廣東番茄巨芽病植原體的分子鑒定

湯亞飛 李正剛 佘小漫 于琳 藍國兵 何自福

摘要

2022年，對在廣東省湛江市廉江市田間發現的疑似番茄巨芽病病株，利用分子生物學方法對其相關植原體進行了鑒定。以番茄病株葉片總DNA為模板，利用植原體16S?rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1進行PCR擴增，獲得了廣東番茄巨芽病植原體（TBBGD2022）16S?rRNA基因片段（1?430?bp，GenBank登錄號為ON102780）。16S?rRNA基因序列相似性分析顯示，TBBGD2022與16SrⅡ組植原體菌株的相似性較高，為96.82%～100%，其中與隸屬于16SrⅡV亞組的6個植原體株系相似性為100%。系統進化分析顯示，TBBGD2022與16SrⅡ組各植原體株系聚類在一個大分支，并與16SrⅡV亞組成員聚類在一個小分支，親緣關系較近。16S?rRNA?基因相似系數分析表明，TBBGD2022與16SrⅡV亞組的參照株系‘Praxelis?clematidea’?phyllody?phytoplasma?（GenBank登錄號：KY568717）?的相似系數為1.00。上述研究結果表明，廣東番茄巨芽病植原體隸屬16SrⅡV亞組成員。本文首次報道在廣東發現番茄巨芽病，通過其16S?rRNA序列分析進一步確定了其相關植原體的分類地位，為該病害的防控提供了科學依據。

關鍵詞

番茄巨芽病;?植原體;?16S?rRNA;?分子鑒定

中圖分類號：

S?436.412

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022487

Molecular?identification?of?phytoplasma?associated?with?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province

TANG?Yafei， LI?Zhenggang，?SHE?Xiaoman，?YU?Lin，?LAN?Guobing，?HE?Zifu*

（Institute?of?Plant?Protection，?Guangdong?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Green?

Prevention?and?Control?on?Fruits?and?Vegetables?in?South?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?

Guangdong?Provincial?Key?Laboratory?of?High?Technology?for?Plant?Protection，?Guangzhou?510640，?China）

Abstract

In?2022，?the?suspected?tomato?big?bud?diseased?plants?were?found?in?Lianjiang?city，?Zhanjiang?city，?Guangdong?province.?The?related?phytoplasma?was?detected?and?identified?using?molecular?technology.?The?16S?rRNA?gene?fragment?（1?430?bp，?GenBank?accession?no.?ON102780）?of?phytoplasma?associated?with?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province?（TBBGD2022）?was?amplified?from?total?DNA?of?diseased?tomato?plants?using?universal?primers?R16mF2/R16mR1.?Sequence?similarity?based?on?16S?rRNA?gene?sequence?showed?that TBBGD2022?had?higher?similarity?（96.82%-100%）?with?phytoplasmas?from?16SrⅡ?group，?while?had?highest?similarity?（100%）?with?six?phytoplasmas?belonged?to?16SrⅡV?subgroup.?Phylogenetic?analysis?showed?that?TBBGD2022?formed?a?large?evolutionary?branch?with?16SrⅡ?group?phytoplasmas，?and?a?small?evolutionary?branch?with?16SrⅡV?subgroup?phytoplasmas.?iPhyClassifier?analysis?for?16S?rRNA?gene?showed?that?the?similarity?coefficient?between?TBBGD2022?and?‘Praxelis?clematidea’?phyllody?phytoplasma?（GenBank?accession?no.?KY568717）?of?the?reference?strain?from?16SrⅡV?subgroup?was?1.00.?These?results?showed?that?phytoplasma?associated?with?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province?belonged?to?the?16SrⅡV?subgroup.?In?this?paper，?tomato?big?bud?disease?was?discovered?firstly?in?Guangdong，?and?the?taxonomic?status?of?its?related?phytoplasma?was?further?determined.?The?results?provide?the?scientific?basis?for?controlling?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province.

Key?words

tomato?big?bud?disease;?phytoplasma;?16S?rRNA;?molecular?identification

植原體是一類無細胞壁，難以人工培養的專性寄生于活性細胞的植物病原菌，由Doi等1967年發現并報道［1］。該病原菌屬細菌界Bacteria柔膜菌綱Mollicutes植原體暫定屬Candidatus?（Ca.）?genus?Phytoplasma［23］，主要通過取食植物韌皮部的葉蟬、木虱等刺吸式口器昆蟲傳播，也可通過嫁接或菟絲子傳播。植原體的寄主種類多，可侵染1?000多種植物，常引起植株表現叢枝、花變葉、畸形、黃化、小葉等典型癥狀，嚴重影響全球各地農林業生產［4］。關于植原體的鑒定與分類，由于不能在人工培養基上進行分離、培養，目前主要依據其16S?rRNA序列差異，以及rp、secY等保守基因序列、傳播介體、天然植物寄主。截止到2019年6月，依據16S?rRNA?基因核苷酸序列相似性、限制性片段長度多態性，國際上將已鑒定出的植原體劃分為52個暫定種（‘Ca.Phytoplasma’）、34個組（group）和100多個亞組（subgroup）［4］。

番茄Solanum?lycopersicum?L.是廣東省主要的蔬菜品種之一，在全省各蔬菜產區均有廣泛種植。近幾年，冬種番茄在粵西地區發展迅速，面積逐年增加，已成為湛江市（雷州、遂溪、廉江）、茂名市電白等地農民收入來源的主要經濟作物。2022年以來，本團隊調查中發現廣東省湛江市廉江市的冬種番茄產區發生疑似番茄巨芽病的新病害，田間病株主要表現為葉小、頂部枝梢和花柄肥大、腋芽上叢生直立的不定芽等癥狀。

番茄巨芽?。╰omato?big?bud?disease，TBB）是由植原體引起的一種病害，最早發現于澳大利亞［5］，已在美國［6］、意大利［7］、伊朗［8］、印度［9］、埃及［10］、約旦［11］、巴西［12］、中國［13］等多個國家有報道。在我國，唐偉文等1982年首次在海南發現番茄巨芽?。?3］，隨后，該病害在新疆和云南也有報道［1415］。筆者采用分子生物學方法，對發生在廣東省廉江市疑似番茄巨芽病的病株樣品進行檢測，進一步對相關植原體的16S?rRNA基因進行克隆和序列分析，明確其分類地位，為防治該病害提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料和試劑

5份疑似巨芽病的櫻桃番茄病樣2022年2月采集于廣東省廉江市番茄種植地。植物基因組DNA抽提試劑盒（Easypure?Plant?Genomic?DNA?Kit）和大腸桿菌Escherichia?coli?T1化學感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;Premix?TaqTM、pMD?19T?Vector購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2?病樣總DNA的抽提

取番茄病樣100?mg，利用植物DNA提取試劑盒抽提其總DNA，具體步驟參照按試劑盒說明書?？侱NA溶解于40?μL?滅菌的超純水中，-20℃冰箱保存備用。

1.3?16S?rRNA基因的擴增

利用擴增植原體16S?rRNA基因的通用引物R16mF2（5′CATGCAAGTCGAACGGA3′）/R16mR1（5′CTTAACCCCAATCATCGAC3′）［16］，對待測病樣總DNA進行PCR檢測，預期擴增目的片段大小為1.4?kb。反應體系25.0?μL：待測樣品總DNA?1.0?μL，?Ex?TaqTM?Premix?12.5?μL，上游引物（10?μmol/L）?1.0?μL，下游引物（10?μmol/L）?1.0?μL，超純水9.5?μL。反應程序：95℃?預變性4?min;95℃?1?min，55℃?1?min，72℃?90?s，35個循環;72℃延伸10?min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.4?基因克隆與測序

將所獲目的片段進行純化、連接至pMD19T載體，采用熱激法將其轉化到大腸桿菌T1感受態細胞，吸取80.0?μL菌液涂布在含100?μg/mL?Amp、40?μL/mL?Xgal的LB固體培養基平板上，37℃?倒置培養過夜;從每個平板隨機挑取3個陽性單菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5?序列分析

利用DNAStar的SeqMan對序列進行拼接，將所得DNA序列在GenBank數據庫中進行BLASTn搜索，確定是否為植原體基因序列;利用在線分析工具MUSCLE，將所獲得的16S?rRNA基因序列與已報道的相關序列進行相似性分析。采用MEGA?6.06的最大似然法（maximum?likelihood，ML）［17］構建基于16S?rRNA基因的系統進化樹，Bootstrap值設置為1?000。進一步將16S?rRNA基因相關片段序列通過植原體在線分類軟件iPhyClassifier進行虛擬RFLP分析和計算相似系數，確定其分類地位［18］。

2?結果與分析

2.1?田間癥狀

番茄病株田間主要表現為葉小、頂部枝梢呈淡紫色、肥大，直立向上呈圓錐形，花柄肥大、花萼顯著膨大，在葉腋處長出1個粗短肥大的腋芽，在腋芽頂部叢生若干個不定芽，病株不結果或結出少量堅硬的圓錐形小果實（圖1），與已報道的番茄巨芽病田間癥狀類似。

2.2?PCR檢測結果

利用擴增植原體16S?rRNA基因的引物R16mF2/

R16mR1對采集的5份番茄巨芽病疑似病樣分別進行PCR檢測，電泳結果顯示（圖2），能從5份病樣中擴增出預期大小的目的片段，健康植株中未擴增出任何片段。這表明采集于廣東省廉江市的番茄巨疑似病樣中存在植原體，命名為廣東番茄巨芽植原體（TBBGD2022）。

2.3?16S?rRNA基因序列分析

克隆與測序分析結果表明，TBBGD2022的16S?rRNA片段大小為1?430?bp?（GenBank登錄號為ON102780）。BLASTn結果顯示，TBBGD2022與花生叢枝植原體組（16SrⅡ）成員的16S?rRNA序列相似性最高。MUSCLE分析結果顯示（表1）：TBBGD2022與16SrⅡ組各植原體株系的16S?rRNA基因序列相似性為96.82%～100%，與其他組植原體的相似性較低，為88.84%～91.42%;其中與來自中國海南、臺灣、廣東的隸屬于16SrⅡV亞組的6個植原體株系以及來自印度的番茄巨芽病株系相似性最高，為100%。進一步比較發現，TBBGD2022與印度、中國、伊朗、澳大利亞、埃及、美國、新喀里多尼亞、坦桑尼亞、巴西報道的28個番茄巨芽植原體相關株系的16S?rRNA基因序列相似性為88.84%～100%，其中與印度報道的TBBOT03株系相似性為100%，與中國報道的YNym、YM?株系相似性分別為99.93%、99.60%，而與中國新疆報道的ZYT3、syc1?株系相似性較低，為90.66%。

以柑橘黃龍病亞洲種廣東株系（Candidatus?Liberibacter?asiaticus?GuangdongHP，GenBank登錄號為DQ432005）的16S?rRNA序列為外組，利用MEGA?6.06的最大似然法對TBBGD2022與33個植原體株系進行系統進化分析，結果顯示（圖3），TBBGD2022與隸屬于16SrⅡ組的15個番茄巨芽植原體株系及5個其他植原體株系聚集在一個大分支，親緣關系較近;而與隸屬于16SrⅠ、16SrⅢ、16SrⅥ、16SrⅨ、16SrⅫ組的13個番茄巨芽植原體株系親緣關系較遠。進一步以隸屬于16SrⅠ組的翠菊黃化植原體（Aster?yellows?phytoplasma，GenBank登錄號為AY389828）的16S?rRNA序列為外組，對TBBGD2022與16SrⅡ組各亞組相關株系進行系統進化分析，結果顯示（圖4），其與16SrⅡA、16SrⅡD、16SrⅡV、16SrⅡP、16SrⅡQ和16SrⅡU等6個亞組植原體株系親緣關系近，形成一個獨立的大分支，其中與16SrⅡA、16SrⅡD、16SrⅡV?3個亞組親緣關系最近。

2.4?16S?rRNA基因序列的iPhyClassifier在線分析

利用植原體在線分類軟件iPhyClassifier對TBBGD2022的16S?rRNA基因中引物R16F2n/R16R2之間的片段進行虛擬RFLP分析，結果顯示（圖5）：AluⅠ、BamH?Ⅰ、Bfa?Ⅰ、BstU?Ⅰ、Dra?Ⅰ、EcoR?Ⅰ、Hae?Ⅲ、Hha?Ⅰ、Hinf?Ⅰ、Hpa?Ⅰ、Hpa?Ⅱ、KpnⅠ、Sau3A?Ⅰ、Mse?Ⅰ、RsaⅠ、Ssp?Ⅰ和TaqⅠ?17種限制性內切酶虛擬RFLP?圖譜與16SrⅡV亞組的參考株系‘Praxelis?clematidea’?phyllody?phytoplasma?（登錄號：KY568717）?的酶切圖譜相似性最高，相似系數為1.00，表明TBBGD2022屬于16SrⅡV亞組成員。

3?結論與討論

番茄巨芽病是番茄生產中一種毀滅性病害，植株一旦感染該病后，就無法正常開花結果。該病害1902年最早在澳大利亞發現，我國1982年最先在海南發現。2022年，本團隊在廣東廉江市發現了疑似番茄巨芽病新病害，PCR檢測表明該病樣感染了植原體，命名為廣東廉江番茄巨芽植原體（TBBGD2022），屬16SrⅡV亞組。本研究是番茄巨芽病在廣東省發生的首次報道。

植原體是危害蔬菜作物的重要病原之一，已報道至少有16個組和超過21個亞組的植原體與蔬菜病害相關，其中與番茄巨芽病相關的至少有16SrⅠ、16SrⅡ、16SrⅢ、16SrⅤ、16SrⅥ、16SrⅨ、16SrⅫ?7個組的植原體［19］。我國海南、云南、新疆三?。ㄗ灾螀^）有番茄植原體相關病害發生的報道，并對其進行了鑒定。唐偉文等通過癥狀、電鏡觀察、嫁接傳染、抗菌素處理明確引起海南番茄巨芽病和叢枝病的病原為植原體［13］，后續未見進一步相關研究報道。隨著分子生物學技術的發展，Dong等明確與云南番茄黃化病有關的植原體屬于16SrⅡA組［14］。Du等鑒定出與新疆番茄巨芽病相關植原體屬于16SrⅥ組［15］。本文采用分子生物學技術明確與廣東番茄巨芽病相關的植原體屬于16SrⅡV亞組?？梢?，引起廣東番茄巨芽病的植原體與我國新疆和云南株系存在差異，其中與新疆株系的差異較大，二者16S?rRNA基因序列相似性僅為90.66%，且隸屬不同組;與云南株系的差異較小，二者16S?rRNA基因序列相似性99.93%，均隸屬16SrⅡ組。

16SrⅡV亞組植原體是2017年首次從海南假臭草叢枝病樣中鑒定出的一個新亞組［20］，目前在綠豆Vigna?radiata?（L.）?Wilczek［21］、大豆Glycine?max?（L.）?Merr.［22］、皺子白花菜Cleome?rutidosperma?DC.?Prodr.［23］、瓜葉栝樓Trichosanthes?cucumerina?L.［24］、一點紅Emilia?sonchifolia?（L.）?DC.［25］、皺葉煙草Nicotiana?plumbaginifolia?Viv.［26］、長序莧Digera?muricata?（L.）?Mart.［27］、灰毛豆Tephrosia?purpurea?（L.）?Pers.［28］、馬松子Melochia?corchorifolia?L.［29］、花生Arachis?hypogaea?L.［30］已有報道。本文首次報道了在番茄上鑒定到16SrⅡV亞組植原體，為研究植原體多樣性、分布以及病害防控提供了基礎數據。

廣東省地處熱帶和亞熱帶地區，常年高溫高濕，物種資源豐富，植物和介體昆蟲周年可生長與繁殖，為植原體在內的植物病害發生提供了十分有利的條件。廣東地區已報道的植原體相關病害有花生叢枝?。?032］、水稻橙葉?。?3］、茄子變葉?。?4］、桉樹黃化（叢枝）?。?5］、桑樹黃化矮縮?。?6］、棗瘋?。?7］等，已給廣東省農業生產造成了嚴重影響。本研究首次在廣東湛江廉江發現植原體侵染引起的番茄巨芽病，該病害的病原TBBGD2022與發生在廣東湛江遂溪的花生叢枝?。?0］的病原分類地位一致，均為16SrⅡV亞組植原體。由此推測，該植原體病害極有可能通過介體昆蟲在該區域蔓延。由于目前還缺乏有效防治植原體病害的藥劑，防治傳病介體昆蟲對防控該類病害的擴散和發生至關重要。因此，下一步急需開展傳菌介體昆蟲種類鑒定、介體昆蟲的田間帶菌情況監測等研究工作，為植原體病害的防控提供科學依據。

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（責任編輯：田?喆）