重組人源Ⅲ型膠原蛋白對豚鼠紫外線輻射損傷皮膚的修復效果探究

刁立琴，李華，施麟，于月欣，謝媛，王亞如，徐蘭舉

1.河北省藥品醫療器械檢驗研究院，石家莊 050227；2.河北納科生物科技有限公司，石家莊 050000

皮膚由表皮層和真皮層組成，是人體重要的器官，具有保護、分泌、體溫調節以及感知外界刺激等功能［1］。皮膚是抵御有害生物、物理和環境污染物的第一道防線，包括紫外線（ultraviolet，UV）輻射。紫外線可以使身體合成對生命至關重要的維生素D，然而過量接觸會產生有害影響。紫外線輻射已被描述為影響皮膚細胞的主要物理因素之一，容易導致皮膚炎癥、早衰和癌癥的發生［2］。紫外線輻射按波長分為紫外線A（UVA，315～400 nm）、紫外線B（UVB，280～315 nm）和紫外線C（UVC，100～280 nm）［3］。UVA 輻射是造成皮膚損傷的主要因素，皮膚過度暴露于UVA 輻射下，會產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括單線態氧、超氧陰離子和過氧化氫。ROS 與富含脂質的膜、酶和細胞DNA 相互作用，會改變細胞結構并干擾其功能的發揮［4］。UVB 的破壞作用比UVA 強1 000 倍，可以通過抑制人體表皮細胞的活力而導致皮膚光老化。UVC 可以被臭氧層過濾掉，因此UVB 被認為是陽光中最有害的成分［5-6］。紫外線輻射對皮膚的生物效應是基于光吸收和內在能量轉換的，可導致面部皺紋、色素沉著、粗糙和毛細血管擴張。過度的紫外線輻射會破壞膠原蛋白、彈性蛋白和糖胺聚糖，導致皮膚結締組織損傷，從而影響皮膚的強度、彈性和水合作用［7］。長期暴露在太陽輻射下，不僅會引起光化性損傷，如曬傷和光化性皮炎，還會導致基底細胞癌和其他皮膚癌的發生［8］。

皮膚細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是皮膚干細胞生態位的一個重要組成部分，支持皮膚細胞的黏附、遷移、增殖和分化，直接影響皮膚的組織發育和再生過程［9］。膠原蛋白屬于蛋白家族，被認為是ECM 的關鍵結構蛋白，支持天然組織的形態和完整性。因此，膠原蛋白在組織工程中有著廣泛的應用［10］。所有波段的紫外線輻射都會破壞膠原纖維，加速皮膚老化［11］。重組膠原蛋白是通過將膠原蛋白的天然基因序列或重新優化設計的基因序列，導入選定的宿主細胞中，如大腸桿菌和酵母菌，經過培養、發酵、分離純化等工藝，獲得具有一定天然膠原蛋白特征和主要功能的蛋白質［12］。研究發現，重組人源Ⅲ型膠原蛋白（recombinant human type Ⅲ collagen，rhCol Ⅲ）交聯制備的水凝膠能促進糖尿病創面皮膚的修復和再生［13］，rhCol Ⅲ對皮膚的修復再生具有重要的調節作用。

與大鼠或小鼠相比，豚鼠的皮膚結構在解剖學和生理學上更類似于人類皮膚［14］。因此，本研究選擇豚鼠為實驗動物，利用紫外線輻射造成豚鼠皮膚損傷后，將rhCol Ⅲ原料涂抹在皮膚損傷處，以探究其對豚鼠光毒損傷皮膚的修復效果。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF 級Hartley 豚鼠，體重范圍在250～350 g，由青島康大愛博生物科技有限公司提供，合格證號為370823231100050256，許可證號為SCXK（魯）2021 0003。

1.2 實驗試劑與儀器

實驗試劑：重組人源Ⅲ型膠原蛋白原料（河北納科生物科技有限公司，批號Z-3CH-004），L929細胞（中科院上海生命科學研究院細胞資源中心），MEM 培養液（賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司），異丙醇（天津市永大化學試劑有限公司），胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd.），高密度聚乙烯膜（Hatano Research Institute），氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司），市售膠原蛋白產品（湃克泰德，鱈魚膠原蛋白肽粉，批號YF030004-3），HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），Vimentin 抗體（美國Proteintech公司），HMB45 抗體（英國Abcam 公司），DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）。

實驗儀器：熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），二氧化碳培養箱（德國賓德BINDER 公司），石蠟切片機（德國萊卡公司），生物組織攤烤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司），電子天平（美國梅特勒公司），高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司），皮膚光毒性試驗檢測儀（天津開發區合普工貿有限公司）。

1.3 細胞毒性檢測

細胞毒性檢測的實驗分組如下：空白對照組為10%胎牛血清的MEM 培養液；樣品組為1、3、5、10 mg·mL-1rhCol Ⅲ和市售膠原蛋白產品（5 mg·mL-1），浸提介質為加入含10 %胎牛血清的MEM 培養液；陰性對照組為高密度聚乙烯膜按表面積3 cm2·mL-1比例加入含10 %胎牛血清的MEM 培養液，37 ℃浸提24 h；陽性對照組為10%DMSO溶液。

實驗按照GB/T 16886.5—2017 規定的MTT方法進行。1×105·mL-1細胞懸液接種于96 孔板，每孔100 μL，37 ℃孵育24 h 后，去掉原培養液?？變确謩e加入100 μL 空白對照液、陰性對照液、陽性對照液、rhCol Ⅲ樣品液和市售組樣品液，37 ℃孵育24 h。去掉原培養液，每孔加入50 μL濃度為1 mg·mL-1MTT 溶液，繼續培養2 h 后吸出孔內溶液，加入100 μL 異丙醇，振蕩10 min，在酶標儀570 nm 和650 nm 雙波長下測定光密度（OD值）。

1.4 實驗分組及造模方法

1.4.1 實驗分組 隨機數表法將30 只豚鼠分為6 組：正常組、模型組、1 mg·mL-1rhCol Ⅲ組、3 mg·mL-1rhCol Ⅲ組、5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組和市售產品（5 mg·mL-1）組。正常組未進行紫外照射和給藥處理，為正常狀態的豚鼠。模型組進行紫外輻射造成豚鼠光皮膚損傷，在豚鼠輻射部位涂抹氯化鈉注射液。1 mg·mL-1rhCol Ⅲ組、3 mg·mL-1rhCol Ⅲ組、5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組和市售產品（5 mg·mL-1）組進行紫外照射以及輻射部位給藥處理，涂抹rhCol Ⅲ和市售產品溶液，每只豚鼠涂抹0.3 mL。rhCol Ⅲ和市售產品使用氯化鈉注射液溶解，配制為所需實驗濃度。

1.4.2 造模方法 照射前，在豚鼠背部3 cm×3 cm區域內剃毛，使用脫毛膏脫毛，使皮膚充分暴露。豚鼠放在皮膚光毒性試驗檢測儀（UVA+UVB）燈具正下方30 cm 處照射，輻射參數設為UVA（4.5 mJ·cm-2·s-1）+UVB（0.036 mJ·cm-2·s-1），每周照射2次，連續照射4周。每次輻射時間：30、40、50、60、70、80、90、100 min，累計共520 min。除正常組外其他組每次照射后立即涂抹相應試驗樣品。

1.5 豚鼠光損傷皮膚的大體觀察

對各實驗組豚鼠的皮膚狀態進行觀察記錄，按照表1 進行豚鼠皮膚刺激反應評分，并對各實驗組修復效果進行評價。

表1 豚鼠皮膚皺紋情況評分標準Table 1 Scoring criteria for skin wrinkles in guinea pigs

1.6 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色

組織取材固定后，使用石蠟包埋、切片。切片后在二甲苯中脫蠟8 min，換用新鮮的二甲苯，再脫蠟8 min。將玻片依次放入以下溶液：無水乙醇5 min、90 %乙醇2 min、80 %乙醇2 min、70 %乙醇2 min、蒸餾水2 min。蘇木素染色液染色60 min，浸自來水中沖洗去除多余的染色液，約10 min，然后蒸餾水再洗滌一遍。分化液分化約20 s，自來水沖洗10 min。伊紅染色液染色1 min。脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色，而細胞漿呈粉紅色或紅色。

1.7 免疫組化染色

取各實驗組豚鼠的皮膚組織，進行波形纖維蛋白（Vimentin）抗體和黑色素瘤單克隆抗體45（human melanoma black 45，HMB45）的免疫組化染色，以檢測各實驗組豚鼠皮膚組織中2 種蛋白的表達情況，進而評價成纖維細胞纖維化與黑色素瘤的發生風險。

1.8 統計分析

SPSS 20.0 軟件進行實驗數據的統計學分析。計量資料用平均數±標準差表示，組間比較用單因素方差分析。當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 重組人源Ⅲ型膠原蛋白原料的細胞毒性檢測

本研究通過MTT 實驗，探究了不同濃度rh-Col Ⅲ組以及市售組對L929 細胞的毒性。從圖1中看出，與空白對照組相比較，陰性對照組的吸光度值無顯著差異（P＞0.05）。與空白對照組相比，陽性對照組的吸光度比值顯著下降（P＜0.001），提示其存在細胞毒性。與空白對照組相比較，1 mg·mL-1rhCol Ⅲ組的吸光度值上調，但無統計學差異（P＞0.05）；3 mg·mL-1rhCol Ⅲ組、5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組以及市售組的吸光度值顯著上調（P＜0.01），表明在該濃度下的樣品可顯著促進細胞增殖；10 mg·mL-1rhCol Ⅲ組吸光度值顯著上調，但無統計學差異（P＞0.05）。上述結果表明，rhCol Ⅲ無細胞毒性，且3 mg·mL-1和5 mg·mL-1濃度下可以促進細胞生長。

圖1 rhCol Ⅲ的細胞毒性分析Fig.1 Cytotoxicity analysis of rhCol Ⅲ

2.2 皮膚組織大體觀觀察

根據rhCol Ⅲ原料的安全性檢測結果，其在濃度為3 mg·mL-1和5 mg·mL-1時，具有更明顯的促細胞生長作用。膠原蛋白濃度為10 mg·mL-1時，樣品的滲透壓有可能會超過細胞的正常滲透壓，影響細胞的生長［15］。因此，本研究探究了1、3 和5 mg·mL-1膠原蛋白對豚鼠紫外線損傷皮膚的修復效果。在樣品涂抹治療后，根據表1皮膚皺紋情況評分標準，進行各實驗組豚鼠皮膚狀態恢復情況的大體觀比較。結果如表2所示，與正常組相比較，模型組豚鼠的皮膚更粗糙，存在深皺紋的情況。與模型組相比較，1 mg·mL-1rhCol Ⅲ組豚鼠皮膚存在淺皺紋的情況；3 mg·mL-1rhCol Ⅲ組豚鼠皮膚存在細磨痕情況；5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組豚鼠皮膚皺紋評分更低，改善更加明顯；市售組皮膚也得到明顯改善，但效果不如5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組。

表2 豚鼠光損傷修復治療后的皮膚皺紋情況比較Table 2 Comparison of skin wrinkles in guinea pigs after light damage repair treatment

2.3 皮膚組織病理學觀察

圖2 為紫外線輻射后，各組豚鼠皮膚組織的形態變化。正常組豚鼠表皮層的厚度均一且較薄，成波浪型分布；真皮層中的膠原纖維束排列緊密，無明顯炎癥反應。模型組豚鼠表皮層焦化嚴重，厚度明顯增加；真皮層的膠原纖維束纖細，且炎癥細胞數目多，發生了較明顯的炎癥反應。與模型組相比較，各治療組均有不同程度的治療效果。其中，5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組的治療效果最好，該組豚鼠的皮膚狀態更接近于正常組豚鼠。5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組豚鼠的表皮層較薄，且呈波浪型分布；真皮層膠原蛋白纖維束緊密排列，明顯改善了紫外線輻射引起皮膚真皮層組織的炎癥反應病變。該結果表明，5 mg·mL-1rhCol Ⅲ對光損傷皮膚的修復治療具有明顯的效果，可以使受損組織恢復至正常組小鼠皮膚的組織狀態。

圖2 各實驗組HE染色分析Fig.2 HE staining analysis of each experimental group

2.4 皮膚組織Vimentin免疫組化分析

Vimentin 是間充質細胞中的一種Ⅲ型中間絲纖維蛋白，為上皮-間充質轉化（epithelial to mesenchymal-transition，EMT）的主要標志蛋白。Vimentin 可以維持細胞的完整性，提供抗壓能力，其在胃腸道腫瘤、乳腺癌及肺癌等多種上皮性癌中呈現過表達狀態［16］。Vimentin 與皮膚損傷后修復及瘢痕增生有關，紫外輻射會造成其表達升高，可用于檢測真皮層成纖維細胞的增生情況［17］。Vimentin 染色結果如圖3所示，模型組中Vimentin表達明顯，證實豚鼠在紫外輻射后的成纖維細胞發生明顯增生，會使皮膚產生瘢痕。各治療組皮膚組織中的Vimentin 表達降低，改善了皮膚組織的過度增生。該結果表明，rhCol Ⅲ具有良好的抵抗紫外輻射的作用，可以調節紫外輻射刺激引發的皮膚瘢痕增生。

圖3 各實驗組Vimentin免疫組化分析Fig.3 Immunohistochemical analysis of Vimentin in each experimental group

2.5 皮膚組織HMB45免疫組化分析

HMB45在大多數惡性黑色素瘤和激活的黑色素細胞中表達，如某些交界性痣細胞、非典型痣、創傷性痣和藍痣的黑色素細胞［18］。HMB45免疫組化染色是惡性黑素瘤的經典診斷和鑒別方式［19］。由圖4 可知，HMB45 的主要表達位置為皮膚組織的表皮基底層和毛囊上皮層。HMB45陽性染色細胞數目顯示，與正常組相比較，模型組中HMB45的表達明顯增加，表明紫外線輻射大大增加了黑色素瘤的發病風險。與模型組相比較，1 mg·mL-1rh-Col Ⅲ組、3 mg·mL-1rhCol Ⅲ組、5 mg·mL-1rhColⅢ組以及5 mg·mL-1市售組中HMB45 的表達水平均發生顯著下降，其中5 mg·mL-1rhCol Ⅲ組中陽性染色細胞數目更低。該結果表明，rhCol Ⅲ原料的涂抹治療可以降低紫外線輻射鼠皮膚黑色素瘤的發病風險。

圖4 各實驗組HMB45免疫組化分析Fig.4 Immunohistochemical analysis of HMB45 in each experimental group

3 討論

皮膚惡性腫瘤是常見的癌癥，其治療和監測需要高昂的醫療費用。戶外活動時，間歇性UV輻射可能會引發皮膚癌［20］。UV 輻射被證實是皮膚癌最明確的誘因，包括惡性黑色素瘤和非黑色素瘤［21］。在UV 輻射損傷過程中，皮膚組織中的炎癥細胞增多，纖維解體，角質層增厚［22］，同時UV輻射增強了透明質酸酶和彈性酶的作用，導致皮膚組織中彈性纖維的退化、膠原纖維的大量減少和基質的消失。此外，真皮中膠原蛋白（Ⅰ型和Ⅲ型）原纖維和彈性蛋白的正確和均勻排列會影響皮膚的強度和彈性。當皮膚暴露在UV 輻射下會產生膠原酶和胸腺嘧啶二聚體，造成膠原蛋白缺失，進而導致皮膚老化［23］。膠原蛋白作為體外細胞基質中最主要的天然成分，在體內具有毋庸置疑的優勢［24］。在本研究中，我們證實rhCol Ⅲ原料對豚鼠UV 輻射損傷皮膚修復具有明顯的治療效果。

本研究證實rhCol Ⅲ原料對L929細胞無潛在的細胞毒性，安全性良好。通過體內動物實驗，深入探究了rhCol Ⅲ對UV 輻射損傷皮膚的修復作用，結果表明rhCol Ⅲ原料可以明顯改善豚鼠皮膚光毒損傷下的病理組織變化，發揮抗紫外線輻射的治療效果。模型組豚鼠在紫外線輻射后，發生明顯的組織病理學改變，表皮增生明顯，真皮層炎癥反應加重。rhCol Ⅲ原料涂抹治療后，皮膚表皮層較薄，且呈波浪型分布，真皮層膠原蛋白纖維束緊密排列，促進了紫外線輻射損傷皮膚的恢復情況。Vimentin 和HMB45 免疫組化結果證實，各實驗組中Vimentin 和HMB45 的表達下調，可以改善成纖維細胞的增生情況以及降低黑色素瘤的發病風險。更重要的是，5 mg·mL-1rhCol Ⅲ原料對豚鼠光毒損傷皮膚的治療效果更好，且優于相同濃度的市售產品組。

綜上所述，rhCol Ⅲ原料對L929 細胞無潛在細胞毒性，且對光毒損傷皮膚具有明顯的修復效果，可用于開發皮膚紫外線輻射損傷治療的護理產品，在皮膚醫學修復領域具有重要的應用價值。