膿毒癥患者外周血細胞因子，PCT和NLR表達水平及與臨床預后價值研究

李 蕊，楊 柳，周 磊，劉家云(空軍軍醫大學第一附屬醫院，西安 710032)

膿毒癥(sepsis)作為臨床常見的危重癥，發病過程復雜多樣，涉及多種病理生理改變，包括免疫炎癥失調、代謝紊亂、循環衰竭等。2016年《美國醫學會雜志》發表了《膿毒癥與感染性休克定義的國際共識（第三版）》，將膿毒癥的定義從“感染基礎上的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)”調整為“機體對感染反應失調而導致危及生命的器官功能障礙”[1]。同時隨著“細胞因子風暴”概念的提出，人們越來越意識到機體的促炎/抑炎反應失衡在膿毒癥的發生發展中扮演著重要的角色。早期、準確、快速識別患者免疫狀態對改善患者預后具有重要意義，臨床已有多種生物標志物用于協助膿毒癥的診斷，其中包括中性粒細胞-淋巴細胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio，NLR)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和白細胞介素(interleukin，IL)-6 等，然而目前還沒有特異性的炎性標志物用來反映機體炎性失調狀態和預后預警。因此，本研究通過檢測膿毒癥患者急性期的IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-17，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α，干擾素(interferon，IFN)-γ，IFN-α，PCT 和NLR 的水平，探討其在膿毒癥早期診斷及預后中的作用，以期為臨床診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究收集2020年1月～2023年1月空軍軍醫大學第一附屬醫院收治的98 例年齡≥18 歲膿毒癥患者作為研究對象，依照《膿毒癥與感染性休克定義的國際共識(第三版)》[1]標準納入病例，其中男性52 例，女性46 例，平均年齡48.33±8.17 歲。膿毒癥患者均根據《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[2]接受治療，根據膿毒癥患者是否發生休克分為休克組(n=16)和非休克組(n=82)。以患者入院當天為研究起始點，根據患者28 天的生存情況，將其分為生存組(n=82)和死亡組(n=16)。另選取同期95 例非膿毒癥感染者作為對照，對照組患者均有感染但未達到膿毒癥診斷標準，其中男性48 例，女性47 例，平均年齡41.57±5.28 歲。兩組患者年齡和性別比較差異均無統計學意義(t=1.89，χ2=0.12，均P＞ 0.05)，具有可比性。排除標準：①惡性腫瘤者；②免疫系統疾病者；③血液系統疾病者；④近期使用刺激或抑制炎性介質釋放藥物者；⑤外傷或術后者。本研究獲醫院倫理委員會批準及患者知情同意。

1.2 儀器與試劑 流式細胞儀(美國碧迪公司，型號：BD CantoII)，血液分析儀(日本希森美康公司，型號：SYSMEX XN-3000)，熒光免疫分析儀(瑞士羅氏公司，型號：Cobas E 601)，12 項細胞因子檢測試劑盒(青島瑞斯凱爾生物科技有限公司，貨號：R7011002)。

1.3 方法 采集膿毒癥組和對照組患者入院24h 內靜脈血6ml，分裝為3 管。2 管注入EDTA 抗凝試管，其中一管3 000 r/min 離心10min，分離出上層血漿，利用流式細胞術對IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-17，IFN-α，IFN-γ 和TNF-α 的濃度進行多參數檢測和分析；另一管不離心，全自動血液分析儀檢測中性粒細胞和淋巴細胞數量，計算 NLR(NLR= 中性粒細胞絕對值/淋巴細胞絕對值)；第3 管采用ELISA 熒光免疫分析儀對PCT 水平進行測定。所有操作均嚴格按照儀器和配套試劑盒說明書由專業人員進行。

1.4 統計學分析 采用SPSS 軟件22.0 版進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示；不符合正態分布的計量資料以中位數(范圍)表示。比較細胞因子的血漿濃度，使用Mann-WhitneyU檢驗。診斷能力通過受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線獲得，曲線下面積(area under curve，AUC)＞0.5 且95%CI均大于0.5 為有預測意義，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥組與非膿毒癥感染組的炎性指標比較及預測效能分析 見表1。膿毒癥患者細胞因子檢測除IL-1β 和IFN-γ 外，其余細胞因子水平均高于非膿毒癥感染患者，差異具有統計學意義(均P＜0.05)。ROC 曲線進一步分析發現IL-2，IL4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-17，TNF-α，IFN-α 的AUC 分別是0.71(95%CI：0.63～0.78)，0.73(95%CI：0.65～ 0.80)，0.74(95%CI ：0.65～0.80)，0.78(95%CI：0.71～0.84)，0.63(95%CI：0.56～0.72)，0.68(95%CI：0.61～0.76)，0.86(95%CI：0.81～0.92)，0.67(95%CI：0.60～0.75)和0.67(95%CI：0.60～0.76)， 顯示這些細胞因子分別具有預測感染的能力。目前臨床常用的炎性指標白細胞計數(white blood count，WBC)，NLR，IL-6 和PCT 在膿毒癥組和非膿毒癥感染組之間差異也具有統計學意義(均P＜0.05)，AUC 分別為0.70(95%CI：0.63～0.77)，0.81(95%CI：0.75～0.87)，0.75(95%CI：0.68～0.82)和0.83(95%CI：0.78～0.88)，所有炎性檢測指標中IL-17，PCT，NLR 和IL-8 具有相對較高的預測價值，四者聯合檢測可以有效提高膿毒癥的診斷效能，見表2。

表1 膿毒癥組與非膿毒癥感染組的炎性指標比較[M(范圍)]

表2 IL-17，PCT，NLR，IL-8 及四者聯合檢測診斷效能分析

2.2 膿毒癥血培養陽性組與陰性組炎性指標比較見表3。在98 例膿毒癥患者中，血培養陽性患者30 例，陰性患者68 例，陽性率約為30.61%。兩組間炎性指標比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，提示這些炎性指標檢測不受血培養檢測結果影響。

2.3 膿毒癥休克組與非休克組炎性指標比較及預測效能分析 見表4。與非休克組比較，膿毒癥休克組IL-6 水平明顯升高，差異有統計學意義(P=0.01)。ROC 分析顯示其敏感度和特異度分別為75%和63%，AUC 為0.73(95%CI：0.59～0.87)。

表4 膿毒癥休克組與非休克組的炎性指標比較[M(范圍)]

2.4 膿毒癥死亡組與生存組患者炎性指標比較及預測效能分析 見表5。本研究納入膿毒癥患者98 例，其中死亡患者16 例，死亡率16.33%，比較兩組的炎性指標發現死亡組IL-5，IL-2 和IL-10 的水平高于生存組，差異具有統計學意義(均P＜0.05)。三者聯合檢測可以有效提高膿毒癥不良預后的預測效能，見表6。

表5 膿毒癥生存組與死亡組的炎性指標比較[M(范圍)]

表6 IL-5，IL-2，IL-10 及三者聯合檢測對不良預后預測效能分析

3 討論

膿毒癥是一種免疫反應失調的危重癥，嚴重影響全球人類生命健康。美國PIRO[易感性（predisposition），損傷（insult）、反應（response）、器官功能障礙（organ）]概念提倡使用更容易測量的生物學指標作為評估膿毒癥患者病情嚴重程度及預測死亡的附加手段[3]。膿毒癥時內毒素進入血液循環，刺激血管內皮系統，釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，TNF，IL 等多種炎性細胞因子。據報道，膿毒癥患者在不同階段機體免疫系統可處于抑制、激活、紊亂等不同的狀態[4]，炎癥早期檢測細胞因子對于膿毒癥有很高的臨床價值[5]。

病原體侵入人體引起機體特異性免疫過程，分化決定簇抗原4 陽性(cluster of differentiation 4，CD4+)T 淋巴細胞在其中扮演重要角色，CD4+T 淋巴細胞主要分為輔助 T 細胞(helper T cell，Th)1，Th2 兩個亞群。Th1 細胞也稱為炎癥性T 細胞，主要分泌IL-2，IFN-γ 和TNF-α，介導與細胞毒和局部炎癥相關的免疫應答；Th2 則以分泌IL-6 和IL-10 為主，主要參與體液免疫[6]。本研究中膿毒癥組與非膿毒癥感染組比，多種炎性指標的升高表明膿毒癥患者體內有高水平炎癥因子活化現象，存在明顯的免疫狀態紊亂。IL-6 是一種多效細胞因子，同時具有抗炎和促炎的雙向作用，是炎癥介質網絡中的關鍵因子。有研究[7]證實膿毒癥患者IL-6水平明顯高于非感染引起的全身炎癥反應綜合征（SIRS）患者，可用于兩者的鑒別。本研究結果顯示，IL-6 對膿毒癥診斷有一定的意義，但診斷價值不如IL-17，PCT，NLR 和IL-8。IL-17 作為Th17細胞的特征性細胞因子，具有很強的招募中性粒細胞的作用，可誘導產生炎癥因子和趨化因子，如IL-6，IL-8。IL-6 本身又是IL-17 細胞的分化因子，在此過程形成正反饋。在某些感染的急性期，Th17細胞的免疫反應可能對機體具有保護作用，若病原體不能被及時完全清除，那么IL-17 使感染進入慢性階段可能性增大[8]。IL-8 除由Th2 細胞產生外，最主要來源于單核-巨噬細胞，作為T 淋巴細胞和中性粒細胞的強效趨化因子，可以促進T 細胞的增殖和浸潤，也可以作用于中性粒細胞，引起氣道內中性粒細胞的聚集、活化，促進炎癥反應進程[9]。有研究表明在炎癥發展過程中，IL-8 的上調提示疾病惡化和更高的死亡傾向[10-11]。本次研究未發現IL-1β 和IFN-γ 在膿毒癥組和非膿毒癥感染組之間差異有統計學意義，可能是由于不同研究采用的膿毒癥診斷標準不一以及病原體感染在體內的免疫過程不同所導致。

盡管血培養是血流感染診斷的金標準，但其檢測結果受多種因素影響[12]。本研究發現膿毒癥患者細胞因子，PCT 和NLR 的水平與血培養檢測結果無明顯相關性，可以作為膿毒癥的獨立危險預警指標。有研究證實IL-6 和IL-10 可用于膿毒癥不同病原菌感染的早期鑒別[13]，有助于指導臨床血培養結果未出或者血培養陰性患者的抗生素選擇。

膿毒癥期間的免疫反應經過兩個不同的階段，由最初的高炎性反應轉向由于淋巴細胞損傷引發的嚴重免疫抑制[14]。膿毒癥進展時CD4+T 細胞會發生Th2 方向的漂移，這預示著疾病的惡化。本研究發現IL-2，IL-5 和IL-10 對于膿毒癥患者預后具有提示作用。IL-4 和IL-10 是機體關鍵的抗炎性細胞因子，有臨床試驗顯示IL-4 與膿毒癥的預后無明顯的相關性，限制了IL-4 的臨床應用。IL-10 是由Th2 細胞產生的強效抗炎細胞因子，可從源頭上抑制TNF-α，IL-6 等促炎因子的釋放，從而阻止膿毒癥病情持續惡化和遠處臟器損傷，但如果體內抗炎癥遞質過量釋放，導致機體抗炎反應增強，引起炎癥/抗炎癥遞質失衡，可導致患者免疫功能紊亂。有研究表明持續高表達的IL-10 使膿毒癥患者處于免疫抑制狀態[15]，與膿毒癥患者器官功能障礙密切相關[16]，提示IL-10 可能是其預后不佳的因素之一。IL-5 是調控嗜酸性粒細胞生物學功能的關鍵性細胞因子[17]，與膿毒癥的相關性研究并不多，有研究提示其可能是臨床預防膿毒癥相關心臟損傷的潛在靶點[18]。朱德勝等[19]人的研究表明膿毒癥患兒體內存在顯著高水平的IL-2，并且與治療時間以及心功能的損傷程度關系密切。綜上推測IL-2 和IL-5 可能參與了心臟衰竭的過程，進而導致患者的不良預后。值得一提的是本研究結果并未發現IL-6 與患者不良預后有明顯的相關性，但是卻發現其與膿毒癥休克的發生有關。王小軍等[20]人的研究結果指出相較于膿毒癥非休克組，休克組的IL-6 水平明顯升高，但IL-6 水平與序貫器官衰竭（SOFA）評分之間沒有相關性，與本文研究結果一致，推測不同的細胞因子在膿毒癥的不同階段發揮著不同的作用，具體的機制值得后續深入研究。

降鈣素原（PCT）是膿毒癥診斷的重要指標之一[21]，當發生細菌感染時機體內毒素和炎性因子可抑制PCT 的降解，致使其水平增高。膿毒癥過程中，中性粒細胞和淋巴細胞對于感染的反應迅速，中性粒細胞顯著增加，而各種抗炎細胞因子可誘導免疫抑制，進而導致大量淋巴細胞凋亡，NLR 綜合反應了這兩種炎性細胞的狀態，是反映機體全身性的炎癥及免疫狀態的有效指標[22-23]。

鑒于PCT 在非感染情況下(如嚴重創傷、某些自身免疫性疾病)其水平也會升高，而NLR 作為一個新型炎癥指標，目前尚缺乏公認的NLR 最佳閾值，所以在膿毒癥患者病情比較復雜時，可考慮細胞因子作為協助診斷的標志物。本次研究中也存在一定的局限性，首先，該研究是單中心研究，選擇偏倚的影響無法排除；其次，僅記錄了患者入院24h 內的指標濃度，動態檢測指標的變化可能更有意義；最后，本研究僅根據28 天生存情況劃分生存組及死亡組，未對患者進行動態隨訪，無法獲得具體生存期限，需要在后續研究中進一步補充納入時間變量的回歸分析結果。