內源性因素對抗體夾心免疫法檢測血清心肌肌鈣蛋白I的干擾及解決方案研究進展

何成山，劉 洋，徐 正，蔣秀娣，陸志成(.上海中醫藥大學附屬第七人民醫院醫學檢驗科，上海 0037；.上海中醫藥大學，上海 003）

心肌肌鈣蛋白復合物由三個亞基組成，分別為心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和心肌肌鈣蛋白C（cardiac troponin C，cTnC），三種亞基通過非共價作用力結合在一起，在心肌細胞收縮過程中扮演重要角色[1]。cTnI 只在心肌細胞中表達，cTnI 單體形式半衰期短，以cTnI-cTnT-cTnC 結合物的形式存在。當心肌細胞受損時，cTnI 釋放至外周血液循環中主要以cTnI-cTnC 的形式存在，游離的cTnI 濃度極低[2]。cTnI 檢測的發展歷程隨著抗體夾心免疫技術的飛速發展，從最初的酶聯免疫吸附定性實驗，逐步達到cTnI 定量檢測，到如今超敏cTnI 已全面覆蓋臨床實驗室，cTnI 檢測水平達到ng/ml，成為診斷心肌損傷的首選血清學標志物[3]。過去cTnI 的免疫檢測經常受到溶血、黃疸、脂血、抗凝劑等分析前干擾因素的影響，隨著免疫檢測技術敏感度、特異度和準確度的不斷提高，其干擾作用已微乎其微。近年來一些內源性因素即免疫性的自身抗體如心肌肌鈣蛋白I 自身抗體（cardiac troponin I autoantibody，cTnIAAb）、異嗜性抗體（heterophile antibody，HA）、類風濕因子（rheumatoid factor，RF）等對cTnI 檢測帶來的嚴重干擾作用常見報道，本文就內源性因素對抗體夾心免疫檢測血清cTnI 的干擾及解決方案研究進展作一綜述。

1 抗體夾心免疫法檢測cTnI

血清cTnI 定量檢測方法較多，不同方法之間的檢測性能可能存在較大差異，常見的cTnI 檢測方法有酶聯免疫吸附法、化學發光法、酶聯熒光分析法、膠體金免疫層析法、免疫比濁法、飛行質譜和生物傳感器法[4]。目前臨床上超敏cTnI 多采用的是基于化學發光的抗體夾心免疫檢測法，血清樣本中cTnI 與cTnI 捕獲抗體包被的介質混合，使得cTnI-捕獲抗體結合并吸附在固相載體上，孵育沖洗后，將添加化學發光基團標記的cTnI-檢測抗體加入至cTnI-cTnI 捕獲抗體的固相載體上（檢測抗體與捕獲抗體應具有不同的cTnI 抗原結合位點），再次孵育沖洗后形成cTnI 捕獲抗體-cTnI-cTnI 檢測抗體的結合物，測量發光基團產生的化學發光反應，通過標準曲線計算cTnI 濃度?；诳贵w夾心免疫法檢測cTnI 的原理，檢測和捕獲抗體需要與cTnI 多肽鏈不同區段的抗原位點結合，因此cTnI與cTnI 抗體的結合位點的親和性顯得尤為重要，此外兩個特異性抗體的匹配度對于cTnI 檢測的準確度也會產生較大的影響，如何針對cTnI 選擇親和度強且不同結合位點的配對cTnI 單克隆抗體，為抗體免疫夾心法檢測cTnI 的核心內容。海肽作為業界深耕cTnI 檢測抗體領域的公司，科學家們經過長期對cTnI 單克隆抗體的研究，針對夾心發光免疫檢測系統，提供了一些優化的不同抗體位點的配對結果見表1。這些配對的單克隆抗體本底低、靈敏度強、特異度和準確度好，目前已被大部分cTnI 檢測廠商所認可。

表1 cTnI 抗體夾心免疫檢測系統推薦配對抗體

由于人體血液中cTnI 的異質性以及不同試劑廠商所使用的抗體的特異性抗原表位不一致，導致了不同cTnI 檢測試劑之間檢測結果存在較大差異。周伶俐等[5]對臨床實驗室應用不同檢測系統檢測血清cTnI 結果一致性進行研究，結果顯示四種常用的cTnI 檢測系統（邁瑞CL-200i，萬孚FS-205，Genein 1600，UniCel DxI 800）結果一致性較差，同一檢測系統不同實驗室檢測結果間也存在一定的差異。在第一代cTnI 檢測試劑中，不同試劑之間結果的差異可超過1 000 倍，近年來在國際各組織、臨床檢驗工作者、科學家、試劑生產商的共同努力下，檢測結果的一致性已經得到了顯著改善，然而cTnI 檢測的標準化至今仍未實現?；趪H臨床化學和檢驗醫學聯合會公布的現階段使用的國際知名cTnI 檢測系統所使用的抗體特異性抗原表位見表2[6]?？梢姴煌瑥S商的抗原識別位點存在部分差異，大部分特異性抗體的抗原表位主要集中在靠近中心穩定區域的氨基端a.a.r 20～30 及穩定區域a.a.r 31～50 和80～90。

表2 臨床上常用cTnI 檢測系統捕獲/檢測抗體抗原表位

2 cTnI 檢測的內源性干擾因素

2.1 cTnIAAb 1996年BONHER 等[7]首次發現了一種可與cTnI 結合的IgG，后續的研究證實了該IgG 為cTnI 檢測結果異常的主要負性干擾因素，并首次提出了心肌肌鈣蛋白I 自身抗體cTnIAAb（cardiac troponin I autoantibody）[8]。 心肌損傷后cTnI 釋放到外周循環中，血液中的cTnI 可作為始動抗原促進機體的自身免疫系統產生特異性cTnIAAb[9]。cTnIAAb 廣泛存在于缺血性心肌病[10-11]、擴張性心肌病[12]等疾病中，可直接參與心肌損傷后心室重構的過程，誘導心肌細胞發生凋亡現象[13]。單體cTnI 氨基酸兩端極易發生蛋白水解，其分子a.a.r 30～110 因受到內源性TnC 的保護為中心穩定區域[14]。目前大多數商業化cTnI 檢測試劑盒中的特異性抗體均針對中心穩定區域設計抗原表位，在后續的臨床檢驗工作中我們發現cTnI 免疫學檢測依然會受到多種干擾，其中最主要的就是cTnIAAb[15]。吳豫等[16]采用五種臨床常用的cTnI檢測系統（Access-2，Architect i2000，Axsym，Dimension X Pand，Vidas），評估cTnIAAb 對cTnI檢測的影響，結果顯示cTnIAAb 對常用 cTnI 檢測系統均出現一定程度的負性干擾，但不同檢測系統之間干擾程度亦有差距；我們在前期研究[17]中將純化的人源性cTnIAAb 加入一例cTnI 檢測濃度為6.02ng/ml 血清樣本，結果顯示隨著cTnIAAb 蛋白量加入量增多，cTnI 回收濃度逐漸降低，cTnI 下降率顯著提升，當加入cTnIAAb 量達20μl 時，cTnI下降率高達62.06%。cTnIAAb 可與cTnI 檢測試劑中的特異性抗體競爭結合cTnI 多肽鏈的中心穩定區域，導致特異性檢測抗體無法捕捉多肽鏈上的抗原表位，造成cTnI 檢測結果的假性降低，產生心肌損傷類疾病的臨床診斷風險，以上研究均證實了cTnIAAb 對cTnI 檢測的負性干擾是真實存在的。而對于不同cTnI 檢測系統對同一份cTnIAAb 陽性樣本產生了cTnI 檢測結果不一致的現象，這是由于不同cTnI 檢測系統中檢測抗體和捕獲抗體的靶標抗原位點存在差異，基于表2 中主流cTnI 檢測系統的單克隆抗體結合位點，不難看出盡管大部分抗體位點位于中心穩定區域，但依舊存在較大差異，這就造成了不同cTnI 檢測試劑的異質性。

cTnIAAb 作為一個人源性的自身抗體，相較于商業化重組制備的單克隆檢測抗體，cTnIAAb 與cTnI 結合位點必然不會在cTnI 肽鏈的某一個固定區段，那么cTnIAAb 與cTnI 結合具體抗原位點究竟集中在cTnI 多肽鏈的哪些部位？后續的研究也是給出了答案。SAVUKOSKI 等[18]采用已知抗原位點的單克隆cTnI 抗體與cTnIAAb 競爭結合血清中cTnI，計算cTnI 回收率，評估cTnIAAb 與cTnI結合位點。結果顯示加入a.a.r 65～74，83～93，86～90，104～119，117～126 和130～145單克隆cTnI 抗體位點，cTnI 平均回收率均小于50%，這些片段主要位于cTnI 肽鏈的中心穩定區域并向羧基端延伸，其中受自身抗體嚴重影響的中心穩定區域與大部分商業化cTnI 試劑盒的抗體結合位點相似，這也證實了大部分cTnI 抗原位點都無法擺脫cTnIAAb 干擾的原因。對于后續研發新型cTnI 檢測試劑而言，我們的特異性抗體應有3 個及以上的抗原表位，以此來規避cTnIAAb 的負性干擾現象。

2.2 HA 異嗜性抗體（heterophile antiody,HA）是人類外周循環中的內源性抗體，其本質是一種多重、多特異性的免疫球蛋白，可與多個物種的免疫球蛋白發生弱結合的非特異性反應，因而該抗體可以干擾免疫測定[19]。HA 在人群中的發生率約為0.1%～3%，與接觸家養和野生動物、輸血、自身免疫性疾病、血液透析等相關[20]。HA 中典型的有人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA）、人抗兔抗體、人抗羊抗體等，其中接受過小鼠單克隆抗體制劑診療的患者，其血液樣本中可能含有高濃度的HAMA[21-22]。對于臨床免疫學檢測而言，影響最大的莫過于HAMA，因為大多數免疫學檢測的診斷試劑均采用鼠單抗。cTnI 的免疫學檢測中，HAMA 若替代待檢抗原與檢測抗體和捕獲抗體相結合，會出現cTnI 檢測結果假性升高；HAMA 若分別于檢測抗體和捕獲抗體相結合，則會出現cTnI 檢測結果假性降低，而臨床檢驗工作中HAMA 主要造成cTnI 檢測結果假陽性[23]。GRA?A SANTOS 等[19]人報道了一例57 歲患者，主訴胸骨疼痛放射至左上肢，cTnI 水平穩定升高，在經過心電圖和冠狀動脈造影后并未發現梗阻和缺血性病變，后續出院后，再次因相同主訴入院，cTnI 水平達26.81ng/ml，經檢查依舊未見心肌梗死的臨床表征，推測該患者血液循環中存在干擾cTnI免疫檢測的HA。NGUYEN 等[24]人也報道了一例有趣的cTnI 假性升高的臨床案例，患者cTnI 水平升高，其心電圖及急性心肌梗死（aucte myocardial infarction，AMI）血清學標志物均未發現異常，其血清樣本更換Advia Centaur TnI-Ultra 檢測系統進行cTnI 檢測，結果顯示陰性，研究人員將血清樣本稀釋兩倍，cTnI 檢測水平并未按比例下降，反而增加，推測這可能是HA 強干擾的表現。在大部分HA 干擾檢測的血清中加入異嗜性抗體阻斷劑后，cTnI 檢測結果均可下降達80%以上，此外研究發現在HA 高度陽性的血清中，患者血紅蛋白水平與cTnI 的濃度存在相關性，可作為HA 血清濃度的替代標記物[25]。目前各大cTnI 檢測試劑廠商解決HA效應影響最有效的辦法就是嵌合抗體或者完全人源化抗體，商業化檢測抗體都采用嵌合抗體即將動物源抗體的恒定區替換為人源抗體，通過嵌合抗體可有效封閉大部分動物源性抗體造成的檢測干擾。

2.3 RF 類風濕因子（radio frequenoy，RF）常存在于類風濕性關節炎、自身免疫性疾病、慢性炎癥患者的血清及關節滑膜腔液中。RF 干擾免疫學檢測的現象常見報道，其本質為一種變性的IgG 為靶抗原的自身抗體，該抗體能非特異性結合免疫球蛋白即檢測抗體和酶標捕獲抗體的Fc 段，容易造成抗體夾心免疫法檢測cTnI 假陽性的現象[26]。陳超超等[27]人對10 例cTnI 檢測結果異常升高與臨床心肌損傷癥狀不符樣本進行分析，發現10 例患者均具類風濕關節炎病史且RF 呈高滴度陽性，對樣本進行稀釋復測，cTnI 檢測結果未成線性下降趨勢，而加入RF 滅活劑2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-Me）后，cTnI 轉變為陰性，研究結果證實了RF可造成cTnI 檢測結果的假陽性。

3 內源性干擾因素的鑒別診斷及解決方案

cTnIAAb，HA 和RF 等內源性因素可嚴重影響cTnI 檢測結果的準確性，如何鑒別這種內源性的干擾，對檢驗和臨床醫生都提出了較大的挑戰。當日常檢驗工作中出現cTnI 檢測結果與其他心肌損傷血清標志物：肌紅蛋白、肌酸激酶及肌酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶等檢測結果嚴重不符時，我們應當警惕是存在內源性自身抗體干擾cTnI 檢測現象的存在，并向臨床醫生詢問病人的臨床表征和心臟影像學檢查是否與cTnI 檢測結果一致，共同探討分析造成cTnI 檢測結果異常的原因。當懷疑cTnI 檢測過程中存在內源性自身抗體干擾現象時，可以采用以下方法進行鑒別：①不同cTnI 檢測系統的檢測抗體和捕獲抗體抗原識別位點不同，自身抗體可以干擾一種或幾種cTnI 檢測系統，但不一定會干擾所有的cTnI 檢測系統，我們可以采用不同的cTnI 檢測試劑進行復檢；②對于內源性自身抗體造成的cTnI 假陽性檢測樣本我們采用陰性血清樣本進行倍比稀釋，當樣本未受到自身抗體干擾時，cTnI 檢測結果應呈線性下降，若稀釋后檢測結果無良好的線性關系，則表明可能受到HA和RF 的干擾；③對干擾檢測的內源性自身抗體進行預處理：對于cTnIAAb 可以通過蛋白G 瓊脂糖凝膠4FF 過濾，抗體純化樹脂可有效結合多種IgG種類和亞類，消除人源性IgG cTnIAAb 的負性干擾[14]；HA 加入異嗜性抗體阻斷劑-1，該型具有特異性鼠免疫球蛋白[28]，因大部分cTnI 特異性檢測抗體均為鼠源性單克隆抗體，所以具有較好的阻斷特效；RF 可加入2-Me 直接破壞IgG 和IgM 的二硫鍵達到消除RF 的影響[28]；④直接檢測樣本中的內源性自身抗體：cTnIAAb 目前尚無商業化的檢測試劑盒，大多數文獻的報道均采用酶聯免疫吸附試驗的檢測方法[29]和cTnI 相關抗原的回收實驗[2]，在我們的前期研究中新建立了一種基于蛋白芯片的化學發光免疫分析法，可機器化操作定量檢測cTnIAAb[30]，異嗜性抗體目前有HAMA檢測試劑盒，可直接檢測抗小鼠HAMA 抗體，RF 和抗核抗體譜大多數實驗室可直接定量檢測。

4 總結與展望

綜上所述，基于臨床上常用的cTnI 抗體夾心免疫檢測原理，cTnI 與不同cTnI 抗原表位單克隆抗體的親和度及夾心抗體的適配度，對于cTnI 檢測的靈敏度和特異度至關重要。目前臨床上常用的cTnI 檢測系統中cTnI 捕獲和檢測抗體的抗原識別位點不一致，造成了cTnI 檢測結果的一致性仍然存在一定的差異。在cTnI 臨床檢測中，內源性的自身抗體可嚴重干擾cTnI 檢測結果，影響臨床上對心肌損傷類疾病的診斷、治療及預后。其中cTnIAAb 可造成cTnI 檢測結果假陰性，HA 和RF則會導致cTnI 檢測結果假陽性，在臨床檢驗工作中出現心肌損傷類標志物檢測結果不一致時，首先檢查室內質控及儀器運行狀態，復檢確認檢驗結果無誤后，檢驗醫生應及時與臨床醫生溝通了解病人的臨床表征及超聲影像學檢查結果，共同分析探討造成cTnI 檢測結果異常的原因，以免貽誤病情的診斷和治療。