基于化學激活熒光素酶表達基因法和標準方法評估動物源性固態食品中17種二英類化合物毒性當量的相關性比較

王 燕,張 敏,朱曉艷,江玲麗,王如坤,鐘鶯鶯,譚 曜,保琦蓓*

(1.寧波海關技術中心,寧波 315012;2.南京海關危險貨物與包裝檢測中心,常州 213000;3.寧波衛生職業技術學院,寧波 315100)

目前同位素稀釋-高分辨氣相色譜-高分辨質譜法(HRGC-HRMS)被認為是二英類化合物檢測的金標準(GB 5009.205-2013《食品安全國家標準 食品中二英及其類似物毒性當量的測定》),但是由于該方法檢測費用高、周期長等原因,限制了其在批量樣品檢測中的應用,再加上設備昂貴也使得能開展此項檢測的實驗室較少。隨著生物技術的發展,一些特異性強、靈敏度高、操作簡單且分析時間短的生物技術,如酶聯免疫法(EIA)、酶活力誘導法(EROD)、化學激活熒光素酶表達基因法(CALUX)等被用于快速篩查樣品中二英類化合物。CALUX是基于二英類化合物產生的毒性作用需要與機體細胞核內的二英反應增強子結合,誘導機體內特異基因表達而構建CALUX系統,根據系統合成的熒光素量、熒光強度與系統中二英類化合物濃度水平的關系來評估其毒性[1]。CALUX作為美國國家環境保護局(EPA)批準的一種生物檢測方法[SW 846-4435MethodforToxicEquivalents(TEQS)DeterminationforDioxin-LikeChemicalActivitywiththeCALUXBioassay],被應用于大量環境樣品中的二英類污染物的篩查。目前也有很多將CALUX應用于土壤、水、煙氣、污泥、飼料、添加劑以及生物組織中二英類化合物快速篩查的研究[2-8]。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

XPE205型電子天平;ASE350型加速溶劑萃取儀;Thermo DFS型高分辨氣質聯用儀;UV-1800型紫外-可見分光光度計;KA RV8型旋轉蒸發儀;MD 200型氮吹儀;MCO-18AC型二氧化碳培養箱;CKKX53型顯微鏡;SW-CJ-1FD型生物安全柜;Centro XS3 IB960型化學發光讀板機。

17種PCDD/Fs的混合標準溶液系列：2,3,7,8-TCDD、2,3,7,8-四氯代二苯并呋喃(2,3,7,8-TCDF)的質量濃度為0.5,2.0,10,40,200 ng·mL-1,1,2,3,7,8-五氯代二苯并對二英(1,2,3,7,8-PeCDD)、1,2,3,7,8-五氯代二苯并呋喃(1,2,3,7,8-PeCDF)、2,3,4,7,8-五氯代二苯并呋喃(2,3,4,7,8-PeCDF)、1,2,3,4,7,8-六氯代二苯并對二英(1,2,3,4,7,8-HxCDD)、1,2,3,6,7,8-六氯代二苯并對二英(1,2,3,6,7,8-HxCDD)、1,2,3,7,8,9-六氯代二苯并對二英(1,2,3,7,8,9-HxCDD)、1,2,3,4,7,8-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,7,8-HxCDF)、1,2,3,6,7,8-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,6,7,8-HxCDF)、1,2,3,7,8,9-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,7,8,9-HxCDF)、2,3,4,6,7,8-六氯代二苯并呋喃(2,3,4,6,7,8-HxCDF)、1,2,3,4,6,7,8-七氯代二苯并對二英(1,2,3,4,6,7,8-HpCDD)、1,2,3,4,6,7,8-七氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,6,7,8-HpCDF)、1,2,3,4,7,8,9-七氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,7,8,9-HpCDF)的質量濃度為2.5,10,50,200,1 000 ng·mL-1,八氯代二苯并對二英(OCDD)、八氯代二苯并呋喃(OCDF)的質量濃度為5.0,20,100,400,2 000 ng·mL-1,溶劑為壬烷。

同位素標記的混合內標溶液：13C標記的17種PCDD/Fs,質量濃度均為100 ng·mL-1。

回收率內標溶液：13C-1,2,3,4-TCDD和13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD的質量濃度均為200 ng·mL-1。

正己烷、甲苯、二氯甲烷、甲醇、壬烷均為色譜純。

從超市收集24份城市居民日常消費的動物源性固態食品,包括肉類9份(牛肉、豬肉、雞肉各3份),海鮮類9份(鯽魚、鱸魚、魷魚各3份,去除內臟,取帶皮可食肉質部分),配方乳粉6份,樣品處理前先將其均質化并冷凍干燥成粉末,于-20 ℃儲存。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

DB-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);不分流進樣;載氣流量1.0 mL·min-1;進樣口溫度280 ℃,傳輸線溫度310 ℃。柱升溫程序：初始溫度140 ℃,保持1 min;以20 ℃·min-1速率升溫至200 ℃,保持1 min;以5 ℃·min-1速率升溫至220 ℃,保持16 min;以5 ℃·min-1速率升溫至235 ℃,保持7 min;以5 ℃·min-1速率升溫至310 ℃,保持10 min。

1.2.2 質譜條件

電子轟擊離子源,離子源能量45 eV,離子源溫度260 ℃;接口溫度270 ℃;以全氟煤油(PFK)為質量校正物質,質譜分辨率大于10 000;選擇離子監測模式檢測。其他質譜參數參考GB 5009.205-2013附錄C中的表C.3。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取與凈化

將1片乙酸纖維素膜放入萃取池底部,加入約10 g硅藻土,填充均勻后加入4～5 g樣品,再在樣品上部加入少量硅藻土并留出部分間隙,然后加入10 μL同位素標記的混合內標溶液(CALUX測定時不加)和1片乙酸纖維素膜,蓋上蓋子,以體積比1…1的二氯甲烷-正己烷的混合溶液為萃取劑,在150 ℃和10.3 MPa條件下萃取10 min(循環1次),然后將萃取液轉移至已稱重的500 mL平底燒瓶中,旋轉蒸發至干,稱重,計算脂肪含量。按照上述同樣的方法再處理一份4～5 g樣品,將萃取液和洗滌液(用體積比1…1的二氯甲烷-正己烷的混合溶液洗壁3次)一起轉移至15 mL玻璃離心管中(約12 mL)。對于采用CALUX分析的樣品,將上述溶液旋轉蒸發至0.5 mL,再用正己烷定容至1.0 mL,于-20 ℃保存,待測;對于采用HRGC-HRMS分析的樣品,將上述溶液旋轉蒸發至1.5 mL,氮吹至近干,加入20 μL壬烷和5 μL回收率內標溶液,振蕩均勻,待測。

1.3.2 樣品的測定

將保存用于CALUX分析的樣品恢復至室溫,然后氮吹至近干,加入2 mL DMSO復溶;分取10 μL,與100 μLα-MEM培養基混合,配制成樣品溶液。將細胞置于含10%(體積分數)胎牛血清和100 U·mL-1抗生素的α-MEM培養基中,于37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養。將細胞以(3～4)×104個/孔的密度接種到96孔白底潔凈板中間的60個孔中,接種量為100 μL·孔-1。培養24 h后,向細胞中加入上述樣品溶液,平行加入3份;暴露24 h后,用細胞裂解緩沖液振蕩15 min結束細胞反應,在每個孔中加入50 μL熒光素酶試劑,再加入50 μL DMSO溶解并按照體積比1…1 000進行稀釋,使用化學發光讀板機測量溶液的相對光單位(RLU值)。

將用于HRGC-HRMS分析的樣品按照1.2節儀器工作條件進行測定。

1.4 毒性當量的評估

基于HRGC-HRMS的毒性當量結果以TEQ值表示,參考文獻[16]和2005年世界衛生組織確定的毒性當量因子(TEF)計算TEQ上、下限值。

基于CALUX的毒性當量結果以BEQ值表示,通過2,3,7,8-TCDD的響應曲線,利用擬合的四參數希爾方程計算得到樣品中2,3,7,8-TCDD的含量,即樣品的BEQ值。

2 結果與討論

2.1 HRGC-HRMS的測定結果

2.1.1 標準曲線和檢出限

按照1.2節儀器工作條件測定17種PCDD/Fs的混合標準溶液系列,以目標物的質量濃度為橫坐標,目標物與相應同位素內標的峰面積比值為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,17種目標物標準曲線的相關系數均大于0.990 0,相關性較好,滿足測定的要求。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)。結果顯示：2,3,7,8-TCDD和2,3,7,8-TCDF的檢出限為0.04 ng·kg-1,OCDD和OCDF的檢出限為0.40 ng·kg-1,其余13種目標物的檢出限均為0.20 ng·kg-1。

2.1.2 樣品中17種PCDD/Fs的含量

采用HRGC-HRMS對收集的24份樣品進行測定,內標法定量,17種PCDD/Fs的中位值如圖1所示。

圖1 樣品中17種PCDD/Fs的含量Fig.1 Contents of 17 PCDD/Fs in the samples

結果表明：17種PCDD/Fs在肉類樣品中的總檢出量為0.43～1.07 pg·g-1,在海鮮類樣品中的總檢出量為0.09～2.21 pg·g-1,在配方乳粉樣品中的總檢出量為0.09～0.42 pg·g-1。由于PCDD/Fs主要為脂溶性化合物,容易積累于富含脂肪的食品中,而配方乳粉的主要成分為蛋白質,因此其中PCDD/Fs的含量較低。7種PCDDs在24份樣品中的平均檢出率為29%,10種PCDFs的平均檢出率為37%,二者差別不大;17種目標物中1,2,3,4,6,7,8-HpCDF的檢出率最高,為63%,其次是2,3,4,6,7,8-HpCDF和OCDD,檢出率各為50%;1,2,3,4,7,8,9-HpCDF僅在2份樣品中有檢出,檢出率最低,為8%。

2.2 CALUX的測定結果

以DMSO稀釋2,3,7,8-TCDD標準溶液,繪制質量濃度為48.94,1.472×102,4.411×102,1.327×103,3.961×103,1.191×104,3.574×104,1.000×105,3.000×105pg·L-1的2,3,7,8-TCDD標準溶液系列的RLU值(y)與質量濃度(x)對數的響應曲線,結果如圖2所示。

圖2 2,3,7,8-TCDD的響應曲線Fig.2 Response curve of 2,3,7,8-TCDD

使用origin軟件進行擬合,得到四參數希爾方程為y=1.437×105+2.497×106/[1+10(lg3.8-lgx)×9.9],相關系數為0.999 7。繪制3條曲線,計算各點RLU值的變異系數(CV)。結果顯示,當2,3,7,8-TCDD質量濃度為48.94～1.000×105pg·L-1時,每個點的CV值均低于20%。因此,將48.94～1.000×105pg·L-1作為該標準曲線定量的線性范圍。若樣品中2,3,7,8-TCDD的計算結果高于線性范圍上限,需要對樣品進行稀釋后再檢測。

2.3 基于CALUX和HRGC-HRMS評估17種PCDD/Fs的毒性當量

根據HRGC-HRMS和CALUX的測定結果,按照1.4節方法評估24份樣品中17種PCDD/Fs的毒性當量,結果見表1;7種PCDDs和10種PCDFs的毒性當量(TEQ上限值)貢獻率如圖3所示。

表1 樣品中17種PCDD/Fs的毒性當量結果

圖3 樣品中PCDDs和PCDFs的毒性當量貢獻率Fig.3 Toxic equivalent contribution rates of PCDDs and PCDFs in the samples

結果表明：HRGC-HRMS得到的樣品的TEQ下限值為0.001～0.106 pg·g-1,TEQ上限值為0.004～0.242 pg·g-1,遠低于歐盟法規EC 1881/2006中規定的限量值(3.5 pg·g-1);CALUX得到的肉類樣品的BEQ值為0.74～1.30 pg·g-1,海鮮類樣品的BEQ值為0.31～0.63 pg·g-1,配方乳粉樣品的BEQ值為0.043～0.074 pg·g-1。雖然目前有不少研究已經將CALUX應用于牛奶、肉類、蛋類、魚和魚油、海產品等食品和動物飼料中二英類物質的檢測, 但是并沒有形成以CALUX為標準的限量值。從本工作試驗結果來看,3種動物源性固態食品的BEQ值均大于使用HRGC-HRMS測定得到的TEQ值,這也與其他研究結果類似[12,16]。CALUX測定的是樣品提取物中能與芳基烴受體(AhR)結合的化合物,這些化合物不僅包括二英、呋喃以及多氯聯苯等,也包括提取脂肪中的其他鹵代化合物,因此BEQ值與TEQ值相比存在差異。從PCDDs和PCFDs的毒性當量(TEQ上限值)貢獻率來看,幾乎所有樣品中均以PCDDs占據主導,其對PCDD/Fs總毒性當量的平均貢獻率達到74.3%,而PCDFs的平均貢獻率僅為25.7%。

2.4 基于CALUX和HRGC-HRMS評估17種PCDD/Fs毒性當量的相關性分析

為分析基于CALUX和HRGC-HRMS得到的毒性當量結果之間的關系,繪制了TEQ值與BEQ/TEQ比值的函數關系,結果如圖4所示。

圖4 TEQ值與BEQ/TEQ比值的函數關系Fig.4 Functional relationship between TEQ value and BEQ/TEQ value ratio

由圖4可知：以TEQ下限值為計算依據時,對于較低的毒性當量(TEQ下限值小于0.020 pg·g-1),BEQ/TEQ比值波動相對較大,對于較高的毒性當量(TEQ下限值大于0.020 pg·g-1),BEQ/TEQ比值趨于穩定;以TEQ上限值為計算依據時,BEQ/TEQ比值的波動范圍相對較小。

為進一步分析這兩種方法測定結果之間的關系,使CALUX能在動物源性固態食品中二英類化合物篩查中得以應用,分別建立了肉類、海鮮類和配方乳粉中17種PCDD/Fs的BEQ值與TEQ值的關系曲線,結果如圖5所示。

圖5 樣品中17種PCDD/Fs的BEQ值與TEQ值的關系曲線Fig.5 Relation curves between BEQ and TEQ values of 17 PCDD/Fs in the samples

由圖5可知：3種類型的動物源性固態食品中17種PCDD/Fs的BEQ值與TEQ值之間存在一定的相關性,BEQ值與TEQ上限值的相關性均顯著高于BEQ值與TEQ下限值的;配方乳粉樣品的BEQ值與TEQ上限值的相關性最低(相關系數為0.475 1),海鮮類樣品的BEQ值與TEQ上限值的相關性較高(相關系數為0.907 4)。因此,在海鮮類樣品中,基于CALUX得到的BEQ值與基于HRGC-HRMS得到的TEQ上限值較接近,當BEQ值大于0.50 pg·g-1時,可使用方程BEQ=3.989×TEQ(上限值)+0.195 4來對CALUX的毒性當量結果進行換算,從而評價食品的風險性;肉類和配方乳粉樣品的BEQ值與TEQ值相關性較差,不建議使用CALUX對這兩類動物源性固態食品的毒性當量進行換算。

本工作基于CALUX和HRGC-HRMS評估了肉類、海鮮類與配方乳粉等3類動物源性固態食品中7種PCDDs和10種PCDFs的毒性當量,并分析了二者之間的相關性。在后續研究中可以補充dl-PCBs的擬合分析,進一步完善CALUX快速篩查二英類化合物毒性當量一致性的評估結果,并通過更大量的樣品數據進行驗證,以提高這種生物法測定結果的通用性與認可度。