淫羊藿苷對心力衰竭血清中DCs與CD4+T細胞共培養的影響*

趙玲婕,李 倩,陳波洋,周 艷,高 潔,柴藝匯,陳云志△

(1.貴州中醫藥大學,貴陽 550025;2.德江縣民族中醫院,貴州德江 565200)

心力衰竭是由于心臟的結構或功能異常導致的一種臨床綜合征[1]?，F代醫學治療心力衰竭雖可緩解患者的臨床癥狀,但長期聯合用藥會對人體產生諸多不良反應[2]。因此,有必要尋找更加有效的治療策略,提高心衰患者的生活質量,降低其醫療成本。

淫羊藿苷(icariin,ICA)是中藥淫羊藿的活性成分提取物,現代藥理研究發現其對心力衰竭、心肌缺血等疾病具有明顯的減緩作用[3]。研究表明,維生素D系統與心血管系統疾病的發病密切相關[4-5],維生素D與淫羊藿部分作用機制相似,ICA可通過影響維生素D系統有效改善心血管疾病[6]。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)作為機體內能直接激活初始T細胞的最強專職抗原提呈細胞,在心力衰竭免疫調節中起著至關重要的作用。DCs可調控T細胞的分化,以維持和誘導機體的免疫耐受[7]。而T細胞中的CD4+T細胞已被證明在心力衰竭中發揮關鍵作用[8]。另有研究發現,維生素D的主要活性形式1,25-二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]能抑制DCs的成熟[9],且DCs介導T細胞的分化會被ICA影響[10]。故推測,ICA與維生素D治療心力衰竭,可能是通過調節DCs干預CD4+T細胞的分化來實現的。綜上,本研究擬探討ICA對心力衰竭血清處理DCs共培養中CD4+T細胞分化的影響,為ICA改善心力衰竭提供實驗支撐。研究方案經重慶醫科大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審查,審查批號:2019年科研倫理(2019-217)。

1 材料

1.1 動物

50只雄性Dahl鹽敏感大鼠,SPF級,5周齡,10只同齡SPF級雄性Dahl鹽抵抗大鼠,大鼠均購自北京維通利華實驗技術有限公司,體質量(200±20)g,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。動物每日保持自由飲水、進食,動物房光照與通風良好,實驗室溫度22～26 ℃,濕度40%～70%。

1.2 藥品

淫羊藿苷,中國上海麥克林生化科技有限公司,純度95%,批號:C10464466。

1.3 主要試劑與儀器

流式抗體CD4-FITC(貨號:70-AR00401-20)、白細胞介素(interleukin,IL)-17-PE(貨號:70-AM0I1704-20)均購自中國MultiSciences公司;流式抗體CD3-PC5.5(貨號:100217)購自美國Biolegend公司;流式抗體CD8-PB450(貨號:ab242255)購自英國Abcam公司;流式抗體Foxp3-PE(貨號:320008)、CD25-APC(貨號:202114)均購自美國Biolegend公司;組織淋巴細胞分離液(貨號:P5780)購自美國Solarbio公司; IL-6(貨號:SEA079Ra),IL-10(貨號:SEA056Ra),IL-17 ELISA試劑盒(貨號:SEA063Ra)均購自中國云克隆公司;轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1 ELISA試劑盒(貨號:E-EL-0162c)購自中國欣博盛公司。

QL-901型旋渦振蕩器,中國其林貝爾公司;NanoDrop One/One C型微量紫外-可見光分光光度計、CMax Plus型多功能酶標儀,美國Thermo公司;CytoFLEX型流式細胞儀,美國Beckman公司。

2 方法

2.1 制備心力衰竭血清

將50只5周齡SPF級雄性Dahl鹽敏感大鼠作為模型組,給予低鹽飼料(含0.3%NaCl)適應性喂養1周后,再給予含8%NaCl動物飼料喂養[11]。10只5周齡SPF級雄性Dahl鹽抵抗大鼠作為對照組。對照組以普通嚙齒類動物飼料喂養,2組大鼠分別喂養至18周齡后麻醉行心臟超聲檢測心功能。模型組大鼠確定心衰后,將2組大鼠分離血清,過濾除菌分裝,-20 ℃保存備用。

2.2 骨髓源性DCs分離及培養

將分離血清后的模型組大鼠在無菌條件下取出雙側股骨脛骨,加入紅細胞裂解液裂解紅細胞,用含有胎牛血清的RPMI-1640培養基懸浮細胞,接種于24孔培養板,每孔1×106個/mL[12]。加入GM-CSF(10 ng/mL)、IL-4(20 ng/mL)誘導,以后隔日半量換液,第7天將收集的懸浮細胞加入1 μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激成熟,再繼續培養2 d后收集懸浮細胞。按上述方法,取對照組大鼠骨髓源性DCs備用。

2.3 流式細胞術分選CD4+T細胞

無菌條件下分離模型組大鼠脾臟,加入含2%胎牛血清的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)20 mL,經過研磨后獲得脾臟單細胞懸液,在細胞懸液中加入大鼠組織淋巴細胞分離液,離心,PBS洗滌2次,調整細胞濃度為1 × 108個/mL。收集細胞懸液即為CD4+T細胞。按上述方法取對照組大鼠CD4+T細胞保存備用。

2.4 流式細胞儀檢測CD4+T細胞純度

取獲得的CD4+T細胞,加入流式抗體CD4-FITC,CD3-PC5.5熒光標記抗體各20 μL?；靹?置25 ℃避光孵育30 min后離心10 min,棄上清;加入PBS緩沖液洗除多余未結合的抗體,再次離心10 min,重復2次,流式細胞儀檢測。

2.5 骨髓源性DCs與CD4+T細胞共培養

收集2.2培養的DCs與2.3項下培養的CD4+T細胞,將DCs和CD4+T按照1:10的比例共培養,培養2 d后,將共培養的細胞分為對照組(正常血清),模型組(心力衰竭血清),模型組+維生素D組(1×10-8mol/L),模型組+ICA低劑量組(10 μmol/L ICA),模型組+ICA中劑量組(20 μmol/L ICA),模型組+ICA高劑量組(40 μmol/L ICA)。藥物干預24 h后收集細胞標本。

2.6 流式細胞儀檢測DCs誘導CD4+T細胞分化情況

收集藥物干預24 h后的共培養細胞,離心重懸106/100 μL,滴加相關抗體。Th17細胞表面標記抗體:PC5.5-CD3、PB45O-CD8、PE-IL-17;Treg細胞表面標記抗體:FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3。使用流式細胞儀檢測分析。

2.7 ELISA檢測共培養細胞上清液相關細胞因子的水平

按試劑盒說明書進行檢測IL-17、TGF-β1、IL-6、IL-12、IL-10的水平,用酶標儀在450 nm處依序測量各孔的光密度,計算樣品濃度。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 2組18周齡大鼠心臟超聲功能檢測結果

心臟超聲結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)水平均明顯上升(P<0.01),左室射血分數(left ventricular ejection fractions,LVEF)明顯降低(P<0.01)。提示模型組大鼠心功能異常,心力衰竭模型建立成功,見圖1。

注:與對照組比較##P<0.01;左室舒張末期內徑(LVEDD),左室收縮末期內徑(LVESD)圖1 2組大鼠心功能相關指標比較

3.2 流式細胞儀鑒定CD4+T細胞純度

經流式鑒定結果可看出,分選出來的CD4+T細胞的純度為分別為94.34%、95.79%,提示分選出的CD4+T細胞純度與活性均較高,見圖2。

1-1.模型組CD4+T細胞; 2-1.對照組CD4+T細胞圖2 流式細胞術檢測CD4+T細胞純度

3.3 ICA對DCs誘導CD4+T細胞分化為Th17、Treg的影響

與對照組比較,模型組中輔助性T細胞(T helper cell, Th)17陽性表達率顯著上升,Th17/調節性T細胞(T regulatory cells,Treg)比值顯著升高(P<0.01),Treg陽性表達率明顯降低(P<0.01);與模型組比較,維生素D組與ICA 3個劑量組的Th17細胞陽性表達率及Th17/Treg比值明顯降低(P<0.01),Treg陽性表達率明顯升高(P<0.01)。提示ICA與維生素D均能明顯提高Treg陽性表達率,減少Th17細胞陽性表達率及Th17/Treg比值,維持體內Th17/Treg穩態,見圖3、圖4。

注:與對照組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.01;輔助性T 細胞17(Th17),調節性T細胞(Treg),樹突狀細胞(DCs)A.共培養細胞中Th17陽性表達率;B.共培養細胞中Treg陽性表達率;C.共培養細胞中Th17/Treg比值圖3 淫羊藿苷對DCs誘導CD4+T細胞分化為Th17、Treg的影響

3.4 ICA對DCs和CD4+T細胞共培養上清液相關細胞因子的影響

與對照組比較,模型組IL-17、TGF-β1、IL-6、IL-12水平明顯升高,IL-10水平顯著下降(P<0.01);與模型組比較,維生素D組與ICA高、中劑量組的IL-10水平顯著升高,IL-17、TGF-β1、IL-6、IL-12水平顯著降低(P<0.01)。ICA低劑量組的IL-17、TGF-β1、IL-6、IL-12表達下調,IL-10表達上升(P<0.05)。其指標升高或降低的程度與ICA劑量呈依賴關系。提示ICA與維生素D可增加抑炎細胞因子IL-10的水平,降低促炎細胞因子IL-17、TGF-β1、IL-6與IL-12的表達,改善機體炎癥狀態,見圖5。

4 討論

心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段,臨床上常用LVEF、LVEDD、LVESD等作為評價心衰患者心功能的重要指標[13]。而心功能狀況是判斷心力衰竭程度的關鍵依據[14]。心力衰竭與炎癥標志物上調密切相關,促進炎癥反應發生的關鍵因素之一是免疫系統,不斷的免疫激活可引起炎癥加速心衰的病理過程[15]。T細胞作為免疫細胞的重要組成部分,其激活后參與了心力衰竭的發生發展[16]。DCs是機體內強大的抗原呈遞細胞,在T細胞反應的啟動中起著至關重要的作用,其表面共刺激分子表達上升可活化T細胞,誘導免疫應答反應[17]。DCs能夠介導CD4+T細胞分化為效應T細胞群[18],即Th17或Treg細胞等[19-20]。Th17和Treg均來自未成熟的Th細胞。Th17可通過抑制Treg的分化和產生較多的IL-6介導促炎反應[21-22]。IL-17作為Th17的主要效應因子,也能通過增加IL-6、IL-β1的分泌來加劇炎癥[23]。Treg細胞不僅能控制自身免疫反應,還是調節炎癥、感染等的重要細胞群。Treg的抑制性細胞因子IL-10直接參與T細胞的抑制功能以維持免疫穩態[24]。研究發現,心力衰竭大鼠Th17/Treg處于失衡狀態[25]。體內Th17與Treg細胞的平衡與心功能密切相關,其比例失衡可導致免疫應答和自身免疫的發生[26]。

維生素D是人體內的重要物質。有研究發現,1,25(OH)2D3不僅可與DCs上維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)結合而發揮生物學效應,影響T淋巴細胞的分化和功能,還對DCs的成熟具有調節作用,降低促炎細胞因子IL-12水平,促進抑炎細胞因子IL-10表達上升,使Treg細胞數量增加[27]。維生素D補充較少的心衰患者體內CD4+T細胞向Treg細胞分化減少[28]。

中醫認為,心力衰竭雖病位在心,但病源在腎。腎為先天之本,主藏精,腎精不足會致腎陰腎陽虧虛,腎陰腎陽為五臟陰陽之根本,其虛損不足最終致使心衰[29]。因此,治療心力衰竭的途徑之一是調控腎的生理功能。淫羊藿為傳統補腎中藥,具有補腎陽、祛風濕之功效?！度杖A子本草》也有記載淫羊藿可“強心力”。ICA作為淫羊藿的主要成分之一,亦可抑制心臟纖維化,改善心功能[30]。ICA與維生素D有較多關聯。課題組前期研究發現,ICA通過調節維生素D系統不僅能對心肌重塑模型產生保護作用[31],還可影響VDR mRNA的表達水平達從而達到保護小鼠肥大心肌細胞的作用[32]。另有研究發現,ICA可影響小鼠骨髓源性DCs成熟,協調共刺激分子CD80、CD86等表達[33]。本研究通過ICA干預Dahl鹽敏感大鼠骨髓源性DCs與CD4+T細胞,通過比較不同劑量ICA與維生素D對Dahl鹽敏感大鼠骨髓源性DCs和CD4+T細胞共培養后Th17、Treg陽性表達比例以及其上清液中IL-17、TGF-β1、IL-6、IL-12、IL-10的影響,探討ICA與維生素D防治心力衰竭的機制。

本實驗結果顯示,ICA與維生素D的治療結果趨勢一致,均可顯著降低Th17細胞比率及Th17/Treg比值,升高Treg比率;顯著升高IL-10水平,降低IL-17、TGF-β1、IL-6、IL-12水平。推測ICA與維生素D通過調節DCs介導CD4+T細胞的分化來治療心力衰竭。綜上,本研究發現ICA與維生素D能通過調節機體內Th17/Treg的平衡,降低促炎細胞因子IL-17、TGF-β1、IL-6、IL-12與升高抑炎細胞因子IL-10的表達來治療心力衰竭。這為ICA治療心力衰竭的臨床應用提供了實驗依據。