衣康酸二甲酯對H2O2誘導的AML-12細胞線粒體功能障礙的調節作用及機制研究

閆巍元,張銳,馬海田

(南京農業大學動物醫學院/農業農村部動物生理生化重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)

線粒體是機體產生ATP并維持細胞正常生理活動的主要場所,其功能異常會導致多種代謝性疾病的發生。已有研究發現,線粒體功能障礙與肥胖、胰島素抵抗和脂肪肝病等多種營養代謝性疾病密切相關[1-2]?；钚匝?ROS)主要由線粒體產生,且線粒體是其主要的攻擊靶點,其可通過破壞線粒體的結構進而導致線粒體功能障礙[3]。線粒體功能障礙主要體現為ATP合成減少,呼吸鏈功能減弱,抗氧化能力下降[4]。AMP-依賴性蛋白激酶(AMPK)是一種參與多種代謝調控的關鍵蛋白,其在調節線粒體生物學功能、脂質代謝、氧化應激及炎癥等方面起著至關重要的作用[5]。有研究表明,AMPK下游關鍵蛋白NAD-依賴性去乙?；?(SIRT1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)參與調節線粒體功能[6]。營養性代謝疾病與線粒體功能障礙聯系緊密,因而通過活化AMPK緩解線粒體功能障礙可作為預防相關營養代謝性疾病的有效手段。

衣康酸是線粒體三羧酸循環的次生代謝物,其由三羧酸循環直接產物檸檬酸鹽脫水生成順烏頭酸,再通過免疫應答基因1催化脫羧而生成[7]。衣康酸含有共軛雙鍵和2個羧基的高極性α、β-不飽和二羧酸,不易穿過細胞膜;因此,衣康酸的衍生物如衣康酸4-辛酯(4-OI)或衣康酸二甲酯(DMI)通常被用于其分子機制研究[8]。已有研究表明,衣康酸在抗氧化與免疫調節中發揮重要的作用[9-10]。衣康酸可將Keap1上的半胱氨酸殘基烷基化,進而促進Nrf2入核,激活下游抗氧化因子的轉錄表達而發揮其抗氧化功能[11]。然而,目前對DMI的研究主要涉及其對機體抗氧化能力的調節方面,對其緩解線粒體功能障礙的效應及機制方面的研究報道較少。因此,本試驗以H2O2誘導的小鼠肝細胞系(AML-12細胞)為研究對象,旨在探究DMI對線粒體功能障礙的緩解效應,并圍繞AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路揭示其作用機制,為其作為一種生理調節劑用于防控畜禽因線粒體功能障礙引發的相關疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：超凈工作臺、倒置熒光顯微鏡(美國Thermo Fisher公司);全波長酶標儀、Western blot電泳及轉印系統、曝光儀(美國BIO-RAD公司);實時熒光定量PCR儀(美國Agilent Technologies公司);核酸濃度測定儀、高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

主要試劑：DMI購于美國Sigma公司;AML-12細胞購置于南京宏昇生物科技有限公司;胎牛血清購于美國Gibco公司;DME/F-12培養基購于美國Hyclone公司;BCA試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑購于上海碧云天生物科技有限公司;AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子1(Nrf1)、線粒體轉錄因子A(TFAM)和Tubulin β抗體購于美國Abcam公司;HRP-二抗購于武漢博士德生物工程有限公司。ATP含量測定試劑盒以及DNA提取試劑盒購于索萊寶科技有限公司;Compound C(AMPK抑制劑)購于美國Selleck公司;線粒體活性氧檢測試劑盒以及線粒體膜電位試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司;所有引物均使用Premier 5軟件設計,并由賽默飛生物科技有限公司負責合成。

1.2 細胞培養

取液氮中凍存的AML-12細胞置于37 ℃水浴鍋中迅速融化,1 000 r·min-1離心5 min后棄上清液,加入含有10%胎牛血清的DME/F-12培養基,吹散懸浮后轉移至10 cm培養皿,于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中進行培養,然后制成細胞密度為1×105mL-1的細胞懸浮液,用于后續試驗。

1.3 細胞活力檢測

將100 μL AML-12細胞懸浮液接種于96孔細胞培養板并孵育24 h,分別用0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、0.75和1 mmol·L-1DMI處理4 h后,每孔加入20 μL MTT試劑(5 mg·mL-1)繼續孵育4 h后棄上清液,再向每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)并低速振蕩10 min,使藍紫色結晶物充分溶解,酶標儀測定吸光值(D490)。

1.4 H2O2致細胞損傷模型的建立

將100 μL AML-12細胞懸浮液接種于96孔細胞培養板并孵育24 h,分別用0、25、50、100、150、200、300、400和500 μmol·L-1H2O2處理4 h,然后向每孔加入20 μL MTT試劑(5 mg·mL-1),繼續孵育4 h后棄上清液,向每孔加入150 μL DMSO并低速振蕩10 min,使藍紫色結晶物充分溶解,酶標儀測定吸光值(D490)。

1.5 線粒體活性氧水平檢測

將2 mL AML-12細胞懸浮液接種于6孔細胞培養板并孵育24 h后,分別加入0或0.5 mmol·L-1DMI培養4 h后,再加入0或150 μmol·L-1H2O2繼續培養4 h。根據線粒體活性氧檢測試劑盒說明書配制MitoSOX Red稀釋液,再將其與處理后的細胞樣品混勻,配制成5 μmol·L-1的稀釋液,置于37 ℃細胞培養箱孵育20 min,吸去稀釋液,PBS清洗3次,用倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝mROS堆積情況。

1.6 線粒體膜電位(mROS)變化情況

將2 mL AML-12細胞懸浮液接種于6孔細胞培養板并孵育24 h,分別加入0或0.5 mmol·L-1DMI并培養4 h,再加入0或150 μmol·L-1H2O2繼續培養4 h。根據線粒體膜電位試劑盒說明書配制JC-1(線粒體膜電位熒光探針)染色工作液與JC-1緩沖液,細胞加入適量JC-1染色工作液置于37 ℃細胞培養箱避光孵育20 min,棄去上清液后用JC-1緩沖液洗滌2次,用倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝線粒體膜電位(MMP)狀態。

1.7 ATP含量測定

將2 mL AML-12細胞懸浮液接種于6孔細胞培養板并孵育24 h,分別加入0或0.5 mmol·L-1DMI培養4 h,再加入0或150 μmol·L-1的H2O2繼續培養4 h,收集細胞,按照試劑盒說明書檢測ATP含量。

1.8 mtDNA拷貝數分析

將2 mL AML-12細胞懸浮液接種于6孔細胞培養板并孵育24 h,分別加入0或0.5 mmol·L-1DMI并培養4 h,再加入0或150 μmol·L-1H2O2繼續培養4 h,收集細胞,利用DNA提取試劑盒提取細胞中的DNA,使用RT-qPCR測量mtDNA拷貝數。線粒體DNA特定引物對序列為5′-AGGTTGTCTCCTGTGACT-TCAA-3′,5′-CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG-3′。采用2-ΔΔCT法分析目的基因相對表達量。

1.9 AMPK通路關鍵因子蛋白表達水平分析

1.9.1 蛋白樣本的制備將2 mL AML-12細胞懸浮液接種于6孔細胞培養板并孵育24 h,分別加入0或0.5 mmol·L-1的DMI并培養4 h,加入0或150 μmol·L-1的H2O2并繼續培養4 h。棄上清液,PBS清洗細胞后加入蛋白提取液(RIPA和蛋白酶抑制劑體積比為100)并于冰上靜置15 min以充分裂解,12 000 r·min-1離心10 min后取上清液,BCA法檢測蛋白濃度并將各組蛋白樣本校準至同一濃度,隨后將蛋白樣本與SDS-PAGE 上樣緩沖液混勻,100 ℃條件下煮沸10 min,冷卻后置-20 ℃保存備用。

1.9.2 蛋白表達水平的相對定量分析配制不連續的SDS-PAGE膠(上層為50 g·L-1濃縮膠,下層為100 g·L-1分離膠),將蛋白樣本加入SDS-PAGE膠中進行電泳。電泳過程中,電壓設置為80 V,電泳30 min后調整電壓為110 V,待溴酚藍遷移至分離膠底部時停止電泳。將分離膠中的蛋白轉印PVDF膜,(100 V電壓下轉膜90 min)。轉印結束后,參考蛋白標準分子質量裁剪目的條帶,置于50 g·L-1脫脂奶粉中常溫封閉2 h。封閉結束后,使用TBST清洗PVDF膜5次,分別加入p-AMPK、AMPK、SIRT1、PGC-1α、Nrf1、TFAM或Tubulin β一抗稀釋液,4 ℃條件下搖床孵育過夜?；厥找豢?TBST清洗PVDF膜5次(每次10 min),隨后加入TBST稀釋的相應二抗,室溫中孵育2 h。棄二抗,TBST清洗5次,每次10 min。加入ECL發光液,在凝膠成像分析系統中曝光并拍照,以Tubulin β作為內參,使用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.10 AMPK在衣康酸二甲酯(DMI)緩解H2O2誘導的線粒體功能紊亂中的作用

1.10.1 AMPK及線粒體功能相關蛋白表達水平分析AML-12細胞使用10 μmol·L-1AMPK抑制劑Compound C預處理1 h。Compound C使用劑量參照文獻[12]。預處理結束,AML-12細胞分別加入0或0.5 mmol·L-1DMI繼續培養4 h,加入0或150 μmol·L-1H2O2,孵化4 h,收集細胞后提取總蛋白,采用Western blot法檢測p-AMPK、AMPK、SIRT1、PGC1α或Nrf1蛋白的表達水平。具體檢測方法同1.9.2節。

1.10.2 mtDNA拷貝數分析使用10 μmol·L-1AMPK抑制劑Compound C預處理AML-12細胞1 h,分別加入0或0.5 mmol·L-1的DMI培養4 h,加入0或150 μmol·L-1H2O2繼續培養4 h,然后分析mtDNA拷貝數。檢測方法同1.8節。

1.11 數據分析

利用SPSS 17.0軟件對數據先進行單因素方差分析,再進行差異顯著性檢驗;利用Graph Pad Prism 5.0軟件繪圖。統計結果均以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 衣康酸二甲酯(DMI)及H2O2對AML-12細胞活力的影響

與對照組相比,0.031 25～0.5 mmol·L-1DMI和0～150 μmol·L-1H2O2處理對AML-12細胞活力均無顯著影響(P>0.05),但0.75～1 mmol·L-1DMI和200～500 μmol·L-1H2O2處理則顯著降低了AML-12的細胞活力(P<0.05)(圖1)。結果提示,0～0.5 mmol·L-1DMI和0～150 μmol·L-1H2O2處理對AML-12細胞無毒副作用。因此,本試驗后續選擇0.5 mmol·L-1DMI和150 μmol·L-1H2O2作為最終處理濃度。

圖1 衣康酸二甲酯(DMI,A)及H2O2(B)對AML-12細胞活力的影響Fig.1 Effect of dimethyl itaconate(DMI,A)or H2O2(B)on AML-12 cells viability *、**表示與對照(NC)組相比差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。下同。*,**indicate significant difference(P<0.05)and extremely significant difference(P<0.01)compared with the control(NC)group. The same below.

2.2 衣康酸二甲酯(DMI)對AML-12細胞mROS水平及線粒體膜電位的影響

結果如圖2所示,紅色熒光強度代表細胞中mROS堆積水平(圖2-A);線粒體單體染色呈綠色熒光,越強代表線粒體膜電位水平越低;紅色代表線粒體聚集體,越強代表線粒體膜電位水平越高(圖2-B)。根據熒光強度的結果,與H2O2處理組相比,DMI處理顯著抑制H2O2誘導的AML-12細胞中mROS水平的升高(圖2-A)以及線粒體膜電位的異常降低(圖2-B)。結果提示,DMI處理可抑制H2O2誘導的AML-12細胞中mROS的過度產生以及線粒體膜電位的降低。

圖2 DMI對H2O2誘導的AML-12細胞線粒體活性氧(mROS)(A)及線粒體膜電位(B)的調節作用(×200)Fig.2 Regulation of mROS(A)and mitochondrial membrane potential(B)in H2O2-induced AML-12 cells by DMI+、-分別表示添加、不添加此物質處理。圖4、圖5同此。+ and - indicate the addition and non-addition of this substance,respectively. Fig.4,Fig.5 are the same.

2.3 衣康酸二甲酯(DMI)對AML-12細胞ATP含量及mtDNA拷貝數的影響

由圖3-A可見,與H2O2處理組相比,DMI處理顯著緩解了H2O2誘導的AML-12細胞中ATP水平的下降(P<0.01)。同時,DMI處理可顯著逆轉H2O2誘導導致的mtDNA拷貝數的降低(圖3-B)(P<0.01)。結果提示,DMI處理可抑制H2O2誘導的AML-12細胞中ATP合成的減少并保護線粒體的正常功能。

圖3 DMI對AML-12細胞ATP含量(A)和mtDNA拷貝數(B)的影響Fig.3 Effects of DMI on ATP content(A)and mtDNA copy number(B)in AML-12 cells ++表示與H2O2組相比差異極顯著(P<0.01)。下同。++indicate extremely significant difference(P<0.01)compared with the H2O2 group. The same below.

2.4 衣康酸二甲酯(DMI)通過激活AMPK-SIRT1信號通路緩解線粒體功能障礙

如圖4所示,與NC組相比,H2O2處理顯著降低AML-12細胞中p-AMPK、SIRT1、PGC1α、Nrf1和TFAM蛋白表達量(P<0.01)。與H2O2處理組相比,DMI處理則可顯著升高H2O2誘導的AML-12細胞中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、Nrf1和TFAM蛋白的表達量(P<0.01)。結果提示,DMI處理可激活H2O2誘導的AML-12肝細胞中AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路。

圖4 DMI對AML-12細胞AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路關鍵蛋白表達量的影響Fig.4 Effect of DMI on the expression level of key proteins in AMPK-SIRT1-PGC1α signaling pathway in AML-12 cells A. 蛋白免疫印跡條帶 Protein Western blot;B-F. AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路關鍵蛋白表達量Expression levels of key proteins in AMPK-SIRT1-PGC1α signaling pathway.

由圖5可知：DMI處理可顯著提高H2O2誘導的AML-12肝細胞中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、和Nrf1蛋白表達量,而AMPK抑制劑Compound C(CC)預處理則可明顯消除DMI對p-AMPK、SIRT1、PGC1α和Nrf1蛋白表達的上調作用(P<0.01)。此外,Compound C預處理同樣可明顯消除DMI對H2O2誘導的AML-12細胞mtDNA拷貝數的上調(圖5-F)(P<0.01)。結果提示,DMI通過激活AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路可緩解H2O2誘導的AML-12細胞線粒體功能障礙。

圖5 DMI通過激活AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路緩解H2O2誘導的線粒體功能紊亂Fig.5 DMI alleviates H2O2-induced mitochondrial dysfunction by activating the AMPK-SIRT1-PGC1α signaling pathway A. 蛋白免疫印跡條帶 Protein Western blot;B—E. AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路關鍵蛋白表達水平 Expression levels of key proteins in AMPK-SIRT1-PGC1α signaling pathway;F. mtDNA拷貝數 mtDNA copy number.

3 討論

作為營養物質代謝和聯系的中心樞紐,線粒體是機體脂肪酸β-氧化、三羧酸循環及氧化磷酸化的主要場所[13];因而,維持線粒體正常的生理功能是保障機體代謝穩態的關鍵[14]。衣康酸作為三羧酸循環途徑中產生的重要次生代謝產物,具有抗氧化、抗炎、抵抗病原體感染等多種生物學作用。作為衣康酸的功能類似物,DMI被發現在抗炎、免疫機能、氧化應激等方面同樣具有廣泛的調節作用[15],但關于DMI對線粒體功能障礙引發的相關代謝性疾病的調節效應及機制的研究仍然較少。

本研究發現,DMI可明顯增強H2O2誘導的AML-12細胞中ATP水平以及mtDNA拷貝數。線粒體是機體產生ATP的主要場所,而mtDNA的轉錄翻譯與線粒體生物合成密切相關,其可編碼一系列線粒體呼吸的相關蛋白,包括氧化磷酸化的核心亞基[16];mtDNA突變將引起氧化磷酸化功能障礙而導致ATP合成減少,進一步影響線粒體生物學功能[17-18]。因此,線粒體DNA拷貝數降低和ATP合成能力減弱是線粒體功能障礙的主要表現[19]。此外,本研究發現DMI處理可明顯抑制H2O2誘導的AML-12細胞mROS的過度產生。已有研究表明,位于線粒體基質中的mtDNA往往容易受到ROS的攻擊而造成損傷[20]。以上結果提示,DMI緩解H2O2誘導的肝細胞線粒體功能障礙與其抑制活性氧的過度產生密切相關。同時,本研究發現DMI顯著緩解H2O2刺激導致的AML-12細胞線粒體膜電位水平的降低。Zandalinas等[21]的研究表明,較高水平的MMP可促進ATP合成。以上結果證明DMI可通過抑制線粒體膜電位的降低以及活性氧過度產生而緩解肝細胞線粒體功能障礙。

本研究發現,H2O2處理可明顯降低AML-12細胞中p-AMPK蛋白水平,而DMI處理則可明顯增強H2O2誘導的AML-12細胞中p-AMPK蛋白水平。AMPK是調節線粒體生物發生的關鍵效應因子,其對線粒體功能的調控多是通過激活下游相關轉錄因子實現的[22]。通過對AMPK下游分子檢測,我們發現DMI處理顯著上調了H2O2誘導的AML-12肝細胞中SIRT1、PGC-1α和Nrf1蛋白表達,提示DMI可激活AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路。Cantó等[23]研究表明,在成肌細胞(C2C12)肌管中,AMPK通過調節NAD+代謝和SIRT1活性來下調PGC-1α的乙?；?從而控制機體的能量消耗。作為一種轉錄共激活因子[24],PGC-1α主要通過上調Nrf1和TFAM的表達水平來刺激線粒體生物發生,從而促進mtDNA的復制與轉錄,改善線粒體功能[25-26]。因此,AMPK-SIRT1-PGC-1α信號通路在維持線粒體功能中發揮著至關重要的作用。為了進一步驗證AMPK是否在DMI預防AML-12細胞線粒體功能障礙中起關鍵作用,我們使用AMPK抑制劑Compound C預處理細胞。結果發現,Compound C預處理逆轉了DMI對SIRT1、PGC-1α和Nrf1蛋白表達的上調作用;尤為重要的是,本研究發現Compound C預處理同樣明顯消除了DMI對H2O2誘導的AML-12細胞mtDNA拷貝數的上調。以上結果證明DMI通過激活AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路來調節mtDNA的轉錄,進而緩解由H2O2誘導的肝細胞線粒體功能障礙。

綜上所述,本研究證實了DMI通過激活AMPK-SIRT1-PGC1α信號通路緩解肝細胞線粒體功能障礙,研究結果為DMI作為一種生理調節劑用于預防畜禽線粒體功能障礙引發的相關營養代謝性疾病提供一定的理論依據及應用基礎。