NHP2調控肝癌細胞衰老機制的生物信息學分析

黃師，莫茵茵，羅綠景，劉會婷，陳崢宇，李根亮*

1.右江民族醫學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院麻醉科，廣西 百色 533000

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，發病率及致死率均位居前五位［1］。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其中占比最多的分型。肝細胞癌的發病機制復雜，危險因素多，起病隱匿，發展迅速且預后差，嚴重威脅著人類的健康。近年來，研究發現細胞衰老對癌細胞的生長代謝有一定影響，是致癌因素刺激后細胞作出的一種反應，與癌癥的發生發展有緊密的關系。目前已發現細胞衰老與肝癌的發生發展具有相關性，通過抑制肝癌細胞衰老可以促進肝癌細胞的增殖［2］，但其具體作用方式仍然不夠明確。

核糖核蛋白NHP2 是端粒酶和小核仁核糖核蛋白（snoRNP）復合物的關鍵成分，屬于端粒酶復合物的一部分，能維持染色體末端的穩定［3］。已有研究發現，NHP2 的下調后一定程度上可以抑制端粒酶逆轉錄酶的表達，從而破壞端粒酶復合物的穩定性［4］。NHP2 突變引起的端粒生物學障礙（telomere biology disorders，TBDs）被發現與細胞衰老、癌癥具有關聯［5］，這在胃癌、肺癌中也有相關報道［5-6］，但是在肝癌中的研究比較少見。本研究通過生物信息學分析NHP2 的靶向miRNAs 和lncRNAs，以期探究細胞衰老相關基因NHP2在HCC中的表達及可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞衰老相關基因和肝癌差異表達基因的獲取

在Quick Go 數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/QuickGO/）中進行基因檢索，檢索結果“taxon”選項卡內選擇“Homo sapiens”，點擊“apply”。共得99 個與細胞衰老生物學過程相關的基因。打開GEPIA2 在線數據庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）左側“Expression Analysis”，在下拉菜單中選擇“Differential genes”，“Dataset”中選擇“LIHC”，設定“Chromosomal Distribution”為both。下載獲取肝細胞癌的差異表達基因。將兩者進行韋恩圖分析（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），找出共表達基因。

1.2 目的基因的獲取和泛癌分析

將共表達基因放入STRING 在線數據庫（https：//cn.string-db.org/）進行蛋白互作，找出共表達基因相關的互作蛋白，使用TIMER 2.0（http：//timer.cistrome.org/）、UALCAN 數據庫（https：//ualcan.path.uab.edu/index.html）分析共表達基因在泛癌中的差異表達及肝癌和其他泛癌病理進展過程中的表達，預測其在肝癌中的預后生存關系。

1.3 共表達基因的互作蛋白及功能分析

將共表達基因放入互作蛋白在線分析數據庫STRING，檢索共表達基因及其編碼蛋白的互作蛋白。將共表達基因及相關基因放入DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行功能分析。

1.4 共表達基因的ceRNA調控網絡分析

將共表達基因放入miRNet 數據庫（https：//www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）的“Genes”板塊，物種選擇為“H.sapiens（human）”，ID 類型選擇“official gene symbol”，目標類型為“miRNA”，在列表中輸入共表達基因后發送，得到其靶向miRNAs。將其靶向的miRNAs 在該數據庫中繼續查找其靶向lncRNA。將得到的基因放入Cytescape v3.8.0 軟件（https：//cytoscape.org/download.html）中制作ceRNA靶向圖。

2 結果與分析

2.1 19 個差異表達基因參與了肝癌細胞衰老的生物學過程

在Quick Go數據庫中下載的與細胞衰老相關的生物學過程相關基因113 個。在GEPIA 2 在線數據庫下載的肝癌差異表達基因2 206 個。將兩者進行共表達分析發現，共有包括NHP2在內的19 個差異表達基因參與了肝癌細胞衰老的生物學過程（圖1），表明這19 個細胞衰老相關基因參與了肝癌的發生發展。

圖1 Quick Go細胞衰老基因與GEPIA 2 HCC差異表達基因的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of cell senescence gene in Quick Go base and DEGs in GEPIIA 2 of HCC

2.2 NHP2在泛癌中的表達

經在線數據庫TIMER 2.0 分析發現，NHP2基因在多種癌癥中顯著高表達?？偨YTCGA 臨床病例數據，與UALCAN 共同分析發現，NHP2 在肝癌人群及其他多個腫瘤中高表達，一定程度上表明NHP2 參與了腫瘤的發生與發展，可能是腫瘤潛在的治療靶點（圖2～3）。

圖2 UALCAN數據庫中NHP2在HCC中的表達情況Fig.2 The expression of NHP2 in HCC in UALCAN database

圖3 TIMER 2.0數據庫中NHP2在多種腫瘤中的表達情況Fig.3 Expression of NHP2 in a variety of tumors in TIMER 2.0 database

2.3 NHP2基因的互作蛋白及功能分析

NHP2基因編碼的互作蛋白有10 個，分別是DKC1、FBL、GAR1、NAF1、NHP2L1、NOP10、NOP56、NOP58、RUVBL1、TERT（圖4）。將其相關基因放入DAVID 數據庫進行功能富集分析發現，這些基因主要參與了1 個KEGG 信號通路，即真核生物核糖體發生的信號通路，6 個分子功能（MF），如端粒酶RNA 結合、端粒酶活性、H/ACA SnoRNA 結合及ATP 酶結合等，11 個細胞組分（CC），如核蛋白復合物、端粒酶全酶復合物、小核仁和蛋白復合物及染色體端粒區等，7 個生物學過程（BP），如核糖體生物發生、端粒中端粒酶的維持、端粒酶RNA 的穩定及對端粒酶活性的正向調節等（圖5）。

圖4 NHP2的互作蛋白Fig.4 The PPI of NHP2

2.4 NHP2與肝癌疾病進展的分析

經UALCAN 數據庫分析，NHP2 在HCC 中的表達具有明確的意義。隨著HCC 的進展加重，NHP2 表達水平越高，與其發病年齡、疾病分期具有顯著的相關性（圖6）。GEPIA 2 數據庫分析也得出相似的結論。如圖7、8 所示，經預后生存曲線分析發現，NHP2 高表達組在肝癌的預后較差，差異具有統計學意義（P＜0.05）。故NHP2 在包括HCC 的多種腫瘤的臨床疾病進展中具有一定關聯，對HCC 的治療和預后分析具有一定的參考價值。

圖6 NHP2在HCC不同狀態的對比結果Fig.6 Comparison of NHP2 in different states of HCC

圖7 NHP2在泛癌的疾病分期對比結果Fig.7 Comparison of NHP2 in disease staging in pancarcinoma

圖8 NHP2在HCC中的預后生存分析Fig.8 Prognostic survival analysis of NHP2 in HCC

2.5 NHP2基因ceRNA調控網絡圖

將NHP2 放入miRNet 數據進行靶向RNA 分析，得出其靶向miRNAs 有2 個：hsa-miR-1-3p 和hsa-miR-124-3p，其靶向的lncRNAs 有57 個。將其靶向關系放入Cytoscape 軟件進行網絡分析，得出NHP2 調控網絡圖（圖9）。NHP2 在HCC 中可能通過lncRNAs/miR-1-3p/NHP2 或lncRNAs/miR-124-3p/NHP2調控軸進行調節。

圖9 NHP2的ceRNA調控網絡圖Fig.9 CeRNA regulatory network diagram of NHP2

3 討論

目前，原發性肝癌的全球發病數已超過90 萬例［7］，HCC 是其中最常見的類型。HCC 發病通常與生活環境、飲食、遺傳、炎癥刺激等因素相關［8］，治療方式包括手術切除、免疫治療、肝移植、介入治療等［9］?？偟膩碚f，肝癌起病隱匿，進展迅速，容易復發和耐藥，預后差［2］。細胞衰老是抑制腫瘤生長的潛在機制，有望為腫瘤的進展提供一種治療機制。

NHP2 是H/ACA snoRNP（小核仁核糖核蛋白）基因家族的成員，是端粒酶復合物的一部分，能夠調節核仁和核漿內端粒酶和維持端粒穩定［3］。端粒是位于染色體末端的核蛋白結構。在細胞衰老相關研究中發現，端粒酶的激活可以維持端粒的穩定，當細胞分裂至Hayflick 界限時，進入細胞衰老或凋亡［10］。目前已有研究顯示，端粒酶能夠促使肝細胞癌無限增殖［11］。通過敲低NHP2 抑制端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）表達和破壞端粒酶復合物的穩定性可以抑制HBx 誘導的肝癌發生［4，12］。TERT 是端粒酶的一種催化亞基，由包括NHP2 在內的多種蛋白構成。TERT 對端粒酶的活性具有決定性作用，目前有多項研究發現，TERT 啟動子突變與肝細胞癌的遺傳突變具有重要關聯［13-14］。研究還發現，端粒酶在正常細胞內并不活躍，而在分化能力強的癌細胞內卻很活躍［15-17］。有研究證實，敲低NHP2 的表達對乙肝相關性肝癌的增殖、端粒酶活性具有抑制作用，能促進該類肝癌細胞的凋亡，分析試驗結果認為可能是通過干擾TERT 的表達來影響細胞的增殖［12］。也有試驗證實，原發腫瘤細胞內的端粒酶活性提高，并且端粒的長度與TERT 的轉錄具有相關性［18］。以上結果表明，NHP2 在肝癌細胞衰老機制中發揮重要的作用。

目前，NHP2的具體調控機制尚未闡明。ceRNA 網絡認為NHP2 可以調控腫瘤的增殖和凋亡［19-20］。經過在線數據庫miRNet分析發現，NHP2與miR-1-3p、miR-124-3p之間存在靶向關系，并與lnc00242等57個lncRNAs之間形成調控軸。國內學者在對胃癌的研究中發現，lnc00242 競爭性地聯合miR-1-3p后可調節mRNA 的表達，進而影響胃癌的增殖。lncRNA 可能通過調控miR-124-3p對膀胱癌產生生物學影響，該miRNA 在食管癌、宮頸癌、肝癌、胃癌中的研究中也得出了類似的結論［21-25］。有研究顯示，linc00174、lncR CYTOR 可以調控肝癌的增殖活性［26-27］，本研究結果分析提示該lncRNA是調控通路上的一部分，所以我們推測HCC 可能通過lncRNAs/miR-1-3p/NHP2 或lncRNAs/miR-124-3p/NHP2 調控軸調節其增殖或凋亡過程。

生物信息學技術分析發現，NHP2屬于細胞衰老相關基因，亦屬于HCC 的差異表達基因。通過TIMER 2.0和TCGA 數據庫的臨床數據分析發現，NHP2在包括肝癌的多種癌癥中高表達，間接證明了在腫瘤中端粒酶活性的提高。對NHP2基因進行功能富集分析發現，其參與了真核生物核糖體形成的KEGG，主要參與的CC 有核糖核蛋白復合物，主要MF如端粒酶RNA的形成，參與的BP如核糖體的形成和通過端粒酶維持端粒的穩定性等。經UALCAN和GEPIA 2數據庫分析，利用TCGA病例研究顯示，NHP2的表達與包括HCC在內的多種癌癥分期具有統計學差異，NHP2可能成為HCC潛在的治療方法和預后指標。

綜上所述，NHP2 作為H/ACA snoRNP 基因家族的一員，在HCC中的表達高于正常組織，且與腫瘤患者的年齡、分期等狀態緊密聯系。數據庫分析顯示，NHP2高表達與患者預后不佳相關，NHP2高表達的HCC患者預后更差。對其進行功能富集分析發現，NHP2與多個蛋白互作，聯系緊密，還參與多個CC、BP 及MF。在對于HCC 的端粒維持和細胞衰老過程中，可能通過lncRNAs/miR-1-3p/NHP2 或lncRNAs/miR-124-3p/NHP2 調控軸進行調節。故NHP2可能參與了HCC的發展和疾病進展，有望作為HCC的治療靶點和預測因子。