楚雄南苜蓿根瘤菌的鑒定及其耐酸耐鋁特性研究

黎梅杰 段正山 鄧宗澳 羅富成 段新慧 韓博

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.009

引用格式：

黎梅杰， 段正山， 鄧宗澳，等.楚雄南苜蓿根瘤菌的鑒定及其耐酸耐鋁特性研究［J］.草地學報，2024，32（1）：87-95

LI Mei-jie， DUAN Zheng-shan， DENG Zong-ao，et al.Identification of Rhizobium of Medicago Polymorpha L. and Its Resistance to Acid and Aluminum［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：87-95

摘要：為了獲得耐酸鋁性強的楚雄南苜蓿（Medicago polymorpha L.）共生根瘤菌菌株，本研究對從不同地區采集到的5份根瘤樣品進行分離、純化和鑒定。對鑒定得到的根瘤菌進行菌體形態觀察、低氮回接以及耐酸、鋁特性的研究。結果表明：YS-8，YS-10，DH-9，DH-31屬于根瘤菌屬根瘤菌、CX-44屬于中華根瘤菌屬苜蓿中華根瘤菌，5個菌株均符合根瘤菌基本形態特征。接種5株根瘤菌后，楚雄南苜蓿的干重、鮮重、株高、結瘤數均顯著高于對照（P＜0.05）；pH值在4.5～7.5范圍內，5株菌株均能正常生長，當pH值=3.5時，5株菌株全部死亡；當Al3+濃度在100～1 500 mg·L-1之間，隨著Al3+濃度的升高，菌株生長逐漸緩慢，Al3+濃度達到2 000 mg·L-1時，5株菌株全部死亡。分離出的5株根瘤菌均能與楚雄南苜蓿共生結瘤并促進其生長，且具有較強的耐酸鋁性。篩選出的5株根瘤菌均能在pH值大于3.5且鋁離子濃度（pH值=5）小于1 500 mg·L-1的條件下推廣使用，菌株CX-44的效果最佳。

關鍵詞：酸性土壤；楚雄南苜蓿；共生根瘤菌；抗酸鋁菌株

中圖分類號：S153.6??? 文獻標識碼：A????? 文章編號：1007-0435（2024）01-0087-09

Identification of Rhizobium of Medicago Polymorpha L. and

Its Resistance to Acid and Aluminum

LI Mei-jie1， DUAN Zheng-shan2， DENG Zong-ao1， LUO Fu-cheng1， DUAN Xin-hui1*， HAN Bo1*

（1. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan Province 650201， China;

2. Agricultural and Rural Service Center of Caiyun Town， Lufeng City， Lufeng， Yunnan Province 651219， China）

Abstract：In order to obtain the strains of symbiotic rhizobium of Medicago polymorpha L. with strong acid and aluminum resistance，five nodule samples collected from different regions were isolated，purified and identified. The identified rhizobia were studied for bacterial morphological observation，low nitrogen backconnection，acid resistance and aluminum resistance. The results showed that YS-8，YS-10，DH-9 and DH-31 belonged to Rhizobium sp，CX-44 belonged to Sinorhizobium medicae，and the five strains all conformed to the basic morphological characteristics of rhizobia. After inoculation with 5 rhizobia strains，the dry weight，fresh weight，plant height and nodulation number of Medicago polymorpha L. were significantly higher than those in the control;In the range of 7.5～4.5 pH，all 5 strains growed normally，and when pH was 3.5，all 5 strains died;When Al3+ concentration was between 100～1 500 mg·L-1，the growth of the strains gradually slowed down as the Al3+ concentration increased，and when the Al3+ concentration reached 2 000 mg·L-1，all 5 strains died. The isolated five rhizobia strains could coexist with Medicago polymorpha L. and promote their growth，and had strong acid aluminum resistance. The five screened strains of rhizobia could be popularized and used under the condition of pH greater than 3.5 and aluminum ion concentration （pH=5） less than 1 500 mg·L-1，and the strain CX-44 was the best.

Key words：Acidic soil;Medicago polymorpha L.;Symbiotic rhizobia;Acid-fast aluminum strains

收稿日期：2023-06-15；修回日期：2023-10-19

基金項目：云南省基礎研究面上項目（202101AT070206）；國家自然科學基金青年基金（32301489）；洱源縣飼草產業科技特派團（202304BI090008）資助

作者簡介：

黎梅杰（1997-），女，彝族，云南文山人，碩士研究生，主要從事草類種質資源與利用研究，E-mail：2293585796@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：xinhuiduan@aliyun.com；hanbo1983@126.com

隨著我國南方畜牧業的快速發展，優質豆科牧草的重要作用已引起重視，但由于南方土壤大多偏酸性，從而使紫花苜蓿（Medicago sativa）等優質豆科牧草的推廣種植受到極大的限制，不能滿足南方畜牧業的快速發展。因此，迫切的需要挖掘耐酸性較強的豆科牧草資源或找到提高豆科牧草耐酸性的方法，以滿足畜牧業的快速發展。楚雄南苜蓿（Medicago polymorpha L.）是豆科苜蓿屬一年生或越年生草本植物，是能在酸性土壤中快速生長的優質豆科牧草之一［1］。作為云南省地方豆科牧草品種，楚雄南苜蓿已有60多年的栽培種植歷史，具有飼用價值高、固氮能力強、耐寒、耐旱、耐酸鋁等特點［2-4］，為畜牧業的發展做出巨大的貢獻［5-6］。楚雄南苜蓿能在酸性土壤中生長發育，除了與本身具有較強的耐酸、鋁性有關外，還與其共生根瘤菌具有較強的耐酸鋁性，能在酸性條件下存活并發揮共生固氮作用有很大的關系。

根瘤菌是與豆科植物結瘤的共生固氮細菌的總稱，根瘤菌共生有利于豆科牧草在逆境條件下的結瘤固氮和生長發育［7-9］，從而增加植株生物量、粗蛋白含量及葉片中氮、磷等的含量。有大量研究表明，在酸、鋁脅迫下豆科牧草接種根瘤菌有利于共生系統的形成，可以促進牧草的生長并提高其產量和品質［10-13］，是提高豆科牧草在酸性土壤中生長最經濟有效的途徑。因此篩選酸性條件下耐鋁共生根瘤菌，是推動楚雄南苜蓿推廣種植及提高牧草耐酸鋁性的關鍵因素。本研究從云南省楚雄州、文山州、德宏州三個地方采集到5份楚雄南苜蓿根瘤樣品，并對其進行分離和純化，利用分子鑒定和水培回接技術確定其共生根瘤菌菌株，并在此基礎上研究這些候選根瘤菌的耐酸、鋁特性，為楚雄南苜蓿在南方酸性土壤中的推廣利用及其他豆科牧草共生根瘤菌的選育提供理論和技術支撐。

1? 材料與方法

1.1? 根瘤采集地點

楚雄南苜蓿根瘤樣品分別采自云南省楚雄州、文山州和德宏州。

1.2? 根瘤樣品采集及保存方法

于楚雄南苜蓿初花期采集新鮮健壯、顏色鮮艷的根瘤，剪時稍帶一段根，編號并記錄采集時間、地點，將采集樣品放于25%甘油管中密封，4℃冰柜中冷藏保存備用。

1.3? 根瘤菌株的分離純化

用剪刀將新鮮的根瘤（帶部分根）從根部分離，用水多次沖洗后，使用NaClO滅菌3分鐘，75% 乙醇滅菌5 min，無菌水沖洗10次后，在無菌條件下，用鑷子將根瘤壓碎，擠出汁液涂布在酵母甘露醇瓊脂（Yeast mannitol agar，YMA）固體培養基上，28℃倒置培養 3～4 d。挑取乳白色、粘稠狀的菌落，采用劃線分離法直至獲得單菌落，觀察記錄菌的形態、大小、透明度、粘稠度、顏色等［14］。

1.4? 根瘤菌菌株的鑒定

1.4.1? 根瘤菌菌株的 16S r RNA基因序列比對及系統發育分析? 根瘤菌DNA的提?。簻y試菌株在酵母甘露醇肉湯（Yeast Extract Mannitol Broth，YMB） 液體培養基中震蕩培養（3～5 d） 至對數期，按照Wilson［15］的方法提取DNA，將在1%瓊脂糖凝膠上檢測合格的PCR產物送至上海生物工程公司測序。

使用DNAMAN將測序結果拼接完整，登錄NCBI，將合格的16S rRNA序列及其他信息提交GenBank，錄入數據庫。在GenBank中查找下載相似性高的菌株序列，而后用MEGA11軟件進行序列比對及系統發育樹的構建，系統發育樹的構建采用鄰接法［16-18］。

1.4.2? 根瘤菌株的形態學鑒定? 在YMA平板上28℃培養 72 h后觀察菌落形態特征；參照李旭東［19］的方法進行革蘭氏染色，于光學顯微鏡下觀察菌體形態、大小，并利用MvImage vt軟件照相，電鏡掃描由塞維爾公司使用掃描電鏡HITACHI Regulus 8100完成。

1.4.3? 低氮水培回接? 楚雄南苜蓿種子用75%酒精滅菌后進行催芽，當胚根長至3～5 cm時將幼苗移植于裝有低氮營養液的試管（3 cm×22 cm）中，每個試管中移植3株，當幼苗長出第一片真葉時，接種1.5 mL OD值≈0.8的根瘤菌培養液［20-21］，以不接種為對照，每個菌種設置3個生物學重復，定期補充低氮營養液，培養45 d后測定植株鮮重、干重、株高、根長和結瘤數。

1.5? 耐酸耐鋁根瘤菌菌株的特性研究

1.5.1? 共生根瘤菌的耐酸性研究? 將5株根瘤菌分別接種于pH=7的YMA液體培養基中培養活化，調節根瘤菌培養液OD值為0.8 后，分別取 2.5 mL菌液接種于不同pH值（7.5，6.5，5.5，4.5，3.5）條件下的YMA液體培養基中，在28℃恒溫條件下振蕩培養，培養期間每 12 h測一次培養液OD值，連續培養 72 h，并繪制生長曲線圖，判斷根瘤菌生長情況［22-23］。用1% HC1溶液和NaOH溶液調節YMA液體培養基pH值。

1.5.2共生根瘤菌的耐鋁性研究? 在pH=5條件下，不同Al3+濃度（0，100，500，700，1 000和1 500 mg·L-1）對其生長的影響。根瘤菌的活化、接種、培養與OD值的測定及YMA液體培養基pH值的調節同1.5.1。

1.6? 數據分析

采用Excel 2010整理數據，Origin2018繪制圖表，SPSS 18.0進行統計學分析，MEGA軟件構建系統發育樹。

2? 結果與分析

2.1? 根瘤菌菌株的種類鑒定

分離培養的楚雄南苜蓿根瘤菌的種屬鑒定結果見表1：在44個菌株中共鑒定出根瘤菌5株，其余39個菌株為與根瘤菌一起共生的根瘤內生細菌，分屬10個屬24個種，分別為Klebsiella（克雷伯氏菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Enterobacter （腸桿菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Erwinia（歐文氏菌屬）、Paenibaciiius （類芽孢桿菌屬）、Arthrobacter（節桿菌屬）、Burkholderia（伯克霍爾德氏菌屬）、Acinetobacter（不動細菌屬）、Sinorhizobium（中華根瘤菌屬）。利用MEGA11.0軟件對5株代表菌株和模式典型菌株的16S rDNA序列進行Neighbor-Joining分析，在GenBank中下載的模式菌株與供試菌株相似性和同源性都達到99%。由圖1可知：所有供試菌株和參比菌株在系統發育上分為兩大分支，菌株DH-31和菌株CX-44在系統發育上共同構成一個分支，分別與模式菌株Rhizobium sp. KC243305.1和Sinorhizobium medicae KR827437.1以100%的相似性聚在一起，菌株DH-9和YS-8，YS-10共同構成一個分支，其中DH-9與模式菌株Rhizobium sp. KJ184944.1以98%的相似性聚在一起構成一個小分支，YS-8，YS-10分別與模式菌株Rhizobium sp.MT974183.1：1-1379，Rhizobium sp.MT974183.1：1-1379以76%和86%的相似性聚在一起構成一個小分支。說明菌株CX-44屬于根瘤菌科根瘤菌屬苜蓿中華根瘤菌，YS-8屬于根瘤菌科根瘤菌屬根瘤菌，YS-10，DH-9，DH-31屬于根瘤菌科根瘤菌屬根瘤菌。

2.2? 菌株形態特征觀察

對分離鑒定出的5株根瘤菌進行染色和培養后，觀察各菌株的菌體形態特征。觀察發現，在YMA培養基上培養 3 d可形成直徑 0.3～0.9 cm的菌落，菌落為圓形，表面凸起光滑，半透明，邊緣整齊（圖2）。5株菌株菌體形態均為短桿狀，革蘭氏染色陰性，鞭毛側生或頂生，能運動，長短各不相同，菌體表面有莢膜或無莢膜，符合根瘤菌的基本形態特征（圖3，圖4）。

2.3? 低氮回接實驗

用5株根瘤菌回接楚雄南苜蓿后，均能使南苜蓿結瘤，而未接種的植株（CK）上未發現根瘤，證明這5株根瘤菌均為南苜蓿共生根瘤菌。如表2所示，接種5株根瘤菌40 d后南苜蓿干重、鮮重、株高、結瘤數均顯著高于CK（P<0.05），但CK的根長顯著高于接種菌株；接種菌株CX-44后，除根長外，南苜蓿干重、鮮重、株高等指標均顯著高于CK和其它幾種菌株（P<0.05）。

由圖5、圖6所示，與接種根瘤菌的植株相比，未接種根瘤菌的植株在低氮情況下生長較緩慢，且葉片逐漸枯萎變黃，植株較矮小，主根長，側根少，接種根瘤菌的植株葉片顏色更綠，生長更快，植株更繁茂，根系更為發達，側根明顯多于CK。

2.4? 根瘤菌在不同酸性條件下的生長特性

不同pH值條件下鑒定出的5株根瘤菌的生長曲線如圖7所示，pH=7.5，6.5，5.5，4.5時5株菌株均有遲緩期、對數期生長期、穩定期、衰退期，符合根瘤菌的生長規律，5株根瘤菌的OD值均在pH=3.5時接近0，pH=7.5時5株菌株的OD值相差不大，但CX-44的值要稍大于其他4株，pH=6.5時YS-10和DH-31達到穩定期時的OD值較大，但達到衰退期后相差不大，pH=5.5時，5株菌株穩定期的OD值相近，pH=4.5時，CX-44，DH-31和YS-10在穩定期的OD值大于其他菌株。說明5株根瘤菌均有較強的耐酸性，其中YS-10，DH-31，CX-44表現比較突出。

2.5? 酸性條件下根瘤菌在不同鋁濃度下的生長特性

不同鋁離子濃度下根瘤菌的生長特性如圖8所示，在鋁離子為100～1 000 mg·L-1范圍內，5株根瘤菌均能完成生長，且具有明顯的遲緩期、對數期生長期、穩定期和衰退期，鋁離子為1 500 mg·L-1時，5株根瘤菌的OD值都小于0.2，2 000 mg·L-1時5株根瘤菌OD值接近0。鋁離子為500 mg·L-1時，穩定期時DH-9和CX-44的OD值較大，YS-8的OD值較小，當鋁離子升至700 mg·L-1和1 000 mg·L-1時，穩定期CX-44的OD值明顯高于其余4株根瘤菌，而菌株YS-8，DH-9，YS-10，DH-31的OD值相差不大，說明5株菌株均有較強的耐鋁能力，其中分離自楚雄的南苜蓿根瘤菌CX-44耐鋁能力最好。

3? 討論

近年來，隨著分子生物學技術的快速發展，對微生物的鑒定技術已不再局限于形態學、細胞組分和生理生化特性等鑒定，而是深入到核酸水平，在分子水平上實現了根瘤菌的快速鑒定，為根瘤菌的鑒定及應用提供理論依據［24］。因此本研究利用16SrRNA基因測序技術對分離出的根瘤菌進行測序并在基因庫中進行比對鑒定，16SrRNA基因序列分析表明分離純化得到的菌株多數為除根瘤菌以外的細菌，說明在楚雄南苜蓿根瘤內存在大量能與根瘤菌共生的細菌，這些細菌或許與根瘤菌的共生固氮功能息息相關，而是否對楚雄南苜蓿的固氮以及促進根瘤菌結瘤固氮發揮一定的作用還需進一步驗證。國內外有對豆科根瘤中的細菌進行的研究報道［25-27］，研究表明植株根瘤中有多種具有固氮功能的微生物，如根瘤菌屬微生物的土壤桿菌［28］、類芽孢桿菌和芽孢桿菌［29］等對豆科植物的增產增效起到重要的作用。

低氮回接實驗是檢測根瘤菌是否具有共生固氮能力常用的方法［30］，在對5株根瘤菌進行低氮回接實驗時發現，未接種根瘤菌的植株并未發現根瘤，說明本實驗排除了楚雄南苜蓿種子內存有根瘤菌而使實驗結果出現誤差的可能性。在低氮回接實驗中發現，5株菌株均能與宿主結瘤固氮，接種根瘤菌后植株的株高、鮮重、干重都明顯高于CK，說明接種根瘤菌能提高豆科牧草的固氮能力，促進牧草的生長并提高其產量，這與前人的研究一致［31］。分離自楚雄的菌株CX-44的回接效果要優于其余4株，說明不同的菌株的接種效果不同，有相關報道也表明了從同一宿主中分離得到的不同根瘤菌與宿主具有不同的共生能力［32-34］，因此篩選出與楚雄南苜蓿匹配、固氮能力好、競爭結瘤能力強的優良菌株，對促進楚雄南苜蓿及其它豆科牧草的推廣種植具有重要意義。與接種根瘤菌的植株相比，未接種根瘤菌的植株在低氮情況下生長較緩慢，植株矮小且葉片逐漸枯萎，主根根長較長，側根較少，無根瘤，說明在低氮狀態下接種根瘤菌有利于楚雄南苜蓿側根的發育，促使植物體結瘤從而固定更多的氮，供給植物體利用，從而促進楚雄南苜蓿生長發育，在對大豆和苜蓿接種根瘤菌的研究［35-36］中也表明了接種根瘤菌有利于植物根系的生長，這可能是因為豆科植物接菌使根系有較高固氮酶活性，加速根瘤菌活動和繁殖，促進根系生長，從而提高植株生長和發育［37-38］。

在本實驗中篩選出的5株菌株均來源于呈酸性的南方土壤，在實驗室條件下對5株菌株進行耐酸性研究表明：5株篩選與酸性土壤中的菌株能在pH值大于3.5的條件下生長，說明5株菌株具有較強的耐酸性，有研究也表明在酸性土壤中篩選出的根瘤菌具有較強的耐酸性［39-40］。雖然 5株根瘤菌的耐酸性相差不大，并且都有一定的耐鋁能力，但在高濃度鋁脅迫下根瘤菌CX-44的表現要優于其余4株，這說明具有耐酸性差異不大的根瘤菌，其耐鋁毒能力可能有所不同，這與前人［41-42］研究具有一致性，這更加表明了在酸性條件下篩選出與豆科牧草共生固氮且具有較強耐鋁菌株具有很大的價值。

4? 結論

從三個不同地區采樣鑒定后，得到5株根瘤菌菌株，YS-8，YS-10，DH-9，DH-31屬于根瘤菌科根瘤菌屬根瘤菌，CX-44屬于根瘤菌科中華根瘤菌屬苜蓿中華根瘤菌，其中CX-44為楚雄南苜蓿的優良高效共生菌株，具有較強的耐酸鋁能力。研究發現，篩選出的5株根瘤菌能在pH值大于3.5且鋁離子濃度（pH值=5）小于1 500 mg·L-1的土壤條件下推廣使用，其中菌株CX-44的效果最佳。

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（責任編輯? 劉婷婷）