大約克公豬精液質量與糞便菌群的相關性分析

鎖云鵬,李曉彤,李延森,沈丹,李春梅

(南京農業大學動物科技學院家畜環境控制與智慧生產研究中心,江蘇 南京 210095)

目前對于養豬產業來說,公豬精液質量的好壞直接影響豬群的繁殖效率和生產安全[1]。環境內分泌干擾物[2]、日糧結構或外界不良環境等因素極易造成公豬的精子損傷,影響精液質量,導致繁殖性能下降,給養豬業造成嚴重的經濟損失[3]。因此,探究改善公豬精液品質的有效方法對于養豬生產具有重要意義。研究表明,老齡小鼠補充益生菌后其生精小管萎縮和睪丸間質細胞面積減少的癥狀得到減緩[4]。將通過褐藻寡糖調控的腸道菌群移植到糖尿病的小鼠體內后,糖尿病小鼠的精子質量得到了提升[5]。這些研究結果提示,腸道菌群可能對雄性的精子質量具有一定的調節作用。

很多研究已經證明腸道菌群與機體健康密切相關[6-7],在多糖消化,維生素和營養物質合成以及免疫功能調節等多方面發揮著關鍵作用[8]。特別是近年來,腸-腦軸[6,9]、腸-肝軸[10-11]以及腸-腎軸[12]等概念的提出,也證明了腸道微生物對宿主代謝和生理功能的影響不僅僅局限于腸道[13]。也有研究者提出腸-睪丸軸,提示腸道微生物可能參與雄性生殖功能的調控作用[14-15]。眾所周知,睪丸分泌的睪酮在維持雄性第二特征、促進性腺發育、精子生成與成熟過程中發揮著積極作用[16-17]。有研究報道,環境內分泌干擾物不僅可引起小鼠睪酮濃度和精液質量的下降,而且腸道菌群多樣性和豐度也發生了改變,這表明腸道菌群與類固醇激素的合成及精子生成具有一定關系[18-19]。Li等[20]和Liu等[21]研究闡明了腸道微生物菌群不僅調控雄性激素的合成和代謝,甚至能夠以其他形式穿過血睪屏障來調控精子發生。Ding等[22]通過建立小鼠高脂飲食模型,誘導小鼠腸道菌群失調后發現血液中內毒素含量升高,附睪組織炎癥因子水平上升,精子受損[23]。對不同精液利用率公豬的腸道菌群組成分析中也發現,低精液利用率公豬的血液內毒素含量明顯偏高[1]。Tremellen等[24]也提出,腸道革蘭氏陰性菌產生的內毒素是豬強效免疫刺激物,可以引發全身慢性炎癥(代謝性內毒素血癥),損害睪丸功能和性腺功能。在菌群移植試驗中,異常精子的表型可以通過糞菌移植傳遞給正常人群,而來自正常人群的糞菌移植又可緩解其他因素引起的精子損傷[25-26]。上述研究均表明,腸道菌群與精液質量關系緊密。

為了進一步闡明腸道菌群與精液質量間的關系,本試驗通過檢測不同精液質量的公豬糞便睪酮和內毒素含量,以及糞便的菌群組成,并進一步分析糞便菌群結構是否與精液質量、睪酮和內毒素存在相關性,為其作用機制研究及通過調控腸道菌群來提高公豬的精液質量提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于2021年7月下旬在江蘇淮陰某種豬場開展。根據文獻報道[27]和試驗公豬站要求,精子活力評分在0.8以上為高質量精液,精子活力評分低于0.6為低質量精液。本試驗以圈舍內全部公豬試驗前3個月的精液質量參數為參考,挑選出33頭日齡(479.33±2.85)和體況相近的大約克公豬,分為低精液質量(LSQ)組12頭,高精液質量(HSQ)組21頭。LSQ組和HSQ組公豬精液質量參數詳見表1。試驗公豬自由飲水,定時定量采食(每日09：30和16：30各飼喂1.25 kg日糧)?；A日糧組成及營養組成見表2。

表1 試驗前3個月內公豬精子質量指標Table 1 Boar sperm quality indicators within 3 months before the

表2 本試驗基礎日糧組成及營養組成(風干基礎)Table 2 The basic diet composition and nutritional composition of this experiment(as-dry basis) %

每日07：00—09：00收集試驗公豬新鮮糞便,連續收集5次。糞便盡量不要接觸地面,防止地面或尿液對糞便造成污染,倘若接觸地面使用一次性手套將其外面一層剝離。每次收集糞便樣品約50 g并放入自封袋中,于-20 ℃保存備用。

1.2 飼養管理

豬舍及種公豬按常規程序進行清潔、免疫、消毒和喂料,每次飼喂結束后舍內關燈保證豬只躺臥休息。圈舍采用正壓通風和單欄單豬飼養模式。風機和濕簾根據溫度梯度分為15個等級管理,當夏季溫度達22.5 ℃時部分風機自動開啟,當溫度達到23 ℃時開啟部分濕簾。試驗期間公豬舍內溫度為(26.3±1.8)℃。

1.3 精液質量分析

使用計算機輔助精子分析(computer-assisted sperm analysis,CASA)和特定分析軟件Magavision、Magapor、Zaragoza和Spain檢測精液質量,測定指標包括精液量、精子活力、精子畸形率和精子密度?？偩訑岛陀行Ь訑蹈鶕嬎愎剑嚎偩訑?精液量×精子密度;有效精子數=精液量×精子密度×精子活力[28]。

1.4 糞便睪酮和內毒素含量檢測

混合糞便樣本后檢測糞便睪酮和內毒素含量,HSQ組每3個樣本混合,LSQ組每2個樣本混合。

1.4.1 糞便睪酮的抽提與測定睪酮提取參照殷亞杰[29]的方法并加以改良：取0.75 g樣品置于10 mL離心管中,加入5 mL 濃度為90%的甲醇溶液,振蕩1 min,置于60 ℃水浴鍋中20 min,2 000 r·min-1離心10 min,取上清液,于-20 ℃保存備用。使用翼飛雪生物科技公司的豬總睪酮ELISA試劑盒進行睪酮水平測定,具體操作步驟根據說明書進行。

1.4.2 糞便內毒素的抽提與測定糞便中內毒素提取方法在Clark等[30]和梅靈[31]的基礎上稍作改進：糞便樣本加入無菌PBS溶液,含量為10 g·mL-1,并輕微混懸,1 200g離心10 min,再通過0.2 μm濾膜過濾,濾液于-20 ℃保存備用。使用廈門鱟試劑生物科技公司的內毒素檢測試劑盒(試管定量顯色基質法)測定內毒素含量,詳細操作步驟參照說明書。檢測所用耗材均為無內毒素來源。

1.5 16S rRNA基因測序

將糞便樣本混合,HSQ組每3個樣本混合,共得到7個混合樣本;LSQ組每2個樣本混合,共得到6個混合樣本。根據基因測序步驟,對所有糞便樣品提取總基因組DNA并檢測其純度、濃度和完整性,擴增16S rRNA的V3-V4高變區,引物對為338F(5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)/806R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)。在55 ℃的退火溫度下進行27個循環。經預試驗得出樣品結果代碼為A,表明PCR產物目的條帶大小正確、濃度合適,可進行后續試驗。在預試驗完成后進行PCR正式試驗。PCR儀：ABI GeneAmp?9700型。PCR產物用于文庫的構建,在上海美吉生物技術有限公司的基因測序平臺上進行高通量測序與分析。所有測序數據均提交到NCBI數據庫,登錄號為PRJNA851983。

1.6 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 糞便睪酮與內毒素含量分析

基于單因素方差分析,從結果(圖1)中可以看出：HSQ組的糞便睪酮水平顯著高于LSQ組(P<0.01),HSQ組的糞便內毒素水平略低于LSQ組,但無顯著差異(P=0.13)。

圖1 不同精液質量公豬的糞便睪酮(A)和內毒素(B)水平Fig.1 Fecal testosterone(A)and endotoxin(B)levels of boars of different semen qualities**P<0.01

2.2 糞便菌群的α和β多樣性分析

采用16S rRNA基因測序技術,分析不同精液質量公豬糞便菌群的組成。所有糞便樣本共獲得464 373個有效序列片段。按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類,Venn(維恩)圖顯示LSQ組和HSQ組共獲得1 211個OTU,其中兩組共有1 069個OUT,LSQ組和HSQ組分別鑒定出53個和89個特有OTU。糞便菌群α多樣性分析結果表明,HSQ組的物種豐富度(Sobs、Ace、Chao指數)和多樣性(Shannon指數)均高于LSQ組,但兩組之間差異不顯著(P>0.05)。β多樣性方面,主成分分析結果表明,兩組之間糞便菌群有一定的差異性,但存在部分重疊,PC1軸和PC2軸對結果的解釋度分別為39.35%和17.44%?；赪eighted-unifrac距離計算的非度量多維排列(NMDS)分析顯示,距離差值Stress<0.1表明分組具有一定意義,但兩組間無顯著性差異(圖2)。

圖2 不同精液質量的公豬糞便菌群的α和β多樣性分析Fig.2 Analysis of α and β diversity in boar feces of different semen quality A.物種Venn圖分析;B.物種多樣性與豐富度指數,Sobs指數代表物種豐富度實際觀測值,Ace指數代表物種豐富度,Chao指數代表物種豐富度,Shannon指數代表物種多樣性;C.兩組間主成分分析(PCA);D.基于Weighted-unifrac距離的非度量多維排列(NMDS)分析(Stress=0.095)。A.Species Venn diagram analysis;B. Species diversity and richness index,the sobs index represents actual observations of species richness,the ace index represents species richness,the chao index represents species richness and the shannon index represents species diversity;C. PCA analysis between the two groups;D. Non-metric multidimensional scaling(NMDS)analysis based on weighted-unifrac distance calculation(Stress=0.095).

2.3 糞便菌群組成和差異分析

基于16S rRNA測序數據分析,比較HSQ組和LSQ組之間糞便菌群的差異。結果如圖3所示：在門水平,兩組公豬糞便菌群都是以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、螺旋菌門(Spirochaetota)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteriota)為主;在科水平上,以大于1%含量為標準,兩組公豬糞便菌群都檢測出18個相同優勢菌群科,以Oscillospiraceae(顫螺旋菌科)、Lachnospiraceae(毛螺菌科)、Peptostreptococcaceae(消化鏈球菌科)、Streptococcaceae(鏈球菌科)、Clostridiaceae(梭菌科)、Christensenellaceae(克里斯滕森菌科)、Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)、Spirochaetaceae(螺旋體科)和Lactobacillaceae(乳酸桿菌科)等豐度最高。對HSQ組和LSQ組的糞便差異菌群分析,在科水平,HSQ組的Eubacterium_coprostanoligenes_group(產糞甾醇真桿菌科)豐度顯著低于LSQ組(P<0.05),HSQ組Atopobiaceae(阿波托菌科)和Akkermansiaceae(阿克曼菌科)豐度顯著高于LSQ組(P<0.05);在屬水平,HSQ組g_norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group和Faecalibaculum(糞桿菌屬)的豐度顯著低于LSQ組(P<0.05),然而在g_norank_f_Atopobiaceae、Akkermansia(阿克曼菌屬)和Clostridium_sensu_stricto_6的豐度上HSQ組顯著高于LSQ組(P<0.05)。在LEfSe多級物種分析結果中,同樣可以看出Eubacterium_coprostanoligenes_group在LSQ組中顯著富集,Atopobiaceae和Akkermansiaceae在HSQ組中顯著富集。

圖3 不同精液質量的公豬糞便菌群物種差異分析Fig.3 Analysis of fecal flora species differences in boars of different semen quality A. HSQ組和LSQ組在門水平上的物種組成;B. HSQ組和LSQ組在科水平上的物種組成(含量>1%);C. HSQ組和LSQ組在科和屬水平上的差異分析,采用Wilcoxon和檢驗方法來檢驗顯著性差異;D. HSQ組和LSQ組區分顯著作用的微生物類群的判別分析,LDA評分通過LEfSe計算(P<0.05,LDA>2)。 *P<0.05。A. Species composition of groups HSQ and LSQ at phylum level;B. Species composition of groups HSQ and LSQ at family level,content>1%;C. Differences between groups HSQ and LSQ at family level or at genus level,Wilcoxon data sum test was used to test significant differences;D. Discriminant analysis of microbial taxa with significant roles distinguished between the HSQ group and the LSQ group,and the LDA score was calculated by LEfSe(P<0.05,LDA>2). *P<0.05.

2.4 糞便差異菌群豐度與精液質量的相關性分析

采用Pearson相關性分析方法分析差異菌群與精液質量的關系,由于屬水平上菌屬未被定義,因此后續在科水平分析。從圖4可以看出：試驗公豬糞便差異菌群豐度與精液質量、糞便睪酮水平之間存在較強的相關性。Eubacterium_coprostanoligenes_group豐度與精子活力(r=-0.45,P<0.01)、精子密度(r=-0.48,P<0.01)呈顯著的負相關關系,與睪酮水平存在負相關關系,但并不顯著(r=-0.48,P=0.11)。Atopobiaceae豐度與精子活力(r=0.42,P<0.05)、精子密度(r=0.38,P<0.05)和睪酮水平(r=0.57,P<0.05)之間有顯著的正相關關系。Akkermansiaceae豐度與精子活力(r=0.46,P<0.01)、精子密度(r=0.43,P<0.05)有顯著的正相關關系,與睪酮水平存在弱正相關關系(r=0.50,P=0.09)。因此推測Eubacterium_coprostanoligenes_group、Atopobiaceae和Akkermansiaceae可能對精液質量起著關鍵作用。

圖4 糞便差異菌群豐度與精液質量、糞便睪酮水平的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of fecal differential microbiota abundance with semen quality and fecal testosterone level A. Eubacterium_coprostanoligenes_group豐度與精子活力、精子密度、睪酮水平之間關聯的散點圖;B. Atopobiaceae豐度與精子活力、精子密度、睪酮水平之間關聯的散點圖;C. Akkermansiaceae豐度與精子活力、精子密度、睪酮水平之間關聯的散點圖。A.Scatter plot of the association between Eubacterium_coprostanoligenes_group abundance and sperm motility,sperm density,testosterone level;B. Scatter plot of the association between Atopobiaceae abundance and sperm motility,sperm density,testosterone level;C.Scatter plot of the association between Akkermansiaceae abundance and sperm motility,sperm density,testosterone level.

3 討論

睪酮由睪丸間質細胞產生,在精子生成過程中發揮著積極作用[32]。本試驗發現高精液質量公豬的糞便睪酮濃度顯著偏高,這也表明了睪酮對精子生成和精液質量上升具有促進作用。已有研究指出,睪酮的產生受機體內毒素含量的影響,在大鼠腹腔注射內毒素試驗中發現,睪酮生成被內毒素直接抑制[33],造成上述結果的原因可能是由于內毒素通過血液循環作用于睪丸,導致睪丸組織受損[34-35]。本試驗中高、低精液質量公豬的糞便內毒素含量無明顯差異,推測這可能是糞便作為機體的一種排毒方式,其含有大量細菌脫落裂解物質,內毒素含量較高導致的結果。

研究表明,移植褐藻寡糖調控的腸道菌群到高脂飲食的小鼠體內,可以緩解高脂飲食對小鼠精液質量造成的損傷[36]。據報道,腸道菌群可以從營養調控、免疫激活、信號傳導和胰島素抵抗等多個方面影響雄性的精液質量[37-39]。在對犬補充復合乳酸桿菌后,其精子漸進運動性和頂體完整性顯著增強[40]。上述研究結果均提示,腸道菌群與精液質量聯系密切。因此,本試驗利用16S rRNA基因測序,在菌群α和β多樣性分析中發現,高、低精液質量公豬的糞便菌群雖然沒有體現出明顯的差異,但有一定的分離趨勢,表明不同精液質量的公豬糞便菌群組成和豐度存在一定程度上的差異。厚壁菌門與擬桿菌門的豐度在公豬糞便菌群中占據優勢地位,這與先前對豬腸道菌群分布比例的研究結果是一致的[41]。在不同精液質量公豬的糞便差異菌群中發現,Eubacterium_coprostanoligenes_group在低精液質量的公豬糞便菌群中顯著富集,并且Eubacterium_coprostanoligenes_group與公豬精子活力、精子密度和睪酮之間存在負相關關系。據報道,Eubacterium_coprostanoligenes_group具有將膽固醇轉化為糞甾醇的功能,進而影響宿主的脂肪代謝[42-43]。膽固醇已被證明參與動物機體許多重要的生理過程,對睪酮合成也有明顯的促進作用[44]。He等[45]發現,在熱應激環境下,仔豬血清膽固醇水平增加,且Eubacterium_coprostanoligenes_group含量也伴隨著上升。因此推測,低精液質量組Eubacterium_coprostanoligenes_group豐度上升可能與試驗在夏季高溫環境下進行有關。本試驗在高精液質量公豬的糞便菌群中發現Atopobiaceae和Akkermansiaceae菌群顯著富集,且Atopobiaceae與公豬的精子活力、密度和睪酮存在顯著的正相關關系。有研究報道,在食物厭氧發酵試驗中,Atopobiaceae與短鏈脂肪酸的產生呈正相關[46],并且對小鼠補充代謝產物為丁酸的丁酸梭菌,其血清中睪酮水平顯著提高[47]。Chang等[48]在高脂日糧誘導的糖尿病小鼠模型中發現,抑制C-C趨化因子配體(CCL)4表達后產生的有益作用,可能是腸道微生物菌群發生變化(尤其是Atopobiaceae家族豐度增加)改善了糖尿病小鼠的葡萄糖代謝和脂代謝。先前研究表明,成熟精子表面有葡萄糖轉運蛋白,其功能為轉運葡萄糖進入精子內部,給精子提供能量[49],并且在患有糖尿病的雄性小鼠模型中,發現小鼠的生殖功能也受到一定影響(睪丸受損,精液質量下降)[5,50]。另外,本試驗顯示,與Atopobiaceae類似,Akkermansiacea與公豬的精子活力、精子密度和睪酮水平也存在正相關關系。Akkermansiaceae作為一種黏蛋白降解細菌,具有益生菌特性,在肥胖癥、糖尿病、炎癥、代謝紊亂等疾病中參與免疫反應[51],并且發現其豐度與小鼠的肥胖和相關代謝紊亂成反比[52],而肥胖對雄性精液質量具有負面影響[53]。更有研究表明,Akkermansiaceae菌群的增加可能有助于改善腸道通透性和減少內毒素釋放,緩解全身炎癥,維持機體代謝穩態[54]。以上結果提示,Eubacterium_coprostanoligenes_group、Atopobiaceae和Akkermansiaceae三種菌群可能通過調控機體的代謝來影響公豬的精液質量,然而三者對精液質量的具體調控機制尚不明確,需要進一步探究。

綜上,本研究發現不同精液質量公豬的糞便睪酮水平和糞便菌群組成、豐度存在差異,并且糞便菌群與精液質量和睪酮水平之間存在不同程度的相關關系。研究結果為闡明腸道菌群對公豬精液質量的影響提供了新的理論基礎,為改善公豬精液質量提供了新的思路。