葉面噴施吲哚乙酸對小花南芥和玉米間作富集鉛的影響

肖峰，劉才鑫，祖艷群，王磊，李祖然，王吉秀

（云南農業大學資源與環境學院，昆明 650201）

超富集植物與作物間作修復技術因具有生態環保的邊生產邊修復的優勢，逐漸成為重金屬污染土壤修復的主要農藝措施之一。但間作植物提取土壤重金屬技術在修復效率方面存在局限性。超富集植物適應重金屬離子濃度高的生境土壤，而高背景重金屬污染土壤抑制作物的生長發育，影響間作超富集植物與作物的生物量，導致間作修復效率往往并不理想[1]。因此在超富集植物與作物間作體系下促進超富集植物吸收累積重金屬的同時，如何保證提高間作植物生物量、減少重金屬累積，是利用間作植物提取土壤重金屬取得成功的關鍵。植物激素吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）是植物體內合成的調控植物生長發育、影響生理生化、促進細胞分裂和根系伸長的微量有機物質[2]。有研究證明，超富集或耐性植物能通過合成更多IAA來抵御重金屬的脅迫[3]。

在重金屬脅迫下，葉面噴施IAA 通過超富集植物與作物間作體系來調控植物生長，改善重金屬的富集特征。研究表明IAA 通過增強植物的蒸騰作用促進植物根系吸收和轉運重金屬[4-5]，推測機理是植物激素引起植物抗氧化酶代謝變化或IAA 與不同植物體內結合受體發生變化，如受體ABP（Auxin-binding proteins）的結合可以調節質膜上的H+-ATPase 活性，引起質膜上K+、Na+、Ca2+離子通道的開放或激活細胞質膜離子轉運蛋白[5]。重金屬脅迫下IAA轉化為結合態維持植物正常生理機能，如擬南芥中結合態IAA是自由態的38倍[6]，雙子葉植物的結合態IAA為IAA-酰胺[7]、IAA-糖[8]、IAA-谷氨酸、IAA-PCs 和IAA-天冬氨酸[9]。高濃度（1、10 μmol·L-1）IAA 可以調節浮萍淀粉的積累，增強淀粉合成關鍵酶ADPG焦磷酸化酶（AGPase）的活性，淀粉含量和AGPase 活性在10 μmol·L-1的IAA處理下分別比對照顯著增加35.0%和14.1%[10]。As 超富集植物大葉井口邊草的內源生長素含量顯著高于非As超富集植物劍葉鳳尾蕨[11]，As耐性芥菜體內硫酸鹽、生長素和茉莉酸鹽含量以及合成途徑的基因表達量顯著高于As敏感性芥菜[12]。

本研究將植物激素IAA 引入到間作體系下修復重金屬污染土壤，在間作超富集植物和玉米葉片上噴施IAA，探究IAA 在植物生理生化方面的功能。IAA的作用主要包括：①促進植物的生長發育，稀釋重金屬在植物體內的濃度，從而提高植物對重金屬的耐性；②IAA 進入間作不同植物體內與結合受體發生螯合，緩解重金屬的脅迫。但目前Pb 脅迫下IAA 如何影響間作超富集植物小花南芥和作物玉米對Pb的富集特征尚不清楚，有待進一步探索研究。因此本研究設置超富集植物小花南芥、玉米單作、小花南芥與玉米間作三種種植模式，通過葉面噴施不同濃度IAA，探討IAA 對間作體系下超富集植物與玉米修復土壤Pb 污染的調控作用，對于解決超富集植物與作物間作修復Pb污染土壤具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小花南芥是云南省會澤鉛鋅礦野生物種，十字花科，南芥屬，多年生草本植物。玉米品種選用“會單4號”，屬于Pb低累積品種。

1.2 試驗設計

試驗于云南農業大學后山進行，采用小花南芥和玉米間作、單作3 種模式，每種模式4 個處理，3 次重復，共計36 盆（58 cm×33 cm×18.5 cm）。土壤采用云南農業大學后山土壤與基質土混合的方式，后山土壤經自然風干后過2 mm 篩，基質土由昆明當地的公司生產，準確稱量9 kg 后山土壤與3 kg 基質土，混合后裝入盆中，Pb 以Pb（CH3COO）2溶液的形式與土充分混合均勻，準確稱取21.9 g Pb（CH3COO）2·3H2O（Pb2+含量約為1 000 mg·kg-1）溶于500 mL 水中，倒入混合土壤中，手動攪拌至土壤全部潮濕且無成團后，放置平衡15 d，移栽小花南芥和玉米幼苗。小花南芥與玉米之間的間作距離保持8 cm，小花南芥與玉米單作時，兩棵苗之間距離保持8 cm。設置外源噴施IAA的濃度為0 mg·L-1（CK）、25 mg·L-1（T1）、50 mg·L-1（T2）、100 mg·L-1（T3）。每兩日噴施一次，60 d后取樣。

1.3 指標測定

1.3.1 土壤基本理化性質

土壤Pb 含量（原土加Pb2+之后土壤Pb 含量）、速效磷、速效鉀、有機質、堿解氮、pH 的測定參照鮑士旦《土壤農化分析》（第三版）[13]，結果見表1。

表1 實驗用土基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of the test soil

1.3.2 植物抗氧化酶、丙二醛、光合色素

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）三種抗氧化酶活性，以及丙二醛（MDA）、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量的測定采用試劑盒方法，試劑盒購于蘇州格銳思生物科技有限公司，根據試劑盒方法，采用紫外分光光度計讀數。

1.3.3 植物生物量

將收集好的植物樣洗凈裝入信封中并編號，放入烘箱105 ℃殺青30 min，調節烘箱溫度到75 ℃烘干至恒質量，冷卻后取出，測定其生物量。

1.3.4 植物光合作用

使用Li-6400光合熒光記錄儀（Li-Cor）測定凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率。使用CO2注入系統，CO2濃度控制為400 μmol·mol-1，夾上葉片后于1 200 μmol·m-2·s-1光強下測量。

1.3.5 植物Pb含量

稱取0.2 g 的植物干樣，倒入消煮罐中，加4 mL硝酸過夜，隔夜加入2 mL 30%過氧化氫，將消煮罐放入烘箱（DHG-9145A），140 ℃加熱4 h，取出冷卻定容，用火焰原子吸收分光光度計（Thermo ICETM3300AAS，美國）測定。

1.3.6 Pb富集、轉運系數

Pb的富集、轉運能力按下列公式計算：

富集系數=植株Pb 含量（mg·kg-1）/土壤Pb 含量（mg·kg-1）

轉運系數=植株地上部分Pb 含量（mg·kg-1）/植株地下部分Pb含量（mg·kg-1）

1.4 數據分析

數據通過Excel和SPSS進行處理，采用Tukey法進行統計分析，顯著性檢驗設α=0.05，多重比較結果以小寫英文字母表示。利用軟件Origin 8.6 制圖，用SPSS 12.0統計軟件對試驗數據進行雙因素方差分析和最小顯著差法（LSD）顯著性檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 不同濃度IAA 處理下間作小花南芥與玉米生物量的變化

IAA 作為植物生長素可以促進植物伸長生長。如圖1 所示，間作小花南芥生物量高于單作，與單作相比，T3 處理下間作地上部分生物量顯著增加195.0%，地下部分則在T1、T2 處理下顯著增加80.1%和25.5%。間作玉米地上部分在T2、T3 處理下比單作顯著增加15.0%和31.9%，而地下部分的生物量小于單作。由此可以說明，IAA 主要促進小花南芥的根部伸長，這有利于小花南芥對土壤中Pb的富集；而對于玉米來說，外源施加IAA在間作體系下更加有利于地上部分的生長，增加玉米對Pb 的耐受性。雙因素結果分析表明，IAA 處理和種植模式對小花南芥和玉米的生物量均有極顯著影響，且兩種因素存在交互作用。

2.2 不同濃度IAA 處理對間作小花南芥與玉米SOD活性的影響

SOD是消除植物體內ROS的首要物質，SOD活性越強表明植物抵抗重金屬脅迫的能力越強。如圖2所示，與單作小花南芥相比，間作小花南芥葉片SOD活性在T1、T2 處理下顯著提高42.1%和65.4%（P＜0.05），間作根部在T1、T2 處理下顯著提高27.7%和29.9%（P＜0.05）。間作玉米在T1 和T3 處理下葉片SOD 活性較單作提高40.1%和37.1%（P＜0.05）。在3種濃度處理下間作玉米根部SOD 活性則較單作顯著提高21.4%、11.8%和12.1%。雙因素結果分析表明，IAA 處理和種植模式對小花南芥葉片SOD 活性有極顯著影響，且兩者存在交互作用，對玉米SOD 活性有極顯著影響，且兩者存在交互作用。

圖2 不同濃度IAA處理對小花南芥和玉米SOD活性的影響Figure 2 Effects of different concentrations of IAA on SOD activity of Arabis alpina and maize

2.3 不同濃度IAA 處理對間作小花南芥與玉米POD活性的影響

POD可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。如圖3 所示，間作小花南芥POD 活性較單作顯著提升，其葉片POD 活性在3 種濃度處理下較單作分別提高20.3%、36.5%和25.7%，根部較單作分別提高12.0%、37.1%和54.0%（P＜0.05）。間作玉米SOD 活性較單作顯著提升，間作葉片在3 種濃度處理下分別提高44.4%、23.0%和23.1%，間作根部SOD 活性較單作分別提高27.4%、25.8%和17.7%（P＜0.05）。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對小花南芥與玉米POD 活性均有極顯著影響，且兩者存在交互作用（玉米葉片和小花南芥根除外）。

圖3 不同濃度IAA處理下小花南芥和玉米的POD活性Figure 3 Effects of different concentrations of IAA on POD activity of Arabis alpina and maize

2.4 不同濃度IAA 處理對間作小花南芥與玉米CAT活性的影響

CAT可以將H2O2催化成O2和H2O，從而減輕重金屬對植物的脅迫。如圖4 所示，間作小花南芥葉片在3 種濃度處理下CAT 活性較單作分別顯著提高21.8%、15.2%和36.0%，小花南芥根部在T1 處理下較單作顯著提高41.9%（P＜0.05）。間作玉米葉片CAT活性在T1 處理下較單作顯著提高50.0%，根部則在3 種濃度處理下較單作分別顯著提高36.8%、32.8%和16.3%（P＜0.05）。雙因素分析結果表明，IAA處理和種植模式對小花南芥和玉米的CAT 活性均有極顯著影響，且兩種因素存在交互作用（小花南芥葉片除外）。

圖4 不同濃度IAA處理下小花南芥和玉米的CAT活性Figure 4 Effects of different concentrations of IAA on CAT activity of Arabis alpina and maize

2.5 不同濃度IAA 處理下間作小花南芥與玉米的MDA含量

丙二醛（MDA）反映植物細胞過脂化程度，MDA含量越低植物受重金屬脅迫的程度越低。如圖5 所示，間作小花南芥的MDA 含量在3 種濃度處理下均顯著低于單作處理。與單作相比，間作小花南芥葉片MDA 含量在3 種濃度處理下分別降低25.8%、40.7%和43.3%，根部MDA 含量分別降低98.9%、58.6%和57.4%（P＜0.05）。如圖5 所示，間作玉米葉片MDA 含量在3 種處理下分別較單作降低10.9%、27.2%和12.1%，間作根部MDA 含量在T1、T2 處理下分別較單作降低26.1%和19.4%（P＜0.05）。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對小花南芥與玉米MDA 含量有極顯著影響，且兩者存在交互作用。

圖5 不同濃度IAA處理下小花南芥和玉米的MDA含量Figure 5 Effects of different concentrations of IAA on MDA content of Arabis alpina and maize

2.6 不同濃度IAA 處理下間作小花南芥與玉米的光合特性

IAA 通過促進植物的光合作用來減輕重金屬對植物的脅迫[14]。如表2所示，在T1處理下的單作小花南芥凈光合速率、氣孔導度較對照分別提高12.7%和70.6%，間作較對照分別提高33.4%和135.7%。T1 處理下間作小花南芥蒸騰速率較對照提高49.1%（P＜0.05）。而T3 處理下小花南芥光合特性出現降低的趨勢，單作和間作小花南芥凈光合速率較各自對照分別降低了41.3%和16.2%（P＜0.05）。小花南芥胞間CO2濃度升高，其中T3 處理單作升高4.2%，間作升高3.8%（P＜0.05），由此說明T1 濃度可以促進小花南芥光合作用，而繼續增加濃度會出現抑制效果。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對小花南芥光合特性有極顯著影響，且兩者存在交互作用。

表2 不同濃度IAA處理下小花南芥的光合特性Table 2 Photosynthetic characteristics of Arabis alpina treated with different concentrations of IAA

如表3 所示，葉面噴施IAA 會顯著增加玉米的光合作用，其中在T3處理下的間作玉米凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率較對照顯著增加153.0%、100.0%和117.6%，較單作顯著增加18.7%、27.3%和28.6%。其中間作玉米在T3 處理下胞間CO2濃度較對照降低52.0%，較單作降低65.3%。由此說明T3 處理下的間作玉米光合作用達到最優效果。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對玉米的凈光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率有顯著影響，且兩者存在交互作用。IAA 處理對玉米氣孔導度有極顯著影響，兩者存在交互作用。

表3 不同濃度IAA處理下玉米的光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of maize treated with different concentrations of IAA

2.7 不同濃度IAA 處理下間作小花南芥與玉米的光合色素含量

由表4可知，間作小花南芥在T2處理下葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量較單作增加9.7%、176.5%和280.8%，較間作對照增加78.7%、58.4%和53.7%。而在T3處理下的小花南芥葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均低于對照（P＜0.05）。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對小花南芥的光合色素含量有極顯著影響，且兩者具有交互作用。

表4 不同濃度IAA處理下小花南芥光合色素含量Table 4 Photosynthetic pigment content of Arabis alpina treated with different concentrations of IAA

如表5 所示，玉米在3 種IAA 濃度處理下光合色素含量呈先升高后降低趨勢。T2 處理下的單作和間作玉米葉綠素a 含量較各自對照分別增加147.9%和61.0%。單作玉米葉綠素b 在T2 處理下比對照增加了165.3%，間作玉米葉綠素b 在T1 處理下較對照增加了117.6%。單作玉米的葉綠素a/b 表現為先升高后降低，這說明IAA 對葉綠素a 的影響小于葉綠素b。而間作玉米的葉綠素a/b 表現為先降低后升高，說明IAA 對葉綠素a 影響大于葉綠素b。單作和間作玉米的類胡蘿卜素含量在T2處理下比各自對照分別增加73.2%和92.0%，其中間作玉米的類胡蘿卜素含量在T2 處理下較單作增加77.8%。這說明IAA 緩解了重金屬對玉米類胡蘿卜素的影響，間作體系要優于單作。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對玉米的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量有極顯著影響，且兩者具有交互作用。

表5 不同濃度IAA處理下玉米光合色素含量Table 5 Photosynthetic pigment content of maize treated with different concentrations of IAA

2.8 不同濃度IAA 處理下間作小花南芥與玉米的重金屬含量

由表6 可知，小花南芥地上部分Pb 含量在3 種IAA 濃度處理下表現為低促高抑，其單作和間作地上部分在T1 處理下相較于CK 分別增加32.4% 和19.8%，而間作較單作在T1 處理下增加15.6%。小花南芥的富集系數也表現為先升高后降低，間作條件下顯著高于單作。間作條件下小花南芥轉運系數顯著低于單作處理。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對小花南芥的Pb 含量有極顯著影響，但兩者除富集系數外無交互作用。

表6 不同濃度IAA處理對小花南芥Pb含量的影響Table 6 Effects of IAA at different concentrations on Pb content in Arabis alpina

由表7 可知，3 種IAA 濃度處理下的單作玉米Pb含量地上部分變化不顯著，而地下部分顯著增加，T2處理最高，較對照增加49.9%。間作玉米地上部分和地下部分Pb含量均表現為先增加后降低。單作玉米的富集系數在3 種濃度處理下均比對照顯著提高，間作玉米的富集系數表現為先升高后降低。單作玉米的轉運系數在T2、T3處理下均降低，這說明高濃度的IAA抑制了玉米根系吸收Pb。雙因素分析結果表明，IAA 處理和種植模式對玉米的Pb 含量有極顯著影響，且兩者具有交互作用。

表7 不同濃度IAA處理對玉米Pb含量的影響Table 7 Effects of IAA at different concentrations on Pb content in maize

3 討論

IAA 屬于植物生長素，能夠調控植物的生長發育，如促進細胞伸長、分裂、擴張和分化等[15]。本研究發現玉米和小花南芥的生物量受葉面噴施IAA濃度的影響，IAA 處理使其地上部分生物量增加，濃度增加后則變化不明顯。另外對比研究發現，在相同濃度IAA 的處理下，間作體系下的小花南芥與玉米的生物量要大于單作。間作體系下的玉米受到重金屬的脅迫會減弱，從而生長得更好。

重金屬Pb 進入植物體內會刺激植物體內產生ROS，為減少ROS 對植物結構細胞損傷，植物細胞會啟動抗氧化酶系統來消除過量的氧離子和過氧化物以及含氧自由基[16]。IAA 作為植物激素可以通過增加抗氧化酶活性和降低MDA 的含量來消除過量的ROS[17]。本研究中玉米和小花南芥在3 種IAA 濃度下，其間作體系的SOD、POD、CAT 活性比單作均顯著提高。MDA 是膜脂過氧化的產物，其含量的大小可以反映植物受到重金屬脅迫的程度。研究發現，植物生理生化指標對外源IAA 的響應受到IAA 濃度的影響，其生理作用具有兩重性[18]。本研究發現T1、T2 處理下玉米根部的MDA 含量顯著降低，但T3 處理下玉米根部MDA 含量與對照差異不顯著。這表明IAA 可以通過提高抗氧化酶活性來減輕細胞過氧化的傷害，維持細胞正常生理活性，提高植物耐受性，而繼續增加噴施濃度會增加植物體內MDA 含量，抗氧化酶的活性也會隨之下降。

Pb 對植物的脅迫作用導致細胞過氧化，從而破壞植物葉綠體膜，影響葉綠素含量，改變氣孔導度和光合特性[19]。本試驗發現葉面噴施IAA 后，玉米的光合速率、氣孔導度、蒸騰速率顯著上升，胞間CO2濃度降低，且IAA對間作體系下玉米光合作用的改善要優于單作。IAA 濃度對光合色素含量的影響表現為低促高抑，這可能是由于高濃度的IAA會抑制植物體內光合色素的合成。另外不同植物對IAA 濃度的響應程度也不同，在3 種濃度下，小花南芥光合作用和光合色素的強度均表現為先增強后抑制，玉米的光合特性表現為增強。本研究還發現高濃度IAA 處理下光合作用減弱，而生物量卻在較低濃度IAA 處理中增加，這可能由于玉米和小花南芥在噴施前期生長較快，導致后期噴施的IAA 達不到促進植物生長的效果，抑制植物的光合作用，而低濃度IAA 對植物生長的促進作用沒有高濃度IAA效率高，使植物在噴施后期仍處于生長階段，從而造成了這一現象。因此，葉面噴施一定濃度的IAA 會降低Pb 對葉片葉綠素和光合特性的影響，維持光合作用的正常進行。

有研究發現，IAA 可以促進龍葵[20]、菹草（Potamogeton crispus）和鳳眼藍（Eichhornia crassipes）[21]等超富集植物對重金屬的吸收。本課題組前期試驗發現小花南芥作為超富集植物，其富集系數和轉運系數均大于1[22]。本研究發現小花南芥在外源施加IAA 后，其間作體系下的富集系數顯著提高，但富集系數未達到1，這可能受多方面因素影響，如土壤的理化性質、Pb形態、氣候條件等，課題組前期試驗的小花南芥土壤取自會澤鉛鋅礦區生長的含有Pb 污染的原土，本次試驗土壤取自云南農業大學后山荒山土壤，外源添加Pb 進行盆栽試驗，大棚里溫度較高，每日澆水保持土壤持水量，以供植物生長，故Pb富集系數較低。轉運系數降低可能是由于IAA 與小花南芥地上部分受體結合占據某些Pb 的位點。施加IAA 可以顯著提高玉米的耐受性，增加地下部分對重金屬的吸收，為邊修復邊生產提供了思路。然而在間作小花南芥和玉米噴施IAA的試驗中發現，作物玉米體內重金屬含量較空白顯著增加，對玉米已經造成安全風險。其原因可能是試驗中土壤重金屬含量遠高于《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）中Pb 的管制值（當5.5＜pH≤6.5 時，Pb 的管制值為500 mg·kg-1），導致玉米植株體內重金屬含量較高。但本試驗研究的是小花南芥和玉米的苗期，并未進一步研究玉米的整個生育期，特別是玉米籽粒是否會超標還有待進一步探究。這同時也說明在間作植物修復土壤重金屬時，其邊生產邊修復的思路能否實現生態經濟價值，也受到土壤重金屬含量、形態的影響。對于高濃度重金屬污染的土壤來說，施加IAA在提高超富集植物修復效率的同時，也使作物體內的重金屬含量超標，雖然提高了作物耐受性，但是會影響其經濟效益。而本試驗探究出施加IAA的最優濃度，下一步研究外源施加IAA 在超富集植物與作物間作修復土壤重金屬污染的試驗中，應探索噴施IAA時間點、噴施部位、土壤重金屬濃度和形態等差異對間作植物Pb 富集特征的影響。綜上所述，葉面噴施IAA可以調控小花南芥和玉米根系生長、光合特性及Pb富集特征，但IAA 調控間作植物富集Pb 的機理還有待進一步研究。

4 結論

（1）25 mg·L-1IAA 處理下，間作小花南芥和玉米的地上部分生物量較單作顯著增加。

（2）濃度為25 mg·L-1和50 mg·L-1的IAA 可以顯著提高玉米和小花南芥的抗氧化酶活性，降低MDA含量，增加光合色素含量，而繼續將IAA 濃度提高到100 mg·L-1后，其效果減弱。

（3）間作小花南芥對Pb 的富集系數顯著高于單作，且噴施IAA 會促進玉米和小花南芥的根對Pb 的富集。因此，利用超富集植物小花南芥與玉米間作修復土壤重金屬污染時，施加IAA 可以提高其修復效率，同時還會增強玉米對重金屬污染土壤的耐受性。