體外生產紅細胞：進展與挑戰

王 輝，張進進，陳立力，邢顏超

1新疆醫科大學研究生院，烏魯木齊 830054 2新疆軍區總醫院輸血醫學科，烏魯木齊 830000

血液短缺是世界范圍內的普遍問題。臨床上使用的血液主要來源于公民無償獻血，2021年我國千人獻血率僅為12%[1]，臨床用血需求與獻血量之間存在巨大缺口。特別是COVID-19暴發后，健康獻血者減少等因素使多地血液庫存告急，捐獻血液的供需矛盾在突發衛生事件發生時更加突顯。此外，傳統輸血還有可能傳播疾病和導致同種異體免疫風險[2]。研究者們曾使用全氟化氮等氧氣載體試圖替代捐獻血液，但由于其具有副作用，僅可在特殊情況下使用，無法替代紅細胞輸注[3]。目前研究主要集中于體外生產紅細胞，從理論出發，采用此種技術生產的紅細胞可大量擴增，若能進一步證明其安全有效，則將成為紅細胞捐獻的理想替代品[4]。本文就體外生產紅細胞的來源及應用(圖1、表1)進行綜述，并分析目前所面臨的挑戰，以期為輸血治療提供新思路。

表1 不同途徑體外生產紅細胞的區別Tab.1 Differences in in vitro production of red blood cells by different approaches

圖1 體外生產紅細胞的來源及應用Fig.1 Sources and applications of red blood cells produced in vitro

1 體外生產紅細胞的來源

1.1 多能干細胞

1.1.1 人胚胎干細胞分化為紅細胞

胚胎干細胞最突出的優點是無限的自我更新能力，可在適當培養條件下分化為多種細胞。最初研究者們對這一來源十分樂觀，然而實驗結果卻并不盡如人意。研究者們使用血管內皮生長因子、干細胞因子、白細胞介素等細胞因子成功從人胚胎干細胞中分化出紅細胞，但得到的紅細胞擴增率和去核率均不理想，終末期成熟也受到限制[10-12]，相關研究在過去10余年間進展緩慢，且人胚胎干細胞的使用在倫理上飽受爭議，因此研究者們對這一途徑的關注度逐漸降低。值得注意的是，Wang等[5]發現人胚胎干細胞衍生的紅細胞中，細胞周期相關基因的表達水平較臍帶血來源的紅細胞顯著降低，這一發現有助于提高擴增率。

1.1.2 人誘導多能干細胞分化為紅細胞

通過轉錄因子從人體細胞中誘導產生的多能干細胞，其性質類似于胚胎干細胞[13]。由于人誘導多能干細胞來源廣泛，且無倫理和免疫排斥問題，很快受到研究者的關注。隨著研究的推進，人誘導多能干細胞存在的問題也逐漸暴露出來，如需復雜的造血分化系統來獲得造血干細胞、生產的紅細胞表現出原始紅細胞特征、擴增率和去核率低[14-15]，限制了其實用性。因此，探索人誘導多能干細胞分化為紅細胞的過程、改進分化方法以及提高去核率是近年來研究者們關注的重點。Trakarnsanga等[16]研究了人誘導多能干細胞來源的紅細胞分化期間波形蛋白的表達，表明此類細胞會在分化早期失調，影響去核率。而Bernecker等[6]構建了更加簡單靈活且低成本的模型，該方法生產的紅細胞可達到平均40%的去核率。

以人胚胎干細胞和人誘導多能干細胞為來源建立的細胞系在擴增潛力和基因編輯可行性方面較其他來源更勝一籌，但較低的擴增率和去核率制約了這一來源的發展。令人驚喜的是，人誘導多能干細胞在改進了分化方法后為該途徑注入了新的希望，值得持續關注。

1.2 臍帶血

臍帶血含有的未成熟原始祖細胞具有優越的增殖和分化潛力。1 U臍帶血的紅細胞產量在理論上相當于500 U紅細胞，且臍帶血很少會被血源性感染因子污染或者發生衰老相關的細胞異常[13]。因其擴增潛力大、不易污染且易獲取，研究者曾嘗試從臍帶血衍生的造血干細胞中擴增紅細胞。Zhang等[17]在小鼠和非靈長類動物模型中驗證了臍帶血可生產有效的功能性人紅細胞，特別是使用了轉瓶裝置使紅細胞產量大增。Rallapalli等[7]使用注射藥物替代培養基中的動物源性成分，從人臍帶血中分離出的單核細胞生成紅細胞。Xie等[18]認為除繼續突破技術難題外，還應盡早制訂細胞鑒定、純度、安全性和有效性相關質控指標，進一步推動臍帶血來源紅細胞的臨床應用。但這一來源因其原始細胞數量有限、生產的紅細胞為胎兒表型而非成人表型，限制了其臨床轉化。

1.3 外周血

外周血是最易獲取的來源，目前無須分離CD34+細胞，直接使用外周血單核細胞體外生產紅細胞已得到研究者的普遍認可。使用外周血作為來源在體外生產紅細胞的研究主要聚焦于提高擴增量，Heshusius等[19]利用生物反應器可擴增3×106倍，Liu等[8]通過BMI1基因的異位表達使轉導紅細胞擴增1012倍，且隨著研究方案的不斷改進，紅細胞產量呈指數增加，去核率可達90%，在血紅蛋白和血型的表達、變形性、氧飽和度等方面均與正常成人紅細胞相似[19]。此外，由于外周血的供應很大程度上依賴于健康志愿者，因此難以避免倫理問題[13]。從需要分離CD34+細胞到直接使用單核細胞，再到生物反應器的加入，外周血來源生產紅細胞的擴增量不斷提升，且該技術限制少，有望最先成為捐贈血液的替代來源。

1.4 永生化紅系祖細胞系

永生化紅系祖細胞系是由影響細胞周期的病毒誘導的，可長時間穩定增殖并分化產生大量紅細胞的細胞系[20]，近年來成為探索體外生產紅細胞途徑的研究熱點，主要涉及兩種永生化紅系祖細胞系，其中HUDEP-2(human umbilical cord blood derived erythoid progenitor-2)是Kurita等[21]于2013年建立的第一個體外生產去核紅細胞的永生化人紅細胞系，其使用四環素誘導系統構建表達人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16-e6/e7基因的慢病毒載體以誘導臍帶血來源的CD34+細胞產生HUDEP-2。而BEL-A(bristol erythr-oid line adult)則是2017年Trakarnsanga等[22]報道的第一個完全重現正常紅細胞生成的永生化紅系祖細胞系。在該研究中，來自成人骨髓的CD34+細胞經過培養去核產生的成熟網織紅細胞，與成人網織紅細胞在功能和分子水平上均無差異。與HUDEP-2相比，BEL-A的分化速率、紅細胞產量、γ珠蛋白水平均更高[23]。然而從骨髓中分離CD34+細胞的高度侵入性限制了這一研究的發展，因此研究者嘗試從更易獲得的外周血中建立永生化紅系祖細胞系。2021年，Bagchi等[24]從外周血單核細胞中生成了永生化紅系祖細胞系，在形態、紅細胞特異性表面標志物、增殖分化能力及去核率方面均優于HUDEP-2，且與BEL-A相似。Daniels等[9]使用BEL-A的永生化方法從臍帶血和外周血中亦成功生成了BEL-C和BEL-P細胞系，二者在蛋白質組、珠蛋白表達、分化譜等方面分別表現出胎兒及成人紅細胞的特征。此外，最新研究指出，即使不終止HPV16 e6/e7的表達，從骨髓建立的永生化紅系祖細胞系也能進行正常分化[25]。需要注意的是，目前所建立的永生化紅系祖細胞系需由病毒轉化，這可能會影響細胞特征，對其未來應用產生一定限制。但永生化紅系祖細胞系仍展現出非凡的潛力，不僅對研究紅細胞生成過程有重要意義，而且穩定可重復，有利于新型治療產品的研發，相信未來將有更多針對該技術的改進和擴展。

2 體外生產紅細胞的應用

2.1 臨床輸血治療

紅細胞是主要的血液輸注成分，但來自獻血者的紅細胞不足以滿足臨床需求，且輸血存在傳播疾病的潛在風險。體外生產的紅細胞在擴增能力和安全性等方面均展現出令人滿意的前景。近期研究表明，BMI1轉導的成人紅細胞擴增倍數可以達到1012倍，并且保留了末端分化成熟的能力，去核率近50%[8]。除了巨大的擴增潛力，體外生產的紅細胞在安全性上也更具優勢，不僅無傳播疾病的風險，且可以生產出缺少血型抗原的通用型紅細胞，突破目前血型分型方法的限制[26]，避免不匹配的輸血所導致的嚴重后果，這對于稀有血型人群意義非凡。體外大規模生產紅細胞用于全面的臨床輸血治療尚需時日，但優先生產少量通用型紅細胞用于稀有血型人群相信為時不遠。此外，Kupzig等[27]首次報道了體外生產的紅細胞較傳統紅細胞的存活時間更長，這說明體外生產的紅細胞更加年輕，對于需要長期依賴輸血治療的患者，可延長輸血的時間間隔，減少多次輸血帶來的鐵沉積不良反應等問題。

2.2 疾病模型研究

目前，在探索體外生產紅細胞的過程中取得了諸多技術突破，為利用體外生產紅細胞技術制定疾病研究新策略帶來更多可能。Trakarnsang等[28]利用血紅蛋白E/β-地中海貧血患者的外周血干細胞分化出早期紅細胞并生成永生化紅系祖細胞系的疾病模型，了解患者紅系細胞的球蛋白譜和無效紅細胞生成水平，該模型可用于研究疾病機制和篩選新療法，且能提供可持續的疾病細胞用于研究。紅細胞是瘧原蟲無性復制的宿主，瘧疾入侵和發育需要紅細胞蛋白參與，然而這一過程的具體機制尚不明確，Satchwell等[29]研究表明，BEL-A體外分化產生的網織紅細胞支持惡性瘧原蟲的侵襲和細胞內發育。此外，體外生產紅細胞技術可持續產生用于研究的紅細胞，為遺傳學操作提供了可能，有助于瘧疾相關發病機制研究[30]。這一技術克服了成熟紅細胞無核的限制，實現了基因編輯技術的應用，使研究者對細胞學機制的探索有了新的切入點。

2.3 生物治療

以細胞膜包裹納米藥物進行遞送是近年來備受關注的治療熱點，基于細胞膜的仿生納米顆粒能夠逃離免疫系統監視，將藥物靶向遞送至病變部位。紅細胞及其囊泡是膜的最佳來源，具有高生物相容性、低免疫原性、表面可修飾等優點，還可改善負載藥物的穩定性，提高低滲透性藥物的生物利用度，增強治療效果[31-33]。目前已有諸多以紅細胞及其囊泡為遞送介質遞送藥物的治療方法，且用于三陰性乳腺癌、胰腺癌、共濟失調毛細血管擴張等疾病的治療已進入Ⅲ期臨床試驗[34-35]?；诩t細胞進行研究和應用的關鍵之一是獲取大量紅細胞，傳統方法是將捐獻血液離心，分離出紅細胞，這一過程會使紅細胞失去大量血紅蛋白，同時膜的性質也會發生改變，導致藥物輸送效率降低[31]，而體外生產紅細胞可為研究者提供大量獲取紅細胞的新方式，極大促進該領域的發展[36]。因此以紅細胞及其囊泡為遞送介質進行生物治療是體外生產紅細胞技術最實用的應用方向。

3 體外生產紅細胞面臨的挑戰

3.1 功能與壽命

為使體外生產的紅細胞攜氧、變形等能力與天然紅細胞相當，確保紅細胞的正常功能以及降低致瘤風險，需要去除細胞核，這也是體外生產紅細胞的關鍵技術之一[11，37]。過去10年間，紅細胞相關分子機制和信號通路相關研究眾多，但僅有組蛋白脫乙?；?(histone deacetylase2，HDAC2)被證實在體外產生紅細胞的去核過程中發揮重要作用[38-39]。近幾年體外生產紅細胞主要通過各種紅系分化培養基誘導紅細胞成熟，然后過濾純化獲取無核紅細胞，然而尚缺乏去除細胞核的具體方法。目前有研究認為巨噬細胞與紅細胞去核有關，在去核階段添加模擬巨噬細胞幼紅細胞黏附蛋白(erythroblast macrophageprotein，EMP)可作為新的去核方法[20，40]。此外，研究發現盡管不同細胞來源的體外生產的紅細胞攜氧能力有所不同，但其表現均與相應的成人紅細胞類似，這種差異可能是由血紅蛋白的表達類型不同造成的[21-22]，而就體外生產的紅細胞壽命而言，研究者將成人供體紅細胞和體外生產的紅細胞輸注進小鼠體內，二者的存活率無統計學差異[22]。在另一項研究中，體外生產的紅細胞輸注后的半衰期為26 d[37]，也與天然紅細胞的壽命一致，尚有待體內試驗進一步加以驗證。

3.2 生產規模受限

體外生產紅細胞技術為大規模生產紅細胞提供了可能性，但既往大部分研究中的生產規模較小，若要實現生產更多數量的紅細胞，則需借助生物反應器[17，19，41]。相較于燒瓶，生物反應器數據更加可靠，還可降低勞動成本，縮小生產所需空間，減少人為錯誤[42]。雖然由于技術的限制，目前尚無可滿足需要的生物反應器[43]，但最新研究中生物反應器的培養體積已從300 mL擴大至2500 mL[44]。生物反應器的技術亟待改善，體外生產紅細胞的高成本也是臨床應用的主要障礙。針對這一問題，研究者提出可選擇不需要CD34+分離的起始細胞，替換培養成分中的昂貴成分，增加培養細胞密度等方式降低生產成本[17，19，42]。

3.3 輸血可行性測試尚少

Giarratana等[45]2011年首次將體外生產的紅細胞輸注到人體內，為其應用于臨床輸注提供了研究證據。Zhang等[17]在小鼠和非人靈長類動物模型中進行體外產生紅細胞的安全性研究，經過對血細胞計數、血液生化、食欲、行為等參數的分析，未發現注射體外生產紅細胞的不良影響。此外，小鼠和靈長類分別在注射后6個月、18個月正常存活，說明輸注體外生產的紅細胞具有長期安全性，這在一定程度上表明體外生產的紅細胞可作為傳統血液成分的替代品。一項RESTORE(REcovery and survival of STem cell Originated REd cells)試驗報道了世界上首個同種異體輸血臨床試驗，該試驗納入超過10名志愿者并接受來自其他供體的體外生產紅細胞的輸注，表明體外生產紅細胞對稀有血型和有復雜輸血需求的患者治療具有重要意義[46]。體外生產的紅細胞能夠在循環中存活，但是否可安全用于人體仍有待更多研究。

4 小結與展望

體外生產紅細胞是一項艱巨的生物技術挑戰。在過去幾年間，研究者們突破重重困難，優化了培養體系，提高了擴增率和去核率。雖然使用“人造紅細胞”代替捐獻血液還有很長的路要走，但體外生產紅細胞對于輸血治療具有重要意義。這一技術將推進疾病模型的構建、納米藥物的遞送以及輸血治療的發展，為輸血治療提供新的可能。未來需進一步探索體外去核方法且兼顧生物反應器的高產能與低成本，以及開展更多相關研究以證實體外生產的紅細胞輸注于人體安全可行。

作者貢獻：王輝負責文獻檢索及論文撰寫；張進進、陳立力負責論文修訂；邢顏超負責選題設計及論文審校。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突