赫氏真厚螺的檢疫鑒定

王沛 胡美玲 姜嬌 張衛紅 陳宇 林金成 林陽武 周衛川

摘要

赫氏真厚螺Euhadra?herklotsi是一種重要的園藝有害生物。本文采用貝殼形態、生殖系統解剖和分子生物學相結合的方法對福建口岸截獲的一種蝸牛進行檢疫鑒定，結果表明，該蝸牛為赫氏真厚螺，并與近似種的形態鑒別特征進行了比較，討論了蝸牛序列比對鑒定方法的適用性，為國境口岸防御該蝸牛的入侵提供了科學依據。

關鍵詞

赫氏真厚螺;?貝殼形態;?生殖系統解剖;?分子特征;?植物檢疫

中圖分類號：

S?41

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022726

Quarantine?and?identification?of?Euhadra?herklotsi

WANG?Pei1，2，?HU?Meiling1，2，?JIANG?Jiao3，?ZHANG?Weihong4，?CHEN?Yu1，2，?LIN?Jincheng5，

LIN?Yangwu1，?ZHOU?Weichuan1，2*

（1.?Technology?Center?of?Fuzhou?Customs?District，?Fuzhou?350001，?China;?2.?Fujian?Key?Laboratory?of?

Inspection?and?Quarantine?Technology?Reserach，?Fuzhou?350001，?China;?3.?Zhejiang?Natural?Nature?Museum，?

Hangzhou?310014，?China;?4.?College?of?Life?Science?and?Technology，?Xinjiang?University，?Urumqi?830000，?

China;?5.?Fuzhou?Customs?District，?Fuzhou?350015，?China）

Abstract

Euhadra?herklotsi?is?an?important?horticultural?pest.?In?this?paper，?a?snail?intercepted?at?Fujian?port?was?quarantined?and?identified?by?the?methods?of?shell?morphology，?reproductive?system?anatomy?and?molecular?biology.?The?results?showed?that?the?snail?was?E.herklotsi，?and?the?morphological?identification?characteristics?among?E.herklotsi?and?its?sibling?species?were?compared.?In?addition，?the?applicability?of?the?sequence?alignment?identification?method?was?discussed.?This?paper?provided?scientific?basis?for?preventing?the?invasion?of?this?snail?at?the?border?port.

Key?words

Euhadra?herklotsi;?shell?morphology;?reproductive?system?anatomy;?molecular?characteristic;?plant?quarantine

赫氏真厚螺Euhadra?herklotsi?（Martens，?1861）隸屬于軟體動物門Mollusca，腹足綱Gastropoda，柄眼目Stylommatophora，巴蝸?？艬radybaenidae，真厚螺屬Euhadra［1］，是國際植物檢疫中備受關注的一種危險性有害生物。該蝸牛主要分布于日本和韓國，不但嚴重為害各種蔬菜、瓜果、花卉和農作物，為農業生產上的重要有害生物，而且是許多人畜共患寄生蟲的中間宿主，影響人畜健康［25］。此外，該螺爬行后可留下銀灰色的黏液痕跡，嚴重降低水果蔬菜等作物的商品價值，影響居民區和風景區的環境衛生。

赫氏真厚螺常生活在山區、丘陵地帶潮濕的灌木叢、草叢、石塊或落葉下，喜食植物多汁的嫩葉及嫩芽部分［24］，故對園藝作物危害最大。該蝸牛晝伏夜出，常藏匿于陰暗潮濕處，通常以休眠方式隨貨物和木質包裝材料遠距離傳播。2016年福建口岸從日本進境旅客攜帶物中首次截獲赫氏真厚螺，該蝸牛在中國大陸尚無分布記錄［67］，因此必須加強檢疫，嚴防其入侵和為害。目前真厚螺屬的分類與鑒定仍以貝殼形態為主，但貝殼形態常因地理環境的變化而變異，對一些貝殼特征不典型的標本容易造成誤定［89］。本文采用貝殼形態、軟體解剖和分子生物學相結合的方法研究了該蝸牛的鑒定技術，并與近似種的形態鑒別特征進行了比較，討論了蝸牛序列比對鑒定方法的適用性，主要結果報道如下。

1?材料和方法

1.1?試驗材料

2016年福建口岸從日本進境旅客攜帶物中截獲的蝸牛12只，其中4只活體標本先按照《軟體動物常規檢疫規范（SN/T?30672011）》［10］中方法進行滅活和脫水處理，然后-40℃冷凍保存備用?？諝吮鞠磧艉娓珊蟪乇４?。

1.2?試驗方法

1.2.1?形態學鑒定

用電子游標卡尺測量成螺貝殼的殼高和殼寬，精度為0.1?mm。用放大鏡觀察貝殼的形態特征，生殖系統解剖在體視顯微鏡（ZEISS?Stemi?2000）下操作，根據檢驗檢疫行業標準《軟體動物常規檢疫規范（SN/T?30672011）》［10］和Dillon［11］的報道進行貝殼形態的觀察、測量和描述。按照Gómez［12］的方法進行生殖系統的解剖、繪圖和描述。

用單反相機（CANON?550D），分別拍攝貝殼標本的正側面、背面和腹面，以電子影像文件儲存。

1.2.2?分子生物學鑒定

1.2.2.1?基因組DNA提取及PCR擴增

取赫氏真厚螺腹足肌肉0.02?g，按照天根生化科技（北京）有限公司的TIANamp?Genomic?DNA提取試劑盒說明書提取基因組總DNA。利用線粒體COⅠ基因通用引物（LCO1490：?5′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′;?HCO2198：?5′

TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）進行PCR擴增［13］。

PCR反應體系：DNA模板（100?ng/μL）2?μL，?LCO1490（10?μmol/L）和?HCO2198（10?μmol/L）各0.5?μL，2×Master?Mix?10?μL，用超純水定容至?20?μL。PCR反應程序為：94℃預變性?5?min;94℃?變性?50?s，45℃退火?30?s，72℃延伸?50?s，30?個循環;72℃延伸?10?min;4℃保存。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標片段送生工生物工程（上海）有限公司進行雙向測序。

1.2.2.2?序列拼接與比對

將雙向測序結果用序列分析軟件?BioEdit?V.7.0［14］進行序列的拼接和人工校對，并與GenBank已公布的赫氏真厚螺的?COⅠ基因序列進行比對。

2?結果與分析

2.1?形態學鑒定

2.1.1?貝殼形態

材料檢查：來自日本南部，成螺活體4個（QRB75～QRB78），空殼8個，其中成螺6個（QRB79～QRB84），幼螺2個（QRB85～QRB86）。

測量結果：成螺，殼高11.5～25.0?mm，?殼寬20.5～36.1?mm。

貝殼形態：貝殼大，殼質厚，堅實，呈矮圓錐形。有5～6個螺層，前幾個螺層緩慢增長，略膨脹，螺旋部低矮。體螺層近圓形，膨大，其高度約為殼高的2/3，在殼口處向右下方傾斜。殼頂鈍，縫合線深。殼面顏色多變，乳白色、淺黃色、紫褐色，有稠密而較粗的生長線和刻紋。體螺層周緣有一條螺旋狀的紫褐色條帶，并向螺旋部延伸，逐漸靠近縫合線，最終與縫合線完全重疊。殼口馬蹄形，向下傾斜?？诖酵庹?，厚，淺紫色。軸唇在臍孔處略外折，內唇貼覆于體螺層上，形成稍厚的胼胝部。臍孔大而深，呈洞穴狀，周圍紫褐色。

圖1?赫氏真厚螺貝殼形態

Fig.1?Shell?morphology?of?Euhadra?herklotsi

2.1.2?生殖系統

在蠟盤上解剖軟體并分離出生殖系統后，按Gómez［12］的方法將生殖系統特征描述如下：矢囊大，副矢囊中等大小，似長柱形。黏液腺約13枝，呈放射狀排列。受精囊橢圓形，受精囊柄長。輸卵管中等粗細。輸精管細，長度約為輸卵管的2.5倍。鞭狀體末端細小。陰莖牽引肌略粗，短。陰莖長，中等粗細。本文描述的生殖系統特征（圖2）與前人的記述基本一致［4］，但后者沒將黏液腺進行分離和統計。

圖2?赫氏真厚螺生殖系統

Fig.2?Reproductive?system?of?Euhadra?herklotsi

2.2?分子生物學鑒定

活體標本（實驗室冷凍標本編號：QRB75），經DNA提取、PCR擴增、雙向測序、序列拼接和人工校對后，得到682?bp長度序列，經與GenBank已發表的赫氏真厚螺（登錄號：AB852699.1）線粒體COⅠ基因片段序列（533?bp）比對，覆蓋率為100%，序列一致性為97.75%。根據已有的陸生軟體動物分子系統學文獻分析，有的物種同源性大于98%才確認為同種［1517］，也有的學者認為同源性大于94%即可認為是同一物種［18］，這與某些學者描述的其他動物一致性大于98%可認為是同種差別較大［1920］，不同的物種判定標準不同。對于陸生軟體動物可能的原因是移動能力弱，容易形成地理種群隔離，種群間的基因交流遠不及飛翔的昆蟲等動物［2122］。

3?結論和討論

赫氏真厚螺在日本和韓國廣泛分布，本文對其進行了貝殼形態、軟體解剖和分子生物學研究，以期為相關人員提供鑒定技術資料。該蝸?？呻S苗木、花卉、運輸工具、木質包裝材料、未經加工的其他植物性材料等遠距離傳播。我國迄今為止尚無該蝸牛分布，但從該蝸牛目前分布的緯度來看，我國大部分地區的生態環境和氣候條件適合該蝸牛生棲繁殖，且其為雜食性，寄主廣泛。因此，建議有關部門加強對其檢疫，警惕其傳入國內。

赫氏真厚螺、阿瑪麗真厚螺E.amaliae?和亞頦真厚螺E.subnimbosa都是右旋真厚螺，形態上較為相似，且在日本均有分布［1，6］，容易誤定。三者的主要鑒別特征列于表1，供檢疫鑒定時參考。

在具體的檢疫實踐中，往往難以獲得典型的標本，如送鑒的標本為幼螺或不成熟時，形態鑒定就十分困難，由于檢測周期的限制，飼養為成螺再鑒定則

更不可能［23］，成螺貝殼也會因環境影響而形成不典型的貝殼特征，需要用其他鑒定方法進行輔助鑒定［2122］。本文測定的COⅠ序列為赫氏真厚螺的分子比對鑒定提供了新的技術方法，PCR技術在國境口岸基層檢驗檢疫部門已經普及，該項技術以生物基因組DNA序列比對為基本依據，具有檢測周期短、特異性強、靈敏度高等特點。目前，無脊椎動物已有公認的線粒體COⅠ基因通用引物，技術成熟，受檢測目標的形態變異、成熟度等方面影響較?。?4］，特別適合于卵粒、幼螺等不具備形態鑒定條件樣品的快速檢測鑒定。

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