誘導的肌肉萎縮。本研究發現，研究組NBNA 評分低于對照組，重度組NBNA 評分低于輕、中度組，研究組血清GFAP 水平高于對照組，重度組血清GFAP 水平高于輕中度組，提示HIE 患兒隨著腦損傷程度加重，神經功能缺損嚴重。經查證發現，有文獻認為HDAC4 在腦組織損傷的修復中起到了積極作用，也有文獻認為HDAC4 促進了神經元的凋亡進程，相關研究值得進一步探討。本研究進一步分析顯示，HIE 患兒血清miR-139-5p，HDAC4 均與GFAP 水平具有相關性，提示miR-139-5p，HDAC4 可能影響HIE 患兒腦神經功能。且Logistic 回歸分析顯示，miR-139-5p，HDAC4，NBNA 評分、出生后1 min 內Apgar評分是HIE 患兒重度腦損傷發生的影響因素，說明以上因素均可能影響HIE 患兒重度腦損傷發生，此外，NBNA 評分可以反映早產兒腦發育狀況、規律及腦損傷后的發展趨勢，Apgar 評分可用于新生兒窒息狀況評估，與新生兒腦損傷有關[21]，而本研究中血清miR-139-5p，HDAC4 表達水平與NBNA評分、出生后1 min 內Apgar 評分、出生后5 min內Apgar 評分具有緊密相關性，提示miR-139-5p，HDAC4 均可能與HIE 患兒重度腦損傷有關。

miRNA 可以識別靶基因序列，調控靶基因表達，從而控制多種疾病的發生發展，如：ZHAO 等[22]研究顯示，miR-139-5p 在復發性癲癇樣放電大鼠神經細胞中表達下調，miR-139-5p 高表達可靶向負調控Notch 通路減輕復發性癲癇樣放電誘導的神經細胞的氧化應激和神經細胞凋亡；DUAN 等[23]模擬阿爾茨海默病發病機理中的神經損傷，發現miR-223-3p/HDAC4 軸與神經損傷有關，上調miR-223-3p，抑制HDAC4，可以改善神經損傷，抑制凋亡，誘導增殖，提高生存率。Target Scan Human 網站預測miR-139-5p 與HDAC4 存在靶向結合位點，以上均表明miR-139-5p 可通過調控靶基因表達參與疾病的發生，而本研究相關性結果同樣提示miR-139-5p 與HDAC4 間存在負相關關系，與網站預測結果相符，提示二者可能相互作用，共同影響HIE 患兒腦損傷的發生過程，關于其具體機制后續還需進一步研究。

綜上所述，HIE 患兒血清中miR-139-5p 表達降低，HDAC4 表達升高，miR-139-5p，HDAC4 與HIE 患兒腦損傷嚴重程度有關，推測miR-139-5p，HDAC4 共同參與HIE 的發生發展，有望作為診斷HIE 重度腦損傷重要指標。本研究局限性在于：首先，樣本量較小，可能導致部分結果有所偏倚，缺乏普適性；其次，有關miR-139-5p，HDAC4 參與HIE 發生發展的作用機制尚未明確。因而后期將擴大樣本量進一步驗證，同時結合基礎實驗、細化分組，進一步明確miR-139-5p，HDAC4 的具體調控機制，為后期HIE 病情診斷、治療提供有力的參考依據。