基于銪離子-四環素-草甘膦熒光增強體系結合分子印跡固相萃取測定環境樣品中草甘膦的殘留量

袁 寧,沈曉峰,全紅花,曾 誠,李 明*

(1.揚州大學 環境科學與工程學院,揚州 225127;2.揚州海關,揚州 225100)

草甘膦(Glyp)在農業上被廣泛用作非選擇性除草劑[1-2]。隨著Glyp的大量使用,其對環境產生的毒性作用逐漸被人們所熟知。Glyp在環境中主要是通過生物降解產生氨甲基膦酸;當Glyp吸附到土壤上時,它不再容易被生物降解,從而造成了其在土壤中殘留量的持續增加[3-4]。此外,吸附在土壤顆粒上的Glyp在被降解之前可通過懸浮在地表徑流的途徑發生遷移,因此Glyp在地表水甚至地下水中也能夠被檢測到。

由于Glyp及其相關代謝物極性高、水溶性強、揮發性低以及其分子結構中缺乏生色團,檢測Glyp的常用方法主要是高效液相色譜法[5]、毛細管電泳法[6]、配氫火焰離子化檢測器或質譜檢測器的氣相色譜法[7]。雖然這些方法可對實際樣品中的Glyp進行高靈敏定量分析,但均需要使用大型儀器,分析成本較高。文獻[8]采用化學衍生化-光譜法測定Glyp,得到了良好的結果,然而該衍生化反應需要加熱,操作繁瑣,并且檢出限較高。

稀土金屬離子絡合物常被作為熒光探針。四環素(Tc)是一種含有β-二酮酸的分子,可以與稀土金屬離子如Eu3+配位形成Eu3+-Tc絡合物,將其激發能轉移到Eu3+發射5D0→7F2躍遷(以615 nm為中心的強發射帶)[9-15]。該絡合物的特點是熒光量子產率高、斯托克斯位移大、發射帶窄。然而,由于水分子的猝滅作用,Eu3+-Tc絡合物通常顯示出較弱的熒光。在一些輔助配體的作用下,其可以取代Eu3+配位球上的水分子,形成Eu3+-Tc-輔助配體三元絡合物,表現出熒光增強的現象[16-19]。鑒于此,本工作基于Eu3+-Tc-Glyp熒光增強體系,建立了一種簡單、靈敏、選擇性高的測定Glyp含量的方法;同時,為了準確測定實際環境樣品中Glyp的殘留量,采用溶膠-凝膠法[20]制備了Glyp分子印跡固相萃取膜,以進一步擴大Eu3+-Tc-Glyp熒光增強體系在實際環境樣品中的應用范圍。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

F97XP13001型熒光分光光度計;CHI800D型電化學儀;Spectra Academy SV-2100型紫外-可見分光光度計;MX-S型振蕩器;LX-100型微型離心機;PHS-3C型酸度計。

三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液(50 mmol·L-1,pH 8.0)：將50 mL 0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液與29.2 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液混合,再用水稀釋并定容至100 mL。

EuCl3的純度為99.9%;正硅酸乙酯(TEOS)的純度為98%;Tc的純度為96%;鐵氰化鉀的純度大于98%;17種氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸)混合標準品的純度為99%;Glyp、草銨膦標準品的純度大于99.5%,氨甲基膦酸標準品的純度大于97%;試驗用水為蒸餾水。

灌溉水樣品及土壤樣品采集自江蘇昆山某鎮農田水溝。

1.2 試驗方法

1.2.1 Glyp分子印跡固相萃取膜的制備

將3.0 mL TEOS加入至含有2.5 mL無水乙醇和12 mL水的試劑瓶中,超聲振蕩,并用0.1 mol·L-1鹽酸溶液將其酸度調節至pH 1.0,攪拌2 h。分取1.0 mL,加入0.1 mL 1.0×10-2mol·L-1Glyp標準溶液,攪拌60 min。分取100 μL,轉移至4 mL平底試管中,將試管置于80 ℃加熱干燥60 min。向試管中加入1.0 mL水,浸泡45 min,洗脫出Glyp,得到Glyp分子印跡固相萃取膜。

1.2.2 樣品處理和測定

采集的灌溉水樣品經0.45 μm的尼龍膜針式過濾器過濾,并置于4 ℃冰箱中保存備用。采集距離地表0～20 cm的耕層土壤樣品,風干后過0.850 mm篩,分取5.0 g于50 mL塑料離心管中,加入20 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鉀溶液,渦旋混勻,超聲30 min,振蕩30 min,以轉速5 000 r·min-1離心5 min。取上清液,用濃度為0.5～3.0 mol·L-1的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液將其酸度調節至pH 7.0,然后加入100 μL三乙醇胺,用水定容至25.0 mL,置于4 ℃冰箱中保存備用。將Glyp分子印跡固相萃取膜置于上述處理后的水樣或土壤樣品中浸泡60 min,然后將其轉移至離心管中,加入1.5 mL水浸泡45 min用于脫附Glyp。脫附后的Glyp分子印跡固相萃取膜于25 ℃干燥,保存備用。

將1.5 mL脫附溶液或不同濃度的Glyp標準溶液與1.0 mL 1.5×10-2mol·L-1EuCl3溶液、1.0 mL 3.0×10-3mol·L-1Tc溶液和3.0 mL 100 mmol·L-1硼酸鹽緩沖溶液(pH 10.0)混合,用水定容至10 mL,靜置反應3 min。設置熒光分光光度計狹縫寬度為10 nm,光電倍增管(PMT)電壓為500 V,激發波長(λex)為403 nm,測定體系在615 nm發射波長處的熒光強度增加值ΔF(ΔF=F-F0,F和F0表示添加和未添加Glyp時的體系熒光強度)。

1.2.3 有機磷水解酶電極的制備

參考文獻[21]制備有機磷水解酶(OHP)電極,用于驗證Glyp分子印跡溶膠的性能。取500 mL聚磷菌培養液(106個·mL-1),以轉速4 000 r·min-1離心30 min,去除上清液,沉淀中加入5 mL 0.2 mg·L-1Glyp標準溶液,于4 ℃靜置1 h;以轉速8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,加入60%(質量分數)硫酸銨溶液,于4 ℃靜置2 h;以轉速10 000 r·min-1離心20 min,去除上清液,將剩余沉淀溶解于10 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)中。燒杯中加入相同的Tris-HCl緩沖溶液,將上述硫酸銨析出的粗酶溶液放入透析袋(透析袋在使用前用水反復沖洗)中進行透析。每隔12 h更換一次Tris-HCl緩沖溶液,重復3次后,將透析袋放入30%(質量分數)聚乙二醇溶液中,得到OHP溶液。分取20 μL,與2 μL 10%(質量分數)牛血清白蛋白溶液和5 μL 2.5%(質量分數)戊二醛溶液混合后滴加到尼龍膜表面,置于4 ℃冰箱中過夜。利用氨氣敏電極套管將尼龍膜固定在pH玻璃電極上,得到OHP電極。

取1.0 mL Glyp分子印跡溶膠洗脫液,與1.0 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)混合,于45 ℃水浴加熱60 s,水解出Glyp,待溶液冷卻后,用OHP電極記錄電位差。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

Eu3+、Eu3+-Tc和Eu3+-Tc-Glyp體系的熒光光譜見圖1,其中Tc濃度為1.0×10-4mol·L-1,Eu3+濃度為5.0×10-4mol·L-1,Glyp濃度為5.0×10-6mol·L-1,體系酸度為pH 10.0,λex為403 nm。

1-Eu3+-Tc-Glyp;2-Eu3+-Tc;3-Eu3+圖1 不同體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of different systems

結果表明：在Eu3+溶液中加入Tc后,Eu3+與Tc形成二元絡合物,分別在590 nm和615 nm處發射熒光,對應于Eu3+的5D0→7F1躍遷和5D0→7F2躍遷;在Eu3+-Tc體系中添加Glyp后,615 nm處的熒光強度顯著增強(是Eu3+-Tc體系熒光強度的1.5倍),表明Glyp與Eu3+-Tc絡合物形成穩定的Eu3+-Tc-Glyp三元絡合物,使Eu3+-Tc體系的熒光通過分子內能量轉移得到增強。Glyp是一種高親水性的氨基酸類化合物,含有胺基、羧酸和膦酸等官能團,在堿性環境中可與金屬離子形成強配位的二元或三元絡合物[22-23]。Eu3+-Tc絡合物的物質的量比為1…1,在水溶液中Eu3+的配位是不飽和的(Eu3+的配位數通常為8)[13],因此水分子容易與Eu3+-Tc絡合物的剩余空軌道配位。在堿性條件下,Glyp可以通過取代水分子配體,與Eu3+-Tc絡合物形成穩定的雙五元環結構(圖2)。隨著水分子配體的釋放,水分子O-H振動引起的非輻射能量損失減小,使得Eu3+-Tc-Glyp體系的熒光強度增大。

圖2 Eu3+-Tc-Glyp絡合物的雙五元環預測構型Fig.2 Expected bi-five-ring configuration of Eu3+-Tc-Glyp complex

2.2 測定條件的優化

2.2.1 體系酸度

為考察Eu3+-Tc-Glyp體系的最佳反應酸度,使用酸度分別為pH 7.0,8.0,10.0,11.0的緩沖溶液[24]測定了體系的ΔF值,結果見圖3。

圖3 酸度對體系ΔF值的影響Fig.3 Effect of acidity on ΔF value of the system

結果表明：在pH 7.0,8.0條件下,體系的ΔF值較小,可能是Glyp部分解離,只能與Eu3+-Tc絡合物形成一元或二元絡合物,因此不能有效阻止非輻射能量損失;在pH 9.0,10.0條件下,體系的ΔF值明顯增強,這是因為在較強堿性條件下Glyp分子全部解離生成陰離子(Glyp的pKa3=10.25)[4],從而能夠形成穩定的雙五元環構型絡合物,有效地減少了非輻射能量損失,使熒光強度得到增強;隨著pH繼續增大,ΔF值開始下降,這是因為溶液中的OH-產生競爭性配位。因此,試驗選擇的體系酸度為pH 10.0。

2.2.2 Eu3+與Tc的物質的量比

固定Glyp濃度為1.0×10-5mol·L-1,考察了Eu3+與Tc的物質的量比分別為0.1…1,2…1,4…1,6…1,8…1,10…1,20…1時對體系ΔF值的影響,結果如圖4所示。

圖4 Eu3+與Tc的物質的量比對體系ΔF值的影響Fig.4 Effect of molar ratio of Eu3+ to Tc on ΔF value of the system

結果表明：當Eu3+與Tc物質的量比為0.1…1～6…1時,體系的ΔF值先增大后基本保持不變;當Eu3+與Tc物質的量比大于6…1時,體系的ΔF值降低。試驗選擇Eu3+與Tc物質的量比為5…1,進一步對Eu3+和Tc濃度進行了優化。結果發現：Tc濃度過高,易發生PMT飽和;Tc濃度過低,體系熒光強度較低,導致ΔF值變化不明顯,影響測定靈敏度。因此,試驗最終選擇的Eu3+濃度為1.5×10-2mol·L-1,Tc濃度為3.0×10-3mol·L-1。

2.3 干擾試驗

為考察灌溉水中可能存在的干擾物,如草銨膦、氨甲基膦酸、結構類似的氨基酸以及水環境中常見的金屬離子和陰離子對Glyp測定的影響,在上述最佳測定條件下,向若干組1.0×10-6mol·L-1Glyp標準溶液中加入了不同濃度的干擾物,測定了加入后體系熒光強度與加入前體系熒光強度的比值(相對熒光強度),結果見表1。

表1 干擾物對體系相對熒光強度的影響

2.4 Glyp分子印跡固相萃取膜制備條件的優化

用0.1 mol·L-1鹽酸溶液將TEOS、無水乙醇和水的混合溶液酸度調節至pH 1.0,2.0,3.0,得到不同酸度的Glyp分子印跡溶膠,同時考察了洗脫時間分別為0,15,30,45,60 min時Glyp分子印跡溶膠的電位變化,結果如圖5所示。

圖5 酸度和洗脫時間對電位差的影響Fig.5 Effects of acidity and elution time on the potential difference

結果表明：隨著pH的減小和洗脫時間的延長,電位差逐漸增大;在pH 1.0條件下洗脫不小于45 min,電位差較大且基本保持穩定。因此,試驗選擇制備Glyp分子印跡溶膠的酸度為pH 1.0,洗脫時間為45 min。

2.5 Glyp分子印跡固相萃取膜的重復性和穩定性

用1.0×10-5mol·L-1Glyp標準溶液浸泡45 min Glyp分子印跡固相萃取膜,利用OHP電極測定浸泡液的電位差;然后將Glyp分子印跡固相萃取膜脫附并干燥處理后,再次浸泡在Glyp標準溶液中,重復上述過程5次,計算電位差的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,電位差的RSD為3.2%,表明Glyp與分子印跡固相萃取膜上的空穴的結合是一個可逆過程,Glyp分子印跡固相萃取膜可以重復多次使用。

按照同樣的方法,對使用兩周前后的Glyp分子印跡固相萃取膜的浸泡液進行測定。結果顯示,電位差僅降低了4.4%,表明Glyp分子印跡固相萃取膜的穩定性良好。

2.6 標準曲線和檢出限

按照1.2.2節試驗方法測定濃度為1.0×10-8,5.0×10-8,5.0×10-7,1.0×10-7,2.0×10-6,5.0×10-6,1.0×10-5,1.5×10-4,1.0×10-4,1.0×10-3,3.0×10-3mol·L-1的Glyp標準溶液系列,以Glyp濃度對數為橫坐標,對應的體系ΔF值為縱坐標繪制標準曲線。結果表明：線性回歸方程為ΔF=260.5×lgc+211 3,線性范圍為5.0×10-8～1.5×10-4mol·L-1,相關系數為0.999 8。

以3s/k(其中s為3次空白信號的標準偏差,k為線性回歸方程的斜率)計算檢出限,結果為1.0×10-8mol·L-1。

2.7 樣品分析和回收試驗

按照1.2.2節試驗方法分析3份灌溉水樣品和3份土壤樣品,并與電化學法[26]進行比較,結果見表2。

表2 樣品分析和比對結果

由表2可知,本方法和電化學法的測定結果基本一致。試驗進一步采用標準加入法對灌溉水樣品1進行了加標濃度水平為1.69 μg·kg-1的回收試驗,結果顯示Glyp回收率為101%,表明該方法準確度較高。

本工作基于Glyp作為輔助配體與Eu3+-Tc生成三元絡合物表現的熒光增強現象,結合Glyp分子印跡固相萃取前處理技術,建立了Glyp的熒光分析方法。該方法的檢出限低,線性范圍較寬,抗干擾能力強,能夠應用于環境水及土壤中草甘膦殘留量的測定。