肉桂醛對赤擬谷盜的熏蒸作用及對成蟲保護酶活性的影響

王瑩瑩 邵云飛 楊浩嵐 曹付 劉蘇 李茂業 李世廣

摘要

為明確肉桂醛對赤擬谷盜Tribolium?castaneum各發育階段的殺蟲活性及對成蟲幾種保護酶活性的影響，本試驗采用三角瓶密閉熏蒸法測定了肉桂醛對赤擬谷盜低齡幼蟲、高齡幼蟲、蛹和成蟲的熏蒸作用及24?h致死中濃度熏蒸后成蟲體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性。結果表明，肉桂醛的熏蒸效果與其濃度和赤擬谷盜發育階段有關，肉桂醛2.5?μL/L熏蒸72?h對赤擬谷盜成蟲的熏蒸效果最好，幼蟲次之。在24?h致死中濃度處理下，赤擬谷盜成蟲體內SOD、POD、CAT活性分別在48、12?h和36?h達到最高，其活性分別為對照的2.70、1.03倍和1.96倍。隨著熏蒸時間的延長，成蟲POD活性在處理36?h后低于對照，SOD、CAT活性分別在處理36～60?h和24～48?h顯著高于對照。綜上所述，經肉桂醛熏蒸處理后，赤擬谷盜成蟲體內動態平衡受到破壞，進而產生毒害作用。因此，肉桂醛對赤擬谷盜的生物防治有較高的應用價值。

關鍵詞

肉桂醛;?赤擬谷盜;?熏蒸作用;?超氧化物歧化酶;?過氧化物酶;?過氧化氫酶

中圖分類號：

S?379.5

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022750

Effects?of?cinnamaldehyde?on?fumigation?and?protective?enzyme?activity?in?Tribolium?castaneum?adults

WANG?Yingying#，?SHAO?Yunfei#，?YANG?Haolan，?CAO?Fu，?LIU?Su，?LI?Maoye*，?LI?Shiguang*

（Key?Laboratory?for?Biology?and?Sustainable?Management?of?Plant?Diseases?and?Pests?of?Anhui?Higher?

Education?Institutes，?College?of?Plant?Protection，?Anhui?Agricultural?University，?Hefei?230036，?China）

Abstract

To?determine?the?insecticidal?activity?of?cinnamaldehyde?against?Tribolium?castaneum?at?various?developmental?stages?and?its?impact?on?several?protective?enzymes?in?T.castaneum?adults，?the?fumigation?effect?of?cinnamaldehyde?on?young?larvae，?old?larvae，?pupae，?and?adults?were?investigated?using?a?conical?flask?fumigation?method，?and?the?activities?of?superoxide?dismutase?（SOD），?peroxidase?（POD），?and?catalase?（CAT）?in?the?adults?exposed?to?cinnamaldehyde?at?a?median?lethal?concentration?（LC50）?were?measured.?The?results?showed?that?the?fumigation?effect?was?correlated?with?the?concentration?of?cinnamaldehyde?as?well?as?the?developmental?stage?of?T.castaneum.?After?exposed?to?2.5?μL/L?of?cinnamaldehyde?for?72?h，?the?best?fumigation?effect?was?observed?on?the?adults，?followed?by?the?larvae.?The?activities?of?SOD，?POD，?and?CAT?reached?the?highest?level?when?treated?with?LC50?（24?h）?of?cinnamaldehyde?for?48，?12?h，?and?36?h，?respectively;?the?activities?of?SOD，?POD，?and?CAT?were?2.70，?1.03，?and?1.96fold?of?those?in?the?control?group，?respectively.?The?POD?activity?in?treated?adults?was?lower?than?that?in?the?control?group?when?fumigated?for?36?h，?while?SOD?and?CAT?activities?were?significantly?higher?than?those?in?the?control?group?when?insects?were?fumigated?in?flask?for?36-60?h?and?24-48?h，?respectively.?In?conclusion，?cinnamaldehyde?fumigation?can?destroy?the?dynamic?balance?in?T.castaneum?in?vivo，?resulting?in?toxic?effects.?Therefore，?cinnamaldehyde?has?the?potential?for?biological?control?of?T.castaneum.

Key?words

cinnamaldehyde;?Tribolium?castaneum;?fumigation?effect;?SOD;?POD;?CAT

赤擬谷盜Tribolium?castaneum?（Herbst）屬鞘翅目Coleoptera?擬步甲科?Tenebrionidae，是重要的儲糧害蟲之一［1］，在我國至少遍布23個?。▍^）［2］，為害玉米、水稻、油料等。赤擬谷盜體表臭腺可分泌苯醌等致癌物，嚴重影響糧食的品質和食用價值，從而造成嚴重的經濟損失［34］。

赤擬谷盜具有食性雜、繁殖力強等特點，化學藥劑磷化氫熏蒸是當前控制赤擬谷盜為害的主要方法［5］。由于長時間高劑量地使用化學藥劑，赤擬谷盜對化學藥劑已產生了不同程度的抗性［6］。隨著人們對綠色、無公害食品需求的增加，對赤擬谷盜的防治策略需要逐步轉變為以生物防治為核心的綜合治理。利用植物精油防治儲糧害蟲是一種新的綠色防控方法。植物精油具有對人畜安全、易降解、無殘留等特點，能夠與生物防治相結合，在防治儲糧害蟲方面具有顯著優勢。儲糧害蟲受到植物精油熏蒸處理后其生長發育和繁殖會受到抑制［7］。研究發現丁香、青蒿和啤酒花等植物精油對赤擬谷盜有較好的熏蒸效果［810］。此外，不同植物或者同一植物精油的不同提取方法對害蟲的防治效果也會存在顯著差異［1112］，因此需研究不同植物精油的殺蟲活性，以獲取高效、綠色的防控藥劑。

肉桂Cinnamomum?cassia系樟科樟屬中等喬木［1314］，在我國主要種植于廣東、云南等地［15］。據報道，肉桂精油對飛蛾幼蟲有較好的控制效果，肉桂精油的主要成分為肉桂醛，相對含量為83.18%［16］。Kordali等［17］的研究發現肉桂醛對谷象Sitophilus?granarius有良好的殺蟲活性。然而，肉桂醛對赤擬谷盜的殺蟲活性及對其生理生化的影響仍知之甚少。

昆蟲體內存在保護酶、解毒酶等多種酶，在維持機體自由基代謝及各項生理活動中具有重要作用［1819］，其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是較為重要的3種保護酶。賈變桃等［20］報道了虱螨脲對小菜蛾Plutella?xylostella體內保護酶活性的影響。馬新耀等［21］研究了朱砂葉螨Tetranychus?cinnabarinus?5日齡雌成螨經不同劑量的艾蒿精油處理后體內保護酶活性的變化。因此，保護酶活性的變化可作為選擇處理條件的重要指標。當前，關于赤擬谷盜成蟲在肉桂醛處理后的生物活性及體內的保護酶調控機制還鮮有報道?；诖?，本研究測定了肉桂醛對赤擬谷盜不同蟲態的熏蒸作用及成蟲體內的保護酶活性變化，以期為科學合理使用肉桂醛防治赤擬谷盜提供依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試蟲源

試驗所用赤擬谷盜為安徽農業大學植物病蟲害生物學與綠色防控實驗室飼養種群。將小麥粉和酵母粉按10∶1（m/m）比例混勻裝入罐頭瓶中，接入赤擬谷盜成蟲，置于溫度（27±1）℃，相對濕度（75±5）%的人工氣候箱中24?h黑暗飼養。將孵化后3?d和7?d分別設定為低齡幼蟲和高齡幼蟲;供試成蟲為羽化7?d活性較好的成蟲。

1.1.2?藥劑及試劑

98%肉桂醛購于江西雪松天然藥用油有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2?肉桂醛熏蒸活性測定

參照楊杉等［22］的方法測定肉桂醛對赤擬谷盜的熏蒸活性。將赤擬谷盜低齡幼蟲、高齡幼蟲、蛹和成蟲放入滅菌的250?mL三角瓶中。將98%肉桂醛滴于1?cm×6?cm的長方形濾紙片上，并快速將濾紙片懸垂于距三角瓶底部2～3?cm高處，密封瓶口。98%肉桂醛的熏蒸濃度（藥劑體積/容器體積）設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5?μL/L，熏蒸時間分別設置為24、48、72?h。每濃度每處理時間設3次重復，每重復30頭。以空白濾紙為對照。熏蒸在溫度（27±1）℃，24?h黑暗的人工氣候箱中進行。熏蒸結束后檢查并記錄赤擬谷盜死亡數，計算死亡率。死亡標準為用毛筆撥動蟲體，若無反應，則認為試蟲已死亡。?

死亡率=（死亡蟲數/總蟲數）×100%;

校正死亡率=［（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）］×100%。

1.3?酶活性測定

1.3.1?酶液的制備

根據1.2不同濃度熏蒸活性測定結果，選擇24?h的LC50研究肉桂醛對赤擬谷盜成蟲保護酶活性的影響，以無藥劑熏蒸處理作為對照，熏蒸時間分別設置為12、24、36、48、60?h，熏蒸方法同1.2。每處理3次重復。選取熏蒸后存活的赤擬谷盜成蟲?（0.1?g），將成蟲轉移到玻璃勻漿器并加入1?mL的10?mmol/L?PBS緩沖液進行研磨，研磨期間玻璃勻漿器一直處于冰中保持低溫。將樣本組織勻漿液離心，取上清液即為待測酶液，置于－20℃的冰箱中儲藏備用。

1.3.2?蛋白質含量的測定

配制BSA標準品和BCA工作液，按照總蛋白（BCA）測定試劑盒說明書操作進行。設置波長為580?nm，用酶標儀測定各孔的吸光度。每孔測定3次，每樣重復3次。

1.3.3?超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子（O-2），O-2可還原氮藍四唑生成藍色甲臜，后者在560?nm處有吸收;SOD可清除O-2，從而抑制了甲臜的形成。反應液藍色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。取待測酶液，按照SOD試劑盒說明書進行操作，測定560?nm處各孔的吸光度，代入公式計算SOD的活性，活性單位為U/mg。抑制百分率=（空白孔的吸光度－處理孔的吸光度）/空白孔的吸光度×100%;樣本中SOD活性=11.11×抑制百分率/（1-抑制百分率）×樣品稀釋倍數。

1.3.4?過氧化物酶（POD）活性的測定

POD在有過氧化氫存在的情況下，能使愈創木酚發生氧化，生成茶褐色物質，該物質在470?nm有最大光吸收。取待測酶液，按照POD試劑盒說明書操作，記錄470?nm下30?s時的吸光度A1和90?s后的吸光度A2。代入公式計算POD活性，活性單位為U/mg。樣本中POD活性=9?800×（A2A1）/蛋白稀釋倍數。

1.3.5?過氧化氫酶（CAT）活性的測定

H2O2在240?nm下有特征吸收峰，CAT能夠分解H2O2，使反應溶液240?nm下的吸光度隨反應時間而下降，根據吸光度的變化率可計算出CAT活性。取待測酶液，按照CAT試劑盒說明書操作。測定240?nm下各孔的吸光度為A1，1?min后測定吸光度為A2。代入公式計算CAT活性，活性單位為U/mg。樣本中CAT活性=764.5×（A1A2）/蛋白稀釋倍數。

1.4?數據處理

用?WPS?Office?2019?軟件初步整理數據并計算校正死亡率。使用?DPS?7.05軟件計算校正死亡率、卡方（χ2）、致死中濃度（LC50）等，并采用Duncan氏新復極差法比較同一時間不同處理濃度下在5%水平上的差異顯著性，Student’s?t檢驗兩個樣本之間在5%水平上的差異顯著性。

2?結果與分析

2.1?肉桂醛對赤擬谷盜的熏蒸作用

由表1可知，隨著肉桂醛濃度的增加，低齡幼蟲、高齡幼蟲、蛹和成蟲的校正死亡率均逐漸升高，在同一濃度下，校正死亡率隨處理時間的延長而增加。以2.5?μL/L處理試蟲72?h，低齡幼蟲、高齡幼蟲、蛹和成蟲的死亡率分別為63.35%、45.55%、39.98%和91.84%。

由表2可知，隨處理時間的增加，肉桂醛對赤擬谷盜成蟲的熏蒸毒力增強。其對赤擬谷盜成蟲24、48、72?h的LC50分別為2.28、1.73、1.28?μL/L。

2.2?肉桂醛對赤擬谷盜成蟲保護酶活性的影響

采用肉桂醛對赤擬谷盜成蟲24?h致死中濃度進行不同時間的熏蒸處理，處理后赤擬谷盜成蟲體內SOD、POD和CAT活性變化見圖1。如圖1a所示，熏蒸36～48?h，SOD活性顯著高于對照，并在48?h達到最大，隨后降低，但也顯著高于對照組（P＜0.05）。表明肉桂醛對赤擬谷盜成蟲體內SOD活性有明顯誘導作用。

如圖1b?所示，熏蒸12?h和24?h，POD活性與對照組無顯著差異。熏蒸36～60?h，POD活性持續顯著下降（P＜0.05），在60?h時POD活性降到最低，為對照組的45%。

如圖1c?所示，熏蒸24～48?h，CAT活性顯著高于對照（P＜0.05），其中，熏蒸36?h和48?h的CAT活性分別為對照的1.96和1.85倍。熏蒸60?h?CAT活性與對照組相比無顯著差異。

3?結論與討論

肉桂醛是肉桂精油的主要活性成分，存在于肉桂、風信子、玫瑰等植物精油中［23］。黃聰靈［24］的研究表明，肉桂醛對暗黑鰓金龜Holotrichia?parallela?2齡幼蟲有較好的熏蒸作用，死亡率隨濃度升高而增加。不同精油對不同發育階段的赤擬谷盜有不同的作用。侯志波等［25］的研究表明，雞骨柴揮發油對各發育階段的赤擬谷盜均具有熏蒸作用，且對成蟲的熏蒸活性高于幼蟲。張元臣等［26］研究報道，赤擬谷盜幼蟲和蛹受到北艾精油熏蒸后，幼蟲的死亡率高于蛹的死亡率。本研究中，肉桂醛對赤擬谷盜的熏蒸效果表現為成蟲優于幼蟲，對蛹的熏蒸效果最差。肉桂醛在害蟲的防控方面具有開發潛力。本文為害蟲綠色防控提供新的數據。

SOD、POD和CAT是昆蟲體內重要的保護酶。正常情況下，細胞內的自由基在3種酶的協同作用下處于一種動態平衡，但在不利環境下昆蟲體內酶系統的動態平衡受到破壞，對蟲體產生毒害，最終可能導致昆蟲死亡［27］。陸馳宇［28］研究表明，赤擬谷盜成蟲經八角茴香油熏蒸后，其體內CAT活性隨處理時間延長呈現先上升后下降趨勢，但總體高于對照，POD活力隨處理時間的延長表現為先激活后抑制作用。本研究中赤擬谷盜成蟲用肉桂醛24?h的LC50處理不同時間，CAT活性在24～48?h活性仍顯著高于對照組，POD活力則逐漸下降且最終低于對照組。程作慧等［29］研究報道，迷迭香處理對朱砂葉螨Tetranychus?cinnabarinus體內的SOD活性有激活作用。本研究也表明熏蒸處理導致赤擬谷盜成蟲體內的SOD活性升高，并在48?h達到最高，隨后開始下降，但仍顯著高于對照?？傮w來說，本試驗結果與上述報道基本一致，原因可能是肉桂醛熏蒸處理赤擬谷盜成蟲后，蟲體內動態平衡被打破，產生應激反應。但熏蒸時間不同對不同保護酶的影響也不同，可能是試蟲在不同環境下采取的一種生存對策。

本試驗結果顯示，肉桂醛對成蟲的熏蒸效果最好，并且顯著影響成蟲體內3種保護酶的活性。肉桂醛作為肉桂精油的主要成分［30］，其與其他精油或植物源農藥協同增效還需進一步研究。本課題組今后也將繼續探究肉桂醛對赤擬谷盜成蟲的作用機理，為進一步開發利用新型的植物源農藥，實現儲糧害蟲的綠色防控奠定可行的理論基礎。

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