miRNA-758-3p對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

張 越,楊 超

(北華大學附屬醫院,吉林 吉林 132011)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一。在2020年全球報告了超過10 000例OSCC新發病例,導致5 000人死亡[1]。當前用于治療OSCC的療法包括手術、化學療法和放射療法[2]。雖然在診斷和臨床治療的OSCC已經取得進展,但由于疾病的進展和復發,OSCC患者的5 a生存率仍然相對較低[3-4]。因此,確定潛在的生物標志物對改善OSCC的預后和制定治療策略至關重要。

微小RNA(miRNA/miR)是一類非編碼RNA,轉錄后通過識別靶向mRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)的互補序列調節基因表達[5-6]。miRNA在多種生物學過程中發揮重要功能,包括發育、細胞增殖和凋亡[7-8]。研究[7,9-14]發現,幾乎在多種癌癥中均觀察到miRNA的表達失調,包括腎癌、結直腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌等,miR-758-3p可以抑制腫瘤的發生發展。研究[15-16]發現,miR-758-3p通過靶向MDM2和MTER抑制肝細胞癌的進展。miR-758-3p通過靶向MEPE調節子宮頸浸潤癌的發展。然而,目前尚未有研究報道miR-758-3p在OSCC中的生物學功能。因此,本研究通過檢測miR-758-3p在OSCC中的表達,探究miR-758-3p對CAL27細胞增殖、遷移及侵襲的影響,旨在為OSCC的治療提供新的靶標。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

正常牙齦上皮細胞及OSCC細胞系(CAL27、SCC9和SCC25,上海斯信生物科技有限公司);miR-758-3p和miR-NC(上海吉瑪制藥技術有限公司);Lipofectamine 2000轉染試劑、BCA蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);反轉錄試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司);MMP2、MMP9抗體(北京中杉金橋生物試劑公司)。

1.2 細胞培養與轉染

在含有10%FBS的DMEM(Gibco; Thermo Fisher Scientific,Inc.)中培養HGE細胞和CAL27細胞;將HGE細胞和CAL27細胞接種于6孔板中,采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照說明書轉染至相應細胞內。

1.3 RT-qPCR

應用TRIzol(Invitrogen)提取總RNA;應用NanoDrop分光光度計測定RNA純度和濃度;應用BcaBest RNA PCR Kit(TaKaRa公司,日本)將總RNA反轉錄為cDNA;應用SYBR Green染料在BIO-RAD T100實時PCR系統上進行定量RT-PCR(qRT-PCR),以確定基因表達,使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的表達水平。將U6 miRNA和GAPDH作為內參,PCR引物由上海生工合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 WST-1

將各組細胞在96孔板中培養,在48 h后加入10 μL的WST-1試劑,在溫度為37 ℃、5%CO2的恒定環境下孵育1 h,在4個時間點(0、24、48、72 h)應用酶標儀檢測儀測定450 nm處的吸光度。

1.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲試驗

細胞遷移試驗:將轉染后的CAL27細胞饑餓12～24 h后,收集細胞懸液,計數后加入Transwell小室,將Transwell小室放入24孔板; 24 h后拿出小室,去除培養基,用4%多聚甲醛固定15 min;0.1%結晶紫溶液染色15 min;取出小室,清洗干凈后,顯微鏡下觀察計數。

細胞侵襲試驗:先將Transwell小室的聚碳酸酯膜上室鋪上一層Matrigel基質膠,之后重復細胞遷移試驗的步驟。

1.6 Western Blot印跡實驗

細胞轉染后收集細胞,提取總蛋白。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后轉移至PVDF膜,用5%脫脂奶封閉后,一抗TRIM44(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫1 h。采用ECL發光液進行顯色及成像分析。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 HGE細胞與OSCC細胞系中miR-758-3p的PCR表達情況

RT-qPCR結果表明,與HGE細胞比較,TSCC細胞系CAL27、SCC9和SCC15中miR-758-3p表達下調(P<0.05),其中CAL27細胞中miR-758-3p表達量最低,因此,選擇CAL27細胞進行后續試驗(見圖1)。

圖1 OSCC細胞系及HGE細胞中miR-758-3p表達水平Fig.1 Expression levels of miR-758-3p in OSCC cell lines and HGE cells

2.2 miR-758-3p過表達抑制OSCC細胞CAL27的增殖活性

將過表達miR-758-3p和miR-NC轉染至CAL27細胞中,轉染后,細胞培養48 h,通過RT-qPCR驗證miR-758-3p的表達水平。RT-qPCR結果表明,與miR-NC組CAL27細胞中miR-758-3p表達水平(0.97±0.12)比較,miR-758-3p組表達水平(5.48±0.31)明顯增高(見圖2 a)。WST-1分析顯示,miR-758-3p過表達能顯著抑制CAL27細胞的活力(P<0.05)(見圖2 b)。

a

2.3 miR-758-3p過表達能抑制OSCC細胞CAL27的遷移和侵襲

Transwell試驗結果顯示,與miR-NC對照組比較,miR-758-3p組細胞遷移數量顯著減少(P<0.05)(見圖3 a);與miR-NC對照組比較,miR-758-3p組細胞侵襲數量顯著減少(P<0.05)(見圖3 b)。

a

2.4 miR-758-3p過表達對CAL27細胞中MMPs蛋白表達的影響

Western Blot結果顯示,與miR-NC組比較,miR-758-3p組CAL27細胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表達顯著下降(P<0.05)。見圖4。

a MMP-2與MMP-9蛋白表達水平

3 討 論

有研究[17-19]發現,多種miRNA在健康人和OSCC患者之間存在差異表達,miRNA在多種人類腫瘤的病理過程中起關鍵的調節作用。miRNA通過調節靶基因的表達,對各種細胞生物學功能產生影響,例如細胞生長、發育和增殖。同時,miRNA通過調節基因轉錄參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移[20],唾液miR-139-5p是OSCC治療反應和復發評估很有價值的生物標志物[18]。CALIN G A等[20]報道,miR-124-3p通過降解極光激酶A的mRNA可以抑制膀胱癌的生長和轉移。在OSCC進展中有更多miRNA被作為診斷或預后的生物學指標[18-19]。與正常組織比較,miR-758-3p在多種癌組織中的表達顯著降低,例如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌等。本研究結果顯示,miR-758-3p在 OSCC細胞中呈低表達,并且在CAL27細胞系中表達最低,提示miR-758-3p表達量與OSCC的病情進展程度具有相關性。

為探究miR-758-3p在OSCC發生發展中的作用機制,本研究將 miR-758-3p mimics轉染到CAL27細胞內,發現miR-758-3p過表達能顯著抑制CAL27細胞增殖,并降低其活性,還能降低CAL27細胞的遷移及侵襲的能力。Western Blot結果提示,miR-758-3p過表達可以明顯抑制CAL27細胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表達,提示miR-758-3p可能是OSCC潛在作用靶點,miR-758-3p在CAL27細胞中作為腫瘤抑制因子,可作為OSCC患者惡性程度的指標之一。

綜上所述,miR-758-3p在OSCC細胞中呈低表達,并且在CAL27細胞中表達最低,上調miR-758-3p可以抑制OSCC細胞的遷移和侵襲,表明miR-758-3p可能是OSCC治療的靶標。