沉默NAC-1基因對人卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化療敏感的影響

李冬冬,王 莉,鐘 潔,凌晨祁,韓 英

(上海理工大學附屬市東醫院婦科,上海 200438)

卵巢癌是嚴重威脅女性健康的婦科腫瘤,是致死率最高的女性生殖系統惡性腫瘤。在全球范圍內,每年約有20萬人被診斷為卵巢癌,12.5萬人死于此病[1-2]。卵巢癌發病隱匿,早期癥狀不明顯,且發病率呈逐年上升趨勢,大多數卵巢癌患者確診時已屬晚期,患者5年存活率僅為32%[3]。由于多數卵巢癌患者發現時即為晚期,嚴重制約著手術治療的療效。因此,輔助化療成為卵巢癌治療最主要的輔助治療手段,其中順鉑(Cisplatin)是目前治療卵巢上皮癌最有效的首選藥,有效率達29%～35%,但長期臨床應用暴露出順鉑的諸多問題,如易產生耐藥,導致腫瘤化療失敗?；熀箜樸K耐藥是造成卵巢癌患者5年生存率較低(僅30%左右)的重要原因[4-5]。目前順鉑耐藥的機制尚不清楚,其受到多方面因素的影響。深入研究卵巢癌順鉑耐藥機制對提高卵巢癌的治療效果,改善卵巢癌患者生存質量具有重要意義。

核轉錄因子NAC-1(nucleus accumbens 1,又稱伏隔核因子1)是BTB/POZ轉錄因子家族成員,其二聚體復合物可參與多種生物功能調控,如基因轉錄、細胞增殖和凋亡、蛋白泛素化降解、維持干細胞多能性等[6]。近年來隨著NAC-1研究的不斷深入,越來越多的證據表明NAC-1與卵巢癌密切相關,其對腫瘤細胞的增殖發揮重要作用,同時NAC-1可能參與腫瘤的化療抵抗。有研究顯示,NAC-1表達上調與原發性卵巢癌接受順鉑等化療后的復發密切相關,復發卵巢癌化療后組織中NAC-1表達水平顯著高于未化療的原發性卵巢癌[7-8]。本課題組前期采用siRNA-NAC-1抑制NAC-1表達后,卵巢癌耐藥株(SKOV-3/DDP)細胞凋亡率顯著提高,細胞生存率下降,表明抑制NAC-1能有效提高SKOV-3/DDP細胞順鉑敏感性[9]。因此,通過控制NAC-1信號通路促進腫瘤細胞衰老的發生,可能成為增強腫瘤化療療效的新手段。本研究采用LV4-LUC-GFP慢病毒轉染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP細胞株,然后建立人卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,研究了NAC-1基因對裸鼠移植瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c Nude小鼠購自北京維通利華,RPMI 1640培養基及新生小牛血清購自美國Gibco公司; gene expresso轉染試劑購自南京邁極;注射用順鉑購自齊魯制藥;其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理 使用LV4-LUC-GFP慢病毒轉染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP細胞株,用SKOV3/DDP-459(Sh1)、SKOV3/DDP-522(Sh2)、SKOV3/DDP-1431(Sh3)三條ShRNA進行干預,ShRNA序列見表1。干預后收集細胞沉淀進行RT-PCR檢測,GAPDH引物序列:上游為GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC,下游為TGATGACCCTTTTGGCTCCC;NAC1引物序列:上游為CTCCTGGCCTCCTTCTTTGA,下游為CTCGATCTTGCCCGTTTCAC。SKOV3/DDP細胞株培養于含10%胎牛血清的McCoy's 5 A培養液。收集指數生長期細胞,無血清McCoy's 5 A重懸至密度1×108/mL,再按1∶1體積與基質膠混合均勻用于接種。

表1 NAC-1基因沉默ShRNA序列

1.2.2 動物實驗分組 待腫瘤生長至約100mm3時,剔除腫瘤體積過大或過小的老鼠,最終挑選24只荷瘤鼠。將小鼠隨機分成4組(每組6只):對照組、對照+順鉑(2mg/kg)組、實驗組、實驗+順鉑(2mg/kg)組。于小鼠右側腋下(前肢)皮下注射接種密度為5×107細胞,注射體積0.2mL,注射后緩慢拔針,注射后觀察小鼠狀態無異常后放入原籠位飼養,2h后再次觀察小鼠無異常。常規監測包括腫瘤細胞對小鼠正?；顒拥挠绊?腫瘤細胞對小鼠體重的影響等,包括實驗動物的活動性,攝食和飲水情況,體重增加或降低情況,眼睛、被毛及其它異常情況。每2天測量并記錄1次腫瘤長短徑。

1.2.3 順鉑對裸鼠移植瘤模型治療效果觀察 待腫瘤生長至100mm3左右時,各組治療后測量并記錄移植瘤長徑、寬徑。計算移植瘤體積,移植瘤體積=1/2×長徑×寬徑2,記錄并觀察不同組腫瘤的體積變化,并繪制腫瘤生長曲線。進行順鉑給藥處理20d后將裸鼠脫臼處死,稱瘤體重量。

1.2.4 轉錄組測序分析 選取對照組+順鉑組和實驗組+順鉑小鼠各2個瘤體標本,采用RNA提取試劑盒提取瘤體總RNA,經質量控制檢測合格后開始構建測序文庫。文庫構建及轉錄組測序由武漢賽維爾生物科技有限公司Illumina測序平臺完成。

1.2.5 差異表達基因分析 使用R語言limma包分析兩組樣品間的差異表達,篩選出DEGs,標準為P<0.05,|log2FC|>1?；诤Y選出的差異基因,使用Gene Ontology數據庫和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫進行差異表達基因富集分析,分析可能生物學過程及信號通路。

1.2.6 關鍵基因篩選及分析 使用STRING數據庫(https://string-db.org/)構建DEGs編碼蛋白互作網絡,結合Cytoscape(3.9.1版)中CytoHubba插件(0.1版)的MCC算法、Degree 算法、Closeness算法依次篩選節點中心度前20位的基因;韋恩圖篩選3種算法共有的基因作為關鍵基因;使用Metascape網站(https://metascape.org/)在線分析這些共同基因的基因功能。

2 結 果

2.1 NAC-1基因沉默SKOV3/DDP細胞株的構建 慢病毒表達載體經構建、包裝、純化后,進一步驗證感染效果和干擾效果,采用LV4-LUC-GFP慢病毒進行轉染測試,結果顯示MOI 為200時轉染效果較好(圖1A),RT-PCR結果顯示.SKOV3/DDP-522(Sh2)沉默效果最好(P<0.05),可用于后續實驗(圖1B)。

圖1 NAC-1慢病毒表達載體效果評價

2.2 抑制NAC-1基因卵巢癌荷瘤裸鼠治療效果 在實驗周期內,24只裸鼠均存活,皮下均有腫瘤形成,各組接種部位未出現紅腫、破潰等表征。對照組小鼠腫瘤體積由(116.23±7.25)mm3增長到(1271.52±261.93)mm3,順鉑化療后腫瘤體積顯著縮小,第20天時腫瘤體積為(560.11±113.17)mm3,而抑制NAC-1基因同時給予順鉑化療組腫瘤體積為(363.40±120.40) mm3。與順鉑化療組相比,抑制NAC-1基因后裸鼠皮下腫瘤的體積變小(圖2A、C)。第20天時檢測四組瘤體重量分別為對照組(1.20±0.25)g,對照+順鉑組(0.57±0.12)g,實驗組(1.13±0.23)g,實驗+順鉑組(0.31±0.13)g,實驗+順鉑組瘤體重量最輕,與對照組+順鉑組瘤體存在顯著性差異(圖2B、D),表明抑制NAC-1基因能夠顯著提高順鉑對裸鼠卵巢癌荷瘤的治療效果。

圖2 抑制NAC-1基因后裸鼠皮下腫瘤生長情況

2.3 兩組瘤體組織差異表達基因(DEGs)篩選 對照+順鉑組和實驗+順鉑組兩組的轉錄組結果進行表達量差異統計分析(P<0.05,|log2FC|>1),篩選出抑制NAC-1基因后順鉑化療瘤體中差異表達的基因共1028個(圖3A和B),其中抑制NAC-1基因后發生顯著下調的基因有460個,顯著上調的基因有568個。

圖3 差異基因篩選與分析結果

2.4 GO富集分析 為了揭示所篩選的DEGs的生物學功能,對這些DEGs進行GO富集分析,共富集到736個顯著差異的條目,其中生物過程類(BP)569個,主要對代謝、黏附、吞噬、壞死、趨化等條目造成影響;細胞組分類(CC)62個條目,主要對收縮纖維、中間絲、肌原纖維、軸突等細胞微結構造成影響;分子功能(MF)105個條目,主要與G蛋白偶聯肽受體活性、肽受體活性、免疫受體活性、細胞因子活性、受體配體活性等有關,各選取BP、CC、MF排名前10的GO條目繪制柱狀圖 (圖3C)。由此可見,這些DEGs多與生物學過程中的細胞代謝、有絲分裂、壞死、炎癥、信號傳遞等相關。

2.5 KEGG富集分析 篩選得到的差異表達基因用KEGG 數據庫進行通路注釋,結果顯示這些DEGs主要分布在62條通路中,取KEGG前20條目繪制氣泡圖(圖3D)。主要與NAC-1基因相關的信號轉導途徑有細胞因子-細胞因子受體相互作用、白細胞跨內皮遷移、神經活性配體-受體相互作用、細胞黏附分子、壞死、ECM受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路等。

2.6 蛋白相互作用網絡(PPI)和關鍵基因的篩選 在PPI網絡圖中共有 191個節點和319條邊,使用Cytoscape中CytoHubba插件的MCC算法、Degree 算法、Closeness 算法依次篩選節點中心度前20位的基因(圖4A～C),使用韋恩圖篩選3種算法共有的基因12個,分別為ITGAM、STAT5B、STAT5A、TNF、SYK、BTK、KLRG1、OSM、ACTN3、CCR1、NCF4、RYR1,通過Metascape在線軟件分析發現這些基因顯著富集在白細胞介素的信號傳導、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)通路、炎癥反應等通路(圖4D～E)。

圖4 蛋白相互作用網絡(PPI)和關鍵基因的篩選與分析

3 討 論

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統惡性腫瘤,嚴重威脅著婦女健康?；诼殉舶┑母叨任：π?美國國立衛生研究院(NIH)將卵巢癌納入腫瘤基因組圖譜計劃(TCGA),成為繼肺癌之后第二個被納入該計劃的腫瘤。導致卵巢癌死亡率和發病率居高不下的因素主要為晚期診斷和治療耐藥。其中,化療后順鉑耐藥是造成卵巢癌患者5年生存率較低的重要原因[4-5]。近年來針對卵巢癌化療耐藥的靶向干預研究已取得了很多的進展,但卵巢癌順鉑耐藥機制十分復雜,對卵巢癌順鉑耐藥的干預手段仍較局限,急需探尋新的參與卵巢癌順鉑耐藥的作用靶點,探索更有效的抑制卵巢癌化療抵抗產生的干預策略。

NAC-1基因在多種類型的腫瘤中呈過表達狀態,如乳腺癌、肝癌、卵巢癌等,可能影響腫瘤的發生發展、轉移復發或化療耐藥等。本課題組前期使用siRNA-NAC-1抑制NAC-1基因表達后發現卵巢癌耐藥株(SKOV-3/DDP)細胞凋亡率顯著提高,同時細胞生存率下降,這表明抑制NAC-1能有效提高SKOV-3/DDP細胞順鉑敏感性[9]。本研究中,進一步采用LV4-LUC-GFP慢病毒轉染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP細胞株,然后將細胞接種到免疫缺陷小鼠皮下,建立人卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,分別給予順鉑化療,結果顯示抑制NAC-1基因能抑制皮下腫瘤生長,證明NAC-1在卵巢癌耐藥株抵抗順鉑化療過程中發揮重要作用。通過調控NAC-1信號通路促進化療耐受腫瘤細胞的化療敏感性,可能成為增強腫瘤化療療效新的治療手段。

NAC-1作為維持干細胞多潛能性的關鍵因子,參與機體的多種生理功能[10]。本研究檢測發現,抑制NAC-1基因后順鉑化療瘤體中存在 1028個差異表達基因,其中下調基因460個,上調基因568個。這些DEGs的GO富集分析顯示其主要影響了細胞代謝、有絲分裂、壞死、炎癥、信號傳遞等生物學過程,提示NAC-1轉錄因子在細胞生長、分化、代謝、免疫應答等多種生理過程中發揮功能。如Rahman等[11-12]研究顯示,抑制NAC-1表達能影響脂肪酸和磷脂合成等代謝過程。KEGG分析顯示,NAC-1基因相關的信號轉導途徑有細胞因子-細胞因子受體相互作用、白細胞跨內皮遷移、神經活性配體-受體相互作用、細胞黏附分子、壞死、ECM受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路等。其中,在腫瘤耐受研究中,PI3K/Akt、NF-κB等信號通路是順鉑、吉西他濱等抗腫瘤藥物產生耐藥的重要調控通路,這些通路的激活可能減輕化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用,從而導致卵巢癌化療耐受[13-14]。因此,NAC-1基因可能通過調控PI3K/Akt、NF-κB等信號通路影響人卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化療敏感性。

腫瘤微環境介導的卵巢癌耐藥是當前化療耐藥的研究熱點,腫瘤細胞或基質細胞能分泌多種炎癥因子、趨化因子、生長因子等可溶性因子,這些因子與基質細胞均有助于卵巢癌耐藥性的發生[15-16]。本研究對蛋白相互作用網絡中篩選獲得的12個關鍵基因進行分析顯示,NAC-1基因可能影響到白細胞介素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等炎癥反應相關的信號通路,提示NAC-1基因可能通過調控炎癥微環境實現對腫瘤細胞化療耐受的影響。目前對NAC-1基因功能的研究主要集中在腫瘤細胞生長增殖、細胞衰老、轉移及侵襲和干細胞分化等領域。最新研究顯示,NAC-1基因可能還參與機體的炎癥反應。Xia等[17]研究證實,NAC-1基因可調節RLR介導的I型IFN的表達,過表達或敲低NAC-1基因能分別增強或降低TBK1和IRF3的活化,影響IFN-β表達。Yang等[18]研究發現,NAC-1可能是調節Treg細胞介導的免疫抑制的關鍵因子,敲除NAC-1基因后免疫細胞分泌的TGF-β、IL-10等炎癥因子水平顯著升高。

綜上所述,本研究借助人卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,證實了沉默NAC-1基因可有效提高人卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化療敏感性, 靶向干預NAC-1通路是抑制卵巢癌化療抵抗的有效手段。通過比較分析NAC-1基因干預的卵巢癌耐藥株 mRNA 的表達譜,揭示了NAC-1參與卵巢癌化療抵抗的信號通路,篩選獲得的關鍵基因生物信息學分析提示抑制NAC-1基因能改變腫瘤的炎癥微環境調控腫瘤細胞的化療耐受。