重組膠原蛋白婦科凝膠對大鼠宮頸炎的治療作用

劉鑫，李華，齊磊，楊利霞，于月欣，徐蘭舉

河北納科生物科技有限公司，石家莊 050000

宮頸炎主要癥狀為外陰瘙癢、小腹墜痛、白帶增多等，嚴重者會引起月經紊亂、不孕不育等［1］，嚴重影響了婦女身體健康及生活質量。目前，宮頸炎的患病風險較高，約有60%～80%的育齡期婦女患?。?］。臨床上將宮頸炎分為急性和慢性2種，急性宮頸炎常表現為宮頸頸管黏膜紅腫，陰道分泌物增多呈膿性變化，伴有子宮內膜炎，如治療不及時會進展為慢性宮頸炎，癥狀反復，難以治愈，患者的生活質量顯著下滑［3-4］；慢性宮頸炎多表現為宮頸柱狀上皮異位、宮頸肥大、息肉、外翻以及宮頸腺囊腫等［5-7］，其誘發的損傷會導致乳頭瘤狀病毒感染，增加罹患宮頸癌的風險［8］。宮頸炎癥的存在可能在艾滋病毒的傳播中發揮作用，會增加病毒復制和病毒的易感性［9］。臨床上多采用抗生素治療宮頸炎，該方式不良反應較大，在殺滅病原菌的同時，也會殺滅大量健康菌群，從而破壞陰道微環境平衡［10］。因此，研發治療宮頸炎的安全有效的藥物具有重要的臨床價值。

膠原蛋白在組織中發揮著重要的作用。陰道黏膜及宮頸組織中富含膠原蛋白，總的膠原蛋白比例遠超過其他組織，它能維持黏膜組織的厚度和彈性，保持黏膜濕潤［11-12］。絕經生殖泌尿綜合征臨床診療專家共識［13］中指出：重組膠原蛋白可增加陰道粘膜的細胞外基質，維持細胞和血管的生長并降低炎癥反應，改善萎縮癥狀，緩解性交痛，并可通過增加陰道分泌物，改善絕經生殖泌尿綜合征（genitourinary syndrome of menopause，GSM）所致的陰道癥狀。研究者前期采用基因工程技術、高密度發酵與蛋白純化技術制備了純度高、溶解性好、免疫原性低的重組人Ⅲ型膠原蛋白，實驗結果表明其可以有效促進上皮細胞生長，細胞相容性良好［14］。細胞遷移和細胞粘附實驗也證明重組膠原蛋白可顯著促進小鼠成纖維細胞L929 的遷移和粘附，是一種理想的生物醫用材料。本研究將重組膠原蛋白開發成局部用的婦科凝膠劑，并應用于大鼠宮頸炎的治療，通過外源補充膠原蛋白，加速宮頸損傷黏膜的修復，旨在為宮頸炎的臨床治療提供一種新的手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗選取60 只SPF 級健康、性成熟未交配的Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠，由北京斯貝福生物有限公司提供，體重180～220 g，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0100。飼養條件：溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，噪音85 分貝以下，氨濃度15 mg·m-3以下，通風換氣8次·h-1。

1.2 主要試劑與儀器

苯酚購自天津永大公司（20210503），黃蓍樹膠粉購自北京索萊寶公司（G9390），甘油購自天津永大公司（20210910），蘇木素-伊紅染色試劑盒購自北京索萊寶公司（G1120），4%多聚甲醛購自武漢博士德生物公司（AR1068），馬松（Masson）三色染色試劑盒購自北京雷根生物公司（DC0032），Ki-67 抗體購自美國Immunoway 公司（YT5348），IL-6 抗體購自Affinity 公司（AF0198），光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司（BX43），多功能真彩色細胞圖象分析管理系統美國購自Media Cybernetics 公司（Image-Pro Plus），石蠟切片機購自德國LEICA 公司（RM2016）。

1.3 大鼠宮頸炎模型構建

實驗采用隨機數字表法將60 只SD 大鼠分為6組，每組10只。其中正常組SD 大鼠不做任何處理，正常喂養，其余5組（50只大鼠）按不同凝膠治療制備宮頸炎模型［15］。陽性對照組使用保婦康凝膠處理（白馬藥業）；GG00 組使用空白凝膠處理（基礎組分配方基質，不含重組膠原蛋白）；實驗組：GG01 組使用重組膠原蛋白含量為1 mg·g-1的婦科凝膠處理（批號GG01-20221101），GG02 組使用重組膠原蛋白含量3 mg·g-1的婦科凝膠處理（批號GG02-20221102），婦科凝膠為河北納科生物科技有限公司自研產品。重組膠原蛋白按照發明專利中公開的方法制備獲得［16］。

造模方法：首先使用異氟烷麻醉大鼠，用12號大鼠灌胃針頭輕輕插入大鼠陰道約2 cm 深處，注入25%苯酚膠漿0.25 mL，用棉球固定陰道口，保持大鼠倒立狀態2 min，隔天給藥1 次，共計5 次。造模過程中觀察陰道變化，給予苯酚膠漿5 次后大鼠陰道口紅腫，有膿性物流出，表示造模成功。

造模成功后，次日開始分組治療。陽性對照組、GG00 組、GG01 組、GG02 組分別給予0.25 mL對應藥物進行治療。每日給藥1次，并記錄大鼠體重，外陰紅腫及陰道口膿性分泌物情況等。模型組按上述給藥方式給予相應的0.9%氯化鈉溶液，連續給藥10次后麻醉處死大鼠，進行組織取材 。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 大體觀察 觀察并記錄治療前后大鼠外陰和體重的變化。治療10 d 后，對各組大鼠進行眼球取血，利用顯微鏡計數法測定白細胞總數。

1.4.2 組織病理學觀察 取各組大鼠陰道至子宮分角處部位組織，觀察組織水腫情況。將取材組織在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片，分別進行HE 染色和Masson 染色實驗，觀察并記錄大鼠陰道至宮頸組織形態學變化，膠原纖維的沉積情況以及黏膜、黏膜下間質形態學的炎性改變。

1.4.3 IL-6 蛋白及Ki-67 蛋白免疫組化染色 將石蠟包埋切片后進行IL-6 蛋白及Ki-67 蛋白免疫組化染色，在顯微鏡下觀察并拍照。結合陽性細胞率及陽性細胞染色強度進行免疫組化染色評分（immunoreative score，IRS）［17］。陽性細胞率分級如下：陽性細胞數0～1%計為0 分，1%～10%計為1 分，10%～50%計為2 分，50%～80%計為3 分，80%～100%計為4 分。陽性細胞染色強度分級如下：無染色計為0 分，弱染色計為1 分，中等染色計為2 分，強染色計為3 分。將陽性細胞率評分和染色強度評分相乘，即得到IRS 評分。IRS 評分結果體現了IL-6 和Ki-67 的表達水平和分布情況，以此來評價重組膠原蛋白凝膠在大鼠陰道和宮頸組織中炎癥反應及對組織細胞增殖能力的調節作用。

1.5 統計分析

運用SPSS 19.0 進行數據統計分析，各組數據以均數±標準差表示，組間比較采用雙尾t檢驗。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 苯酚膠漿成功誘導大鼠宮頸炎模型

如圖1所示，SD 大鼠經苯酚膠漿處理5次后，陰道口出現明顯紅腫，并且有膿性分泌物流出，表明大鼠宮頸炎模型造模成功。

圖1 苯酚膠漿誘導的SD大鼠宮頸炎模型陰道外觀Fig.1 Vaginal appearance of the rat model of cervicitis induced by phenol mucilage

2.2 大鼠體重和白細胞總數的變化

對實驗前后大鼠的體重變化進行統計，由表1可知，與實驗開始前體重相比，模型組大鼠體重顯著低于正常組，治療后陽性對照組、GG00組、GG01 組、GG02 組體重高于模型組。模型組大鼠血液中白細胞總數高于正常組，陽性對照組、GG01 組及GG02 組低于模型組，提示模型組及各治療組體重減輕可能與炎癥導致的大鼠食量減少等因素有關。上述結果表明，重組膠原蛋白婦科凝膠和陽性對照組保婦康凝膠可有效緩解宮頸炎大鼠的體重減輕，減輕大鼠體內炎癥。

表1 大鼠體重及白細胞總數指標的比較Table 1 Comparison of body weight and total WBC in rats

2.3 大鼠外陰大體觀察

研究觀察并記錄了各組中SD 大鼠治療前后外陰紅腫以及膿性分泌物情況，發現正常組SD大鼠外陰無紅腫和膿性分泌物等情況，模型組大鼠均可見陰道口紅腫、有膿性分泌物流出。陽性對照組、GG01 組、GG02 組未見膿性物流出，膿性分泌物顯著減少。與GG00 組相比，GG01、GG02 組有顯著治療效果，且GG02 組治療效果更好，與陽性對照組接近，說明可恢復到正常組水平。結果表明，GG01、GG02 組對大鼠宮頸炎模型具有明顯的治療效果，可以顯著逆轉模型組出現的陰道紅腫和膿性分泌物情況。

2.4 大鼠陰道及宮頸組織病理形態學改變

大鼠陰道及宮頸組織的修復情況如HE 染色和Masson 染色結果所示（圖2）。正常組大鼠宮頸黏膜在光學顯微鏡下可見復層扁平上皮組織，組織未見明顯異常改變。上皮組織可見少量小血管，大量膠原纖維沉積并有序排列。與正常組相比，模型組大鼠宮頸組織部分鱗狀上皮組織破損，出現細胞變性、壞死脫落；上皮層可見炎性細胞浸潤，黏膜及黏膜下固有層充血和大量炎性細胞浸潤，腺體有不同程度地增生及鱗狀上皮化；陰道組織出現粘膜下充血和炎性細胞浸潤，上皮下有大量中性粒細胞浸潤；模型組僅觀察到極少量膠原纖維的沉積。與模型組相比，陽性對照組炎性細胞浸潤極少，上皮無明顯變性和壞死，膠原沉積量接近于正常組水平，但膠原纖維排列不規則。在治療組中GG00 組大鼠組織形態有輕微改善，大鼠宮頸黏膜鱗狀上皮出現增生修復且稍增厚，可見大量炎性細胞浸潤，炎性滲出物和少量壞死組織，可見膠原纖維局部沉積；而GG01、GG02組陰道及宮頸組織炎癥程度明顯較輕。其中，GG01組可見少量炎性細胞浸潤，未見明顯炎性壞死組織；GG02組局部組織可見極少量的炎性細胞浸潤，上皮無明顯變性和壞死情況，表現出更多的膠原沉積以及有序規整的膠原纖維束，更接近于正常組大鼠的天然組織狀態，治療效果優于陽性對照組。

圖2 大鼠宮頸組織HE和Masson染色結果Fig.2 HE and Masson staining results of rat cervical tissues

2.5 免疫組化染色結果

由圖3、表2 免疫組化結果可知，模型組Ki-67表達水平顯著低于正常組（P＜0.05）；陽性對照組、GG01、GG02 組Ki-67 的表達水平顯著高于模型組（P＜0.05）；GG00 組與模型組相比未見明顯變化。模型組IL-6 分泌水平顯著高于正常組（P＜0.05）。陽性對照組、GG01、GG02 組治療后，IL-6 的表達水平明顯低于模型組（P＜0.05），表現為炎癥減輕，而GG00 組炎癥沒有明顯緩解；GG02 組和陽性對照組Ki-67 和IL-6 的表達水平與正常組接近，結果無統計學差異（P＞0.05）。結果表明，GG02 組對大鼠宮頸炎具有顯著治療效果，可使細胞增殖和炎癥反應恢復到正常組水平。綜上所述，重組膠原蛋白婦科凝膠可以降低宮頸炎大鼠組織中炎癥因子IL-6 的表達，同時促進細胞增殖和組織修復。

表2 各組大鼠陰道及宮頸組織Ki-67蛋白及IL-6蛋白指標的比較Table 2 Comparison of Ki-67 protein and IL-6 protein indexes in vaginal and cervical tissues of rats in each group

圖3 大鼠宮頸組織Ki-67和IL-6免疫組化結果Fig.3 Immunohistochemical results of Ki-67 and IL-6 in rat cervical tissue

3 討論

宮頸炎是一種多發的婦科疾病，給越來越多的女性帶來困擾。不合理的治療會發展成慢性宮頸炎，增加宮頸癌和人體免疫缺損病毒（human immunodeficien virus，HIV）傳播的發病風險［8］。本研究開發的重組膠原蛋白婦科凝膠對急性宮頸炎模型鼠具有顯著的治療效果，可改善陰道黏膜組織細胞外基質（extracellular matrix，ECM），為細胞提供更好的微環境。

膠原蛋白在減緩皮膚衰老、促進皮膚創面愈合以及組織黏膜修復中具有重要的調節作用［18-19］。人體α型膠原蛋白Ⅰ型衍生肽刺激人真皮成纖維細胞中的膠原合成、傷口愈合和彈性蛋白生成［20］。重組人Ⅲ型膠原蛋白也被證明是修復損傷角膜和心臟的極好的ECM［21］。高血糖、氧化應激以及異常炎癥反應均會造成人體黏膜組織中的微環境發生改變，造成組織中Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白的降解和功能異常，導致黏膜組織難以愈合［22-23］。過度活躍和持續的炎癥反應、蛋白水解酶水平改變以及ECM 缺乏會導致慢性創傷的愈合異常［24］。陰道內給藥重組人Ⅲ型膠原蛋白修復陰道上皮，可促進ECM 的組裝［12］。同時，重組膠原蛋白具有趨向引導作用，能夠引導上皮細胞遷移至受損部位，有效促進組織再生，加速黏膜屏障功能的恢復過程。

本研究結果顯示，重組膠原蛋白婦科凝膠在GG01組（1 mg·g-1）即對急性宮頸炎模型大鼠有一定的療效，GG02組（3 mg·g-1）治療效果更顯著，可有效促進大鼠宮頸組織的再生修復。GG02 組治療后大鼠陰道處的紅腫減輕，陰道分泌物減少，陰道水腫改善。大鼠宮頸組織炎性細胞浸潤減少，無上皮細胞變性和壞死情況，血管充血減少，宮頸組織中膠原沉積增加且有序排列。Ki-67 表達水平顯著增加，IL-6表達水平恢復到正常組水平，感染狀況明顯改善。值得注意的是，GG02組在促進膠原沉積和有序排列方面優于陽性對照組。上述結果表明，重組膠原蛋白凝膠與宮頸組織的親和性好，能修復陰道上皮組織和血管中的受損細胞，恢復細胞正常的代謝、增殖功能，幫助陰道上皮組織細胞逐漸恢復正常，提高細胞活力。

綜上所述，本公司開發的重組膠原蛋白婦科凝膠對急性宮頸炎模型大鼠具有良好的治療作用，通過局部給藥能夠有效促進宮頸組織黏膜的再生和快速修復愈合，為其臨床應用提供良好的理論支持。