內生真菌對雷公藤組培苗生長、生理及藥用成分含量的影響

吳 慧, 胡清霞, 宋 萍, 林照授, 封 磊, 吳承禎, 洪 偉,1c

(1. 福建農林大學: a. 林學院, b. 菌草與生態學院, c. 森林生態系統過程與經營福建省高校重點實驗室, d. 資源與環境學院, 福建 福州 350002; 2. 福建省大田桃源國有林場, 福建 三明 366031; 3. 武夷學院, 福建 武夷山 354300)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)為多年生木質藤本植物,是中國傳統藥用植物。從雷公藤植株中提取的雷公藤紅素和雷公藤甲素是當前研究較多的藥用活性成分,具有較高的臨床應用價值,其中,雷公藤紅素可用于治療肥胖、慢性炎癥和免疫性疾病[1-3];雷公藤甲素是一種高活性環氧化二萜內酯化合物,具有抗腫瘤、抗炎和免疫抑制等作用[4]。然而,這2種藥用活性成分在雷公藤植株體內含量極低[5],加上雷公藤野生資源蘊藏量少,人工培育期長,限制了雷公藤及其藥用活性成分在醫藥上的應用和發展。因此,采取有效措施改善雷公藤生長及促進雷公藤藥用活性成分積累具有重要意義。

植物內生真菌是指生活史的部分或全部階段在宿主植物內部,并且不會引起宿主植物明顯病癥或造成明顯傷害的一類真菌。內生真菌能夠促進植物生長。例如:Obledo等[6]從笹之雪(Agavevictoriae-reginaeT. Moore)體內分離出的非致病真菌能夠促進笹之雪葉片和根部生長,提高其葉綠素含量,增強其光合能力;Mucciarelli等[7]認為,辣薄荷(Mentha×piperitaLinn.)內生真菌能夠促進宿主植物生長發育,使植株高度和葉片大小明顯提高。內生真菌能利用自身的代謝產物促進植物生長,增加植物產量。例如:印度梨形孢(Piriformosporaindica)可以分泌吲哚乙酸(IAA)等生長素改善植物生長[8];內生真菌Sebacinavermifera能增強漸狹葉煙草(NicotianaattenuataTorr. ex S. Watson)的生長活力,抑制漸狹葉煙草體內乙烯的產生[9]。內生真菌還能夠增強植株對逆境的抗性。例如:印度梨形孢能提高作物的抗病性和耐鹽性[10];Boutelouaeriopoda(Torr.) Torr.和四翼濱藜〔Atriplexcanescens(Pursh) Nutt.〕的內生真菌通過向根表面分泌多糖類黏液物質并形成穩定的菌膜,與植物協同抗旱[11];Paraphaeosphaeriaquadriseptata能分泌一種抑制植物熱激蛋白HSP90活力的活性物質,從而增強植物的耐熱能力[12];禾本科(Poaceae)植物與Epichlo?屬內生真菌的共生體具有更強的生態適應性及競爭力[13];內生真菌能夠改變干旱條件下水稻(OryzasativaLinn.)自身激素的積累,減弱因為缺水導致的光合作用中色素的分解和損失,從而加強水稻在干旱環境中的抵抗力[14]。內生真菌可以通過分泌抗生素、生態位競爭、重寄生作用及誘導植物抗性等提高植物的抗病能力[15]。如球孢白僵菌(Beauveriabassiana)分泌的白僵菌黃色素、白僵菌素、類白僵菌素和白僵內酯等代謝產物會對農林植物的病蟲產生毒害作用[16]。植物內生真菌與宿主植物協同進化,其不僅能夠產生與宿主植物相同或相似的生物活性物質,還能夠調節植物體內某些生物活性物質的合成和積累。例如:內生真菌E4(Fusariiumsp.)和E5(Fusariiumsp.)不僅能提高大戟(EuphorbiapekinensisRupr.)單株根的鮮質量和折干率,而且能促進大戟中萜類活性物質異大戟素和大戟醇的積累[17];Ye等[18]發現,內生真菌Ilyonectrialiriodendra可促進蕺菜(HouttuyniacordataThunb.)根莖生長以及多數酚類物質和揮發物的積累,Penicilliumcitrinum可增加植株鮮質量、總葉面積和高度,促進根莖生長。由此可見,內生真菌在植物生長發育、脅迫抗性、病原體防御以及次生代謝產物積累中發揮著重要作用。然而,雷公藤內生真菌對宿主植物生長及藥用成分積累的作用尚不明確。

針對雷公藤生長緩慢、藥用活性成分含量低的問題,本研究在分析雷公藤內生真菌促生潛力的基礎上,將內生真菌與雷公藤組培苗共培養,研究內生真菌對宿主植物生長、光合作用及營養元素吸收的影響,探究內生真菌對宿主植物積累雷公藤紅素和雷公藤甲素的作用,以期為改善雷公藤生長及提高藥用活性成分含量提供研究依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為種植于福建農林大學森林生態系統過程與經營福建省高校重點實驗室田間試驗基地(東經119°14′08.65″、北緯26°05′06.55″)的人工栽培的3年生雷公藤植株,參照宋萍等[19]的方法,從雷公藤根、莖和葉片分離內生真菌。經與雷公藤組培苗共培養測試,將其中可與組培苗共生的11株菌株作為供試菌株,分別為菌株NS1、NS4、NS6、NS7、NS13、NS14、NS18、NS25、NS31、NS32和NS33。各菌株保藏于作者所在實驗室。

1.2 方法

1.2.1 菌株促生潛力測定 參考Amprayn等[20]的方法測定菌株培養液中吲哚乙酸分泌量。每種菌株3次重復,每重復測定1次。

采用CAS比色法[21]測定菌株鐵載體相對產量(SP),計算公式為SP=(1-A/Ar)×100%,式中,A為供試液波長630 nm處的吸光度,Ar為參比值,即空白檢測液的吸光度。根據文獻[22],當SP值分別在80%

將供試菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板培養基活化培養,取活化的菌落接種于改進的Pikovskaya無機磷培養基〔含10.0 g·L-1葡萄糖、0.5 g·L-1(NH4)2SO4、0.3 g·L-1NaCl、0.3 g·L-1KCl、0.3 g·L-1MgSO4·7H2O、0.03 g·L-1FeSO4·7H2O、0.03 g·L-1MnSO4·4H2O、5.0 g·L-1Ca3(PO4)2和20.0 g·L-1瓊脂,pH 7.0至pH 7.5〕中,以添加相同大小的無菌PDA培養基作為空白對照。每個處理3次重復,每重復測定1次。搖床震蕩培養7 d后于4 ℃、8 000g離心10 min,采用鉬銻抗比色法[23]測定上清液中的磷含量,上清液中的磷含量減去空白對照中的磷含量即為菌株的溶磷量。

1.2.2 內生真菌與組培苗共生體系建立 將內生真菌接種于PDA平板培養基上活化培養。在活化的菌落邊緣用打孔器取直徑5 mm的菌塊,選取株高和葉片數等長勢相近的雷公藤第3代無菌組培苗〔種植于添加質量濃度1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.1 mg·L-1萘乙酸(NAA)和0.1 mg·L-1激動素(KT)的MS培養基,pH 5.8至pH 6.0〕,將菌塊置于距組培苗根部2 cm處對峙培養,對照(CK)放置同樣大小的PDA培養基。每個處理10瓶,每瓶1株組培苗。置于溫度25 ℃、光照時間10 h·d-1、光照強度40 mol·m-2·s-1的光照培養箱中培養30 d,待測。

1.2.3 生長指標測量 隨機取待測組培苗3株,測定組培苗植株的單株鮮質量、單株干質量、株高(莖基部至株頂的距離)、最長根長、單株葉片數。其中,株高和最長根長使用直尺(精度1 mm)測量;用超純水洗掉組培苗根部粘附的培養基,表面水分用濾紙吸干,使用千分之一電子天秤稱量單株鮮質量,然后在60 ℃烘箱中烘至恒質量,稱量單株干質量。每個植株的各指標均測量1次。

1.2.4 葉綠素含量和葉綠素熒光參數測定 每株稱取新鮮的雷公藤組培苗中部葉片0.2 g,每個處理重復3次,分別加入丙酮-乙醇(體積比1∶1)混合浸提液,定容至25 mL。待葉片變白后,以混合浸提液作為空白對照,使用UV-2000紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)分別測定波長663和645 nm處的吸光度A663和A645[24]。葉綠素含量的計算公式為葉綠素含量=(20.3A645+8.04A663)V/(1 000m),式中,V為浸提液體積,m為葉片鮮質量。

選擇組培苗中部3枚充分伸展的葉片,暗適應30 min后使用OS-5P便攜式脈沖調制葉綠素熒光儀(美國OPTI-Sciences公司)測定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)和PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)。

1.2.5 C、N、P和K含量的測定 將雷公藤組培苗整株在60 ℃烘箱中烘至恒質量,粉碎后過孔徑0.22 mm篩。稱取0.400 0 g,加入30 mL濃硝酸-濃高氯酸(體積比5∶1)混合液消煮。使用EA3000元素分析儀(意大利Euro Vector公司)測定C和N含量;采用鉬銻抗比色法[23]測定P含量;使用FP-640型火焰光度計(上海精密科學儀器公司)測定K含量。重復測定3次。

1.2.6 雷公藤紅素和雷公藤甲素含量的測定 參考文獻[1],使用L-2000高效液相色譜儀(日本日立公司)測定雷公藤組培苗根、莖和葉片中的雷公藤紅素和雷公藤甲素含量。重復測定3次。

1.2.7 菌種的分子鑒定 通過26SrDNA D1/D2區序列分析對所選菌株進行分子鑒定。首先,將少量活化菌體加入到50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR細胞裂解液(Code No. 9164)(日本TaKaRa公司)中,80 ℃變性15 min,于4 ℃、10 000g離心10 min分離出DNA。取1 μL上清液作為PCR反應模板,使用真菌鑒定試劑盒TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No. RR178)擴增目的片段。采用上述真菌鑒定試劑盒提供的測序引物,正向引物序列為5′-CGCCAGGGTTTT CCCAGTCACGAC-3′,反向引物序列為5′-GAGCGG ATAACAATTTCACACAGG-3′。PCR擴增體系總體積50.0 μL,包括1.0 μL DNA模板、25.0 μL PCR Premix、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物和23.0 μL dH2O。PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性0.5 min、55 ℃退火0.5 min、72 ℃延伸1 min,共30個循環;最后72 ℃延伸5 min。利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0試劑盒(Code No. 9762)(日本TaKaRa公司)對目的片段切膠回收,交由寶生物工程(大連)有限公司測序。將測序結果提交至NCBI數據庫,獲取GenBank登錄號,通過BLASTn進行同源序列比對,采用鄰接法構建系統發育樹。

1.3 數據處理

利用EXCEL 2010軟件統計數據;利用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan’s test進行多重比較。

2 結果和分析

2.1 雷公藤內生真菌的促生潛力

雷公藤不同內生真菌菌株促生指標的比較結果見表1。由表1可以看出:雷公藤11株內生真菌菌株中,菌株NS32的吲哚乙酸分泌量最大,吲哚乙酸分泌量為33.10 mg·L-1,顯著(P<0.05)高于其他菌株;菌株NS6、NS7和NS14的吲哚乙酸分泌量也較高,分別為17.24、30.76和21.78 mg·L-1,顯著高于剩余7株菌株(吲哚乙酸分泌量小于6.00 mg·L-1)。產鐵載體能力很高〔80%<鐵載體相對產量(SP)≤100%〕的菌株為NS1、NS4、NS6、NS25和NS33,顯著高于其他菌株;產鐵載體能力較高(60%

表1 雷公藤不同內生真菌菌株促生指標的比較

2.2 內生真菌對雷公藤組培苗生長和生理的影響

2.2.1 對生長指標的影響 不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗生長指標的影響見表2。由表2可以看出:菌株NS33、NS32和NS1處理的雷公藤組培苗的單株鮮質量和干質量均顯著(P<0.05)高于對照(CK),其中,菌株NS33的促進作用最大,組培苗的單株鮮質量和干質量分別較對照增加了71.9%和76.4%。菌株NS6處理的組培苗單株鮮質量和菌株NS31處理的組培苗單株干質量也顯著高于對照。菌株NS4、NS7、NS13和NS14處理的組培苗單株鮮質量以及菌株NS4、NS7、NS13和NS25處理的組培苗單株干質量較對照顯著降低。菌株NS4、NS6、NS18、NS25、NS32和NS33處理的組培苗株高顯著高于對照,其他5株菌株處理與對照無顯著差異。菌株NS1、NS6、NS18和NS25處理的組培苗最長根長顯著高于對照,其他7株菌株處理與對照無顯著差異。僅菌株NS6處理的組培苗單株葉片數顯著高于對照,其他10株菌株處理與對照無顯著差異。

表2 不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗生長指標的影響

2.2.2 對葉片葉綠素含量和葉綠素熒光參數的影響 不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗葉片葉綠素含量和葉綠素熒光參數的影響見表3。由表3可以看出:除菌株NS13處理的雷公藤組培苗葉片葉綠素含量顯著低于對照外,其他10株菌株處理的組培苗葉片葉綠素含量均顯著高于對照,其中,菌株NS18處理的組培苗葉片葉綠素含量最高(2.738 mg·g-1),菌株NS6和NS25處理的組培苗葉片葉綠素含量也較高(分別為2.512和2.456 mg·g-1)。菌株NS7和NS13處理的組培苗葉片初始熒光(Fo)顯著高于對照,其他9株菌株處理與對照無顯著差異。菌株NS1、NS7、NS18、NS31和NS32處理的組培苗葉片最大熒光(Fm)顯著高于對照,其他6株菌株處理與對照無顯著差異。菌株NS1、NS18、NS31、NS32和NS33處理的組培苗葉片可變熒光(Fv)顯著高于對照,其他6株菌株處理與對照無顯著差異。菌株NS14處理的組培苗葉片PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)顯著高于對照,而菌株NS7和NS13處理的組培苗葉片Fv/Fm值則顯著低于對照,其他8株菌株處理與對照無顯著差異。

表3 不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗葉片葉綠素含量和葉綠素熒光參數的影響

2.2.3 對C、N、P和K含量的影響 不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗中C、N、P和K含量的影響見表4。由表4可以看出:除菌株NS13、NS18和NS25處理的雷公藤組培苗C含量顯著低于對照外,其他8株菌株處理的組培苗C含量顯著高于對照,其中,菌株NS14處理的組培苗C含量最高,菌株NS1、NS7和NS31處理的組培苗C含量也較高,較對照升高了15.5%～21.5%。菌株NS1、NS4、NS32和NS33處理的組培苗N含量顯著高于對照,較對照升高了29.0%～137.2%,其中,菌株NS33處理對組培苗N含量的促進作用最大,其次為菌株NS1處理;其他7株菌株處理的組培苗N含量接近或顯著低于對照。與對照相比,11株菌株處理的組培苗P含量均有所升高,其中,NS1、NS6、NS7、NS13、NS14、NS25、NS31、NS32和NS33菌株處理的組培苗P含量顯著高于對照。菌株NS1、NS7、NS14、NS18、NS31、NS32和NS33處理的組培苗K含量顯著高于對照,其他4株菌株處理的組培苗K含量則接近或顯著低于對照。

表4 不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗中C、N、P和K含量的影響

2.3 內生真菌對雷公藤組培苗中雷公藤紅素和雷公藤甲素含量的影響

不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗中雷公藤紅素和雷公藤甲素含量的影響見表5。由表5可以看出:11株菌株處理的雷公藤組培苗根中雷公藤紅素含量顯著(P<0.05)高于對照,較對照升高了3.3～10.3倍,其中,NS6、NS14和NS33處理的組培苗根中雷公藤紅素含量顯著高于其他菌株處理;菌株NS4、NS7和NS31處理的組培苗根中雷公藤紅素含量也較高,顯著高于剩余5株菌株處理。11株菌株處理的雷公藤組培苗莖中雷公藤紅素含量顯著高于對照,較對照升高了48.7%～104.2%,其中,菌株NS7、NS18和NS32處理的組培苗莖中雷公藤紅素含量顯著高于其他菌株處理,菌株NS1和NS13處理的組培苗莖中雷公藤紅素含量也較高。內生真菌對組培苗葉片中雷公藤紅素含量的影響總體較小,僅菌株NS33處理的組培苗葉片中雷公藤紅素含量顯著高于對照,其他10株菌株處理與對照無顯著差異。

表5 不同內生真菌菌株對雷公藤組培苗中雷公藤紅素和雷公藤甲素含量的影響

雷公藤組培苗莖和葉片中均未檢出雷公藤甲素。菌株NS6、NS7、NS13、NS25、NS32和NS33處理的組培苗根中雷公藤甲素含量顯著高于對照,其中,菌株NS7處理的組培苗根中雷公藤甲素含量最高,顯著高于其他菌株處理;菌株NS32和NS33處理的組培苗根中雷公藤甲素含量也較高;菌株NS1、NS14、NS18和NS31處理的組培苗根中雷公藤甲素含量顯著低于對照。

2.4 菌株的鑒定

綜合上述研究結果,菌株NS1、NS6、NS31、NS32和NS33具有促生潛力且能夠明顯促進雷公藤組培苗生長、營養元素積累,提高雷公藤紅素和雷公藤甲素含量,對這5株內生真菌進行分子鑒定。菌株NS1為Fusariumnisikadoi[25],將其余4株菌株的26SrDNA D1/D2區基因序列在NCBI中進行BLASTn比對,并構建系統發育樹,結果見圖1。由圖1可以看出:菌株NS6、NS31、NS32和NS33分別與歧皺青霉(Penicilliumsteckii)、季也蒙邁耶氏酵母(Meyerozymaguilliermondii)、黑肉座菌(Hypocreanigricans)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)聚在同一分支上,BLASTn比對序列相似性均達99%。推測菌株NS6、NS31、NS32和NS33分別屬于青霉菌屬(Penicillium)、邁耶氏酵母屬(Meyerozyma)、肉座菌屬(Hypocrea)和鐮刀菌屬(Fusarium)。將菌株NS6、NS31、NS32和NS33的序列提交GenBank,登錄號分別為KP715295、KP715296、KP715297和KP715298。

分支上的數值代表各分支的頻率參數The values on the branches indicate the frequency parameters of each branch. 括號中編號為GenBank登錄號Nos. in brackets are GenBank accession numbers.

3 討論和結論

內生真菌對宿主植物的生長發育具有重要的促進作用。植物促生真菌被廣泛應用于農林生產中,在提高產量、防治病害和增強脅迫耐性方面有重要作用[26]。植物內生真菌對植物促生效應存在表型差異,例如:內生真菌Gilmaniellasp. AL12能夠將蒼術〔Atractylodeslancea(Thunb.) DC.〕苗的莖和根質量提高1.13倍以上[27];內生真菌AlternariaA7顯著增加了煙草(NicotianatabacumLinn.)的葉面積和干質量[28];而深色有隔內生真菌鏈格孢菌Alternariasp. CGMCC 17463既增加了紫花苜蓿(MedicagosativaLinn.)的株高和地上部干質量,也提高了其根部干質量和根冠比[29]。與雷公藤組培苗共生培養后,菌株NS1、NS6、NS31、NS32和NS33總體上顯著(P<0.05)促進了組培苗的單株鮮質量和干質量,菌株NS6、NS32和NS33對株高有顯著促進作用,菌株NS1和NS6對最長根長有顯著促進作用,菌株NS6能顯著增加單株葉片數,說明雷公藤植株內存在能促進其生長的真菌,但這些促生內生真菌對其最長根長和株高等表型的影響存在差異。內生真菌促生效應的植物表型差異可能源于不同內生真菌促生機制的差異。

內生真菌具有生物固氮、磷溶解、產生植物激素和拮抗病原菌等特性,對宿主植物的生長發育有促進作用[30]。如球狀莖點霉菌(Phomaglomerata)和青霉菌(Penicilliumsp.)能夠分泌赤霉素和吲哚乙酸,從而顯著促進水稻生長[31];具有溶磷能力的內生百歲蘭曲霉(Aspergilluswelwitschiae)能夠增加大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕的根芽長、鮮質量和干質量[32]。雷公藤促生內生真菌中,菌株NS1具有較好的產鐵載體和溶磷能力,菌株NS6的產鐵載體、溶磷和吲哚乙酸分泌能力均較強,菌株NS31、NS32和NS33分別具有較高的溶磷、吲哚乙酸分泌和產鐵載體能力。鐵載體的生產有利于微生物和植物捕獲環境中的鐵離子。本研究中,推測屬于鐮力菌屬的菌株NS1和NS33均具有很高的產鐵載體能力,其他研究也報道了能產鐵載體的鐮刀菌,如紋瓣蘭〔Cymbidiumaloifolium(Linn.) Sw〕的內生尖孢鐮刀菌CAF1[33-34],且非致病鐮刀菌比致病鐮刀菌能生產更多的鐵載體[35]。磷酸鹽溶解微生物有助于提高植物根系對磷的吸收。具有溶磷能力的季也蒙邁耶氏酵母CC1能提高玉米(ZeamaysLinn.)產量,降低化學肥料的使用量[36]。吲哚乙酸是根和莖生長的重要植物激素[37]。相關研究結果顯示:許多青霉菌能夠分泌吲哚乙酸,如內生青霉菌LWL3能夠促進水稻莖長、莖鮮質量、莖干質量和葉綠素含量,具有較高的吲哚乙酸分泌能力[31];定植于丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)根部細胞間隙的歧皺青霉DF33能產吲哚乙酸[38]。因此,不同雷公藤促生內生真菌具有不同的促生潛力,對宿主組培苗生長的促進效應存在差異。

植物葉綠素含量越高,光合反應速率越快。葉綠素熒光參數是反映葉綠體狀態和表征植物光合能量轉換效率的重要參數。本研究中,除菌株NS13外,其他10株內生真菌均能顯著提高雷公藤組培苗葉片葉綠素含量;菌株NS1、NS18、NS31和NS32能顯著提高組培苗葉片的最大熒光和可變熒光,菌株NS14能顯著提高組培苗葉片PSⅡ最大光化學效率,這些雷公藤內生真菌對宿主植物的PSⅡ電子傳遞有積極作用,能提高雷公藤光合能力。木麻黃(CasuarinaequisetifoliaLinn.)內生真菌可以提高其水培苗葉綠素相對含量及主要熒光參數[39];與深色有隔內生真菌相關的植物的葉綠素含量和PSⅡ光化學效率較高[40]。睡茄〔Withaniasomnifera(Linn.) Dunal〕根和葉片中部分內生真菌可以提高睡茄的光合效率以及莖和根的干質量[41]。上述研究結果說明內生真菌能夠提高植物的葉綠素含量和葉綠素熒光參數值,提高植物的光合能力,光合作用同化物和糖類的產量也隨之增加,植物的生長和生物量得到改善。因而,雷公藤內生真菌對組培苗葉綠素含量和葉綠素熒光參數值的提高作用可能是其促進組培苗生長的原因之一。

內生真菌可能增加植物養分吸收,進而促進植物生長[42]。在缺氮和正常供氮條件下接種內生真菌Suillusgranulatus、Pisolithustinctorius、Pleotrichocladiumopacum或Pseudopyrenochaetasp.能顯著提高油松(PinustabuliformisCarriere)苗的生長性能,增加地上部和根部養分含量[42]。來自冬青(IlexchinensisSims)的深色有隔內生真菌Acrocalymmavagum和Scytalidiumlignicola可以明顯提高鎘脅迫下紫花苜蓿和沙冬青〔Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) S. H. Cheng〕的干質量,而二者分別對沙冬青的總氮含量和紫花苜蓿的有機碳含量有顯著促進作用[43]。此外,深色有隔內生真菌還可以提高植物根和莖的質量、總質量以及N和P含量[44]。本研究進一步證實了促生內生真菌在植物養分獲取中的積極作用,雷公藤促生內生真菌菌株NS1、NS32和NS33能顯著提高組培苗中C、N、P和K含量,菌株NS6能顯著提高組培苗中C和P含量,菌株NS31能顯著提高組培苗中C、P和K含量。

內生真菌可以調節宿主植物基因表達和生理反應,誘導宿主植物的次生代謝。雷公藤紅素和雷公藤甲素是雷公藤植株中的重要藥用活性成分,11株雷公藤內生真菌對組培苗根和莖中雷公藤紅素含量均有顯著促進作用,分別較對照升高了3.3～10.3倍和48.7%～104.2%;對根中雷公藤甲素含量的影響則存在差異,其中,菌株NS6、NS7、NS13、NS25、NS32和NS33有顯著促進作用。內生真菌與宿主植物相互作用的類型決定了宿主植物中次生代謝產物的變化。鐮刀菌因其具有許多獨特的基因簇參與次級代謝產物產生而被廣泛關注[45]。勇應輝等[17]認為內生鐮刀菌在促進大戟生長和萜類化合物含量中有重要作用。雷公藤內生真菌中,推測屬于鐮刀菌屬的菌株NS1提高了根和莖中雷公藤紅素含量,菌株NS33提高了根、莖和葉片中雷公藤紅素含量以及根中雷公藤甲素含量。青霉菌屬真菌因其具有高度通用的細胞毒性次生代謝產物合成潛力而得到廣泛開發[46]。從丹參中分離的歧皺青霉DF33通過上調關鍵基因顯著促進丹參根部丹參酮ⅡA和隱丹參酮的合成[38]。肉座菌屬包含多種能夠生產工業酶、次生代謝產物或生物防治劑的菌株[47]。來自野生丹參的黑肉座菌菌株S79顯著促進丹參酮合成[48]。雷公藤內生真菌中,推測屬于青霉菌屬的菌株NS6和屬于肉座菌屬的菌株NS32均能顯著提高雷公藤組培苗根和莖中雷公藤紅素含量以及根中雷公藤甲素含量,進一步表明內生青霉菌和肉座菌對宿主植物次生代謝產物積累有促進作用,是促進植物中生物活性成分積累的重要功能真菌。內生真菌可能通過產生與宿主植物相同或相似的次生代謝產物而提高其在植物體內的積累,而某些內生真菌可以產生多種類型的酶或代謝前體物,這些酶或代謝前體物可以轉化或誘導植物合成某些生物活性物質[49]。雷公藤內生真菌菌株NS1具有產雷公藤甲素的能力[25],然而與對照相比,與菌株NS1共培養的組培苗根中雷公藤甲素含量卻顯著降低,可能是內生真菌產物、共培養條件或植物的生長階段等影響了植物的次生代謝[50]。

綜上所述,雷公藤內生真菌能夠分泌吲哚乙酸、產鐵載體和溶解無機磷,總體能夠促進雷公藤組培苗生長,增加葉綠素含量,改善養分吸收。部分內生真菌還參與雷公藤次生代謝產物的調控,促進植株體內雷公藤紅素和雷公藤甲素的積累。本研究結果可為使用雷公藤內生真菌改善宿主植物生長和調控次生代謝提供科學依據。