暴露組學在識別環境污染物及其健康危害中的應用進展

支夢雪, 王建設

(煙臺大學藥學院, 山東 煙臺 264005)

健康或疾病是由環境因素和遺傳因素共同作用的結果。隨著人類基因組計劃的完成和對復雜疾病病因學研究進展的加快,科學家發現遺傳因素僅占疾病病因的10%左右,大多數疾病是由非遺傳因素導致的,環境暴露在人體健康與疾病中起到重要的作用[1]。2016年,世衛組織報告稱,全球有1 260萬例死亡可歸因于環境,占總死亡人數的23%。如果將死亡和殘疾都計算在內,環境造成的疾病負擔占全球疾病負擔的22%[2]。因此,要了解疾病發生的原因并最終預防疾病,就需要重視環境因素。結合全基因組關聯研究(genome-wide association studies, GWAS)與全暴露(或叫全環境)組關聯研究(exposome/environment-wide association studies, EWAS),找出疾病與遺傳、環境的聯系,通過消除/避免病因來提高預測個體發病風險的能力[3]。

1 暴露組學概述、研究策略與方法

1.1 暴露組學概述

全球經濟和人口擴張帶來了土壤問題、大氣問題、全球變暖和水資源危機等一系列生態和環境問題,這些問題不僅影響了我們的生活質量,還嚴重影響了人民的生命健康。為引起人們對復雜疾病中環境因素的關注,美國癌癥流行病學家Christopher Wild于2005年首次提出“暴露組”的概念,他將暴露組定義為從受精卵開始涵蓋整個生命周期的所有環境暴露,包括生活方式[4]。這一概念用來表示健康和疾病的環境驅動因素,即非遺傳驅動因素。此后,“暴露”的定義進一步細化為對整個生命周期中環境影響和相關生物反應的累積測量[5-7],其中生物效應是通過改變體內關鍵分子、細胞和生理過程的化學物質介導的,所以暴露不僅限于從空氣、水或食物進入體內的化學物質(有毒物質),還包括炎癥、氧化應激、脂質過氧化、感染、腸道菌群和其他過程產生的化學物質。因此,Wild于2012年將“暴露”分為3類:內部暴露、一般外部暴露和特定外部暴露。內部暴露被定義為個體對環境刺激的反應或維持體內平衡所需的生理和生物反應,包括炎癥、代謝和應激途徑等。宏觀層面的暴露,如涉及物理或社會環境的暴露(如空氣和水、建筑環境、氣候變化和噪聲)構成一般外部暴露,而個人層面的暴露(如沐浴/化妝品使用、飲食、生活方式、體育活動和睡眠)代表特定外部暴露[8,9]。隨之出現了暴露組學的概念:“研究暴露組以及暴露組對人類疾病過程影響的學問”[10]。暴露組的研究補充了基因組學在人類復雜疾病病因研究中的不足。

1.2 暴露組學的研究策略和方法

為研究環境對疾病和健康的影響,針對復雜的環境暴露和更復雜的人對環境的反應,提出了“自下而上”和“自上而下”兩種研究策略?！白韵露稀钡难芯坎呗允峭ㄟ^對空氣、水和食物等介質中的化合物進行測定,分析他們與疾病和健康結果的相關性,尋找確定影響疾病的外源性暴露因子?！白陨隙隆钡牟呗酝ㄟ^分析測定患者和健康人群血液或者尿液等生物樣本中所有外來化合物的種類和水平,應用高通量的組學技術對人體內的標志物進行分析,識別所有可能的暴露因素,分析其與疾病的關聯,確定導致健康損害的有害因子(見圖1)?！白韵露稀迸c“自上而下”兩種策略各具優勢和不足,前者能在眾多的有害因素中分析其環境介質的來源,可以進行大規模的人群研究,但是難以分析進入體內有害物質的量,不能得出與疾病的明確關系;后者由于可以測定進入體內的有害因子含量及其效應的標志物,為確定與疾病的關系提供了有力證據,但是由于生物材料的采集和分析的限制,難以進行大規模的人群研究,并且也無法確定有害因素的來源[1,11]。兩種方法相結合可發揮暴露組學方法的最大應用潛力[12]。

圖 1 暴露組學研究的基本策略Fig. 1 Basic strategies for exposomics research

外部因素通過改變機體的生物學特征對健康產生影響。通過分析不同生物樣本的化合物水平,并結合暴露時體內生理學變化和體外暴露因素信息來理清暴露因素和疾病的聯系,可在個人和社會層面采取干預措施,降低健康風險。暴露組學的研究依賴于內部和外部暴露評估方法的應用。外部暴露評估依賴于對環境壓力源暴露量的測量,內部暴露評估依賴于基因組學、代謝組學、脂質組學、轉錄組學和蛋白質組學等組學研究[13-17]。近些年來組學方法取得了非凡的進步,使毒理學家能夠將毒代動力學和毒效動力學與有毒化學物質作用方式(單一或聯合)的機制結合起來,為系統評估環境污染物的健康風險提供理論依據[18,19]?；蚪M學被認為是組學分析的基礎,即使微小的基因突變都可能導致個體的毒物反應差異,影響個體對疾病的易感性[15]。表觀遺傳學研究基因甲基化和染色質構象改變等方式引起的基因表達調控變化和最終導致的表型改變。轉錄組學關注RNA水平上的基因表達,使我們能夠在轉錄水平上了解基因組的表達,從而提供基因結構、基因表達調控、基因產物功能和基因組動力學等方面的信息[15]。與其他組學相比,蛋白質組學更接近生物表型[20]。機體在外界刺激下,表現出不同的蛋白質表達水平,這些信息將有助于了解蛋白質對表型的影響以及疾病發生的途徑或機制[15]。代謝組學通過獲取的內源或外源小分子物質變化譜可以反映有害暴露下的細胞活動改變[21],敏感、特異性內源代謝物變化可以作為生物標志物來指示暴露因子的性質和潛在危害[14,20]。上述任何一種組學分析在全面解釋特定生物現象方面都可能存在局限性,“多組學”方法通過整合多種組學技術,從不同生物層次識別與有害結局相關的生物學通路,以全局的角度研究一系列生物效應,找出組內關聯,從而在分子水平上加強對環境影響和健康結果的精確理解,確認環境暴露與發病機制之間的因果關系和關聯[15]。

2 暴露組學在識別環境污染物及健康危害中的應用

2.1 暴露組學在環境污染物識別中的應用

近些年新技術的發展顯著促進了對化合物的檢測和識別能力,通過分析獲得的豐富數據促進了未知化合物的發現。其中高分辨質譜法(high-resolution mass spectrometry, HRMS)已成為表征暴露水平和發現暴露相關生物途徑變化或尋找疾病標志物的重要手段[22],是研究持久性有機污染物(POPs)、內分泌干擾化學物質、農藥、重金屬和空氣污染物等各種環境風險因素及其效應的強大工具[23,24]。例如,一項研究[25]采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)和液相色譜-四極桿飛行時間質譜(LC-QTOF-MS)對水源水和自來水中的全氟/多氟烷基化合物(PFASs)進行靶向、非靶向和可疑篩選,在自來水中靶向檢出12類共50種PFASs;非靶向檢測出15種PFASs,總含量高達17.6 ng/L,有3種高置信度PFASs首次在飲用水中檢出;對應的水源水和自來水中靶向PFASs的濃度變化不明顯,說明常規飲用水處理方式對這些PFASs的去除效率較低。另一項研究[26]采用超高效液相色譜-四極桿線性離子阱質譜和UPLC-QTOF-MS分析方法,對南海海洋哺乳動物肝臟樣本中的PFASs進行靶向、非靶向和可疑篩選,發現在21種目標PFASs中,全氟辛烷磺酸(PFOS)和6∶2氯化聚氟烷基醚磺酸(6∶2 Cl-PFESA)占主導地位;非靶向分析和可疑篩選共獲得9類44種PFASs,其中有15種PFASs為首次在海洋哺乳動物體內檢出。此外,大氣壓光電離(APPI)技術對芳香族化合物具有很高的靈敏度[27];傅里葉變換離子回旋共振質譜法(FT-ICR MS)具有超高分辨率和質量精度,廣泛用于探索復雜材料的分子組成[28];全二維氣相色譜(GC×GC)具有分辨率高、峰容量大、靈敏度高等優點,其與飛行時間質譜(TOF MS)聯用,在提高分辨率和靈敏度的同時,能減少基質干擾的影響[29]。Xu等[28]采用大氣壓光電離傅里葉變換離子回旋共振質譜法(APPI FT-ICR MS)和全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯用(GC×GC-TOF MS)方法,對北京地區大氣顆粒物(PM)中的多環芳香類化合物(PACs)進行分析,采用APPI FT-ICR MS對PACs進行初步定性分析,GC×GC-TOF MS進一步鑒定PACs的結構,共識別出386種PACs,其中283種多環芳烴(PAHs)及其烷基衍生物為優勢化合物,除包括常規監測的16種PAHs之外,多種PAHs烷基化衍生物以較高濃度存在于PM中[28]。李想等[30]基于固相萃取-氣相色譜-串聯質譜技術(SPE-GC-MS/MS)對武漢市普通人群血清中有機氯農藥與多氯聯苯進行檢測分析,張續等[31]采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法(SPE-UPLC-MS/MS)對尿液中多種農藥及農藥代謝物進行批量分析測定,兩種方法均具有操作簡單、靈敏度高的特點,適合大量樣本的生物監測。表1簡單列出了近年來暴露組學在環境污染物識別中的應用。

表1 暴露組學在環境污染物識別中的應用

2.2 暴露組學與生物標志物的識別

環境暴露對人體的影響貫穿一生,他們影響基因的表達、訓練和免疫系統的塑造,觸發許多生理反應,決定機體健康和疾病狀態。只有闡明環境暴露與各種細胞成分之間復雜的相互作用,才能表征暴露物及其對健康的影響,確定因果關系[36]。為了更好地了解復雜化學混合物的暴露情況并保護公眾健康,確定暴露對生物的影響尤為重要,這種影響包括生物效應(即暴露的不利影響)和生物反應(即機體試圖修復暴露所致損傷做出的反應)[36-38]。生物標志物是生物體內與暴露或疾病相關聯的指示物,是機體由于接觸各種環境因子所引起的器官、細胞、亞細胞水平變化的生化、生理、免疫和遺傳學等指標,是一個在暴露組學中廣泛應用的概念,從功能上一般分為暴露(接觸)生物標志物、效應生物標志物和易感性生物標志物[39]。暴露生物標志物能比較準確地反應機體的負荷或吸收的總劑量,包括可直接測量的化學物質(如血液中的外源污染物)或是通過生理機制以各種方式修飾過并仍能識別的化合物(如代謝產物或加合物),用于指示污染物類型和暴露量[40]。效應標志物指機體中可測出的生化、生理、行為或其他改變的指標,表明環境污染的致病機制,并提高對疾病的預測和預警的精確度[1]。多種重要通路可以通過多層次組學標志物(DNA、RNA、蛋白質和代謝產物)來表征,包括氧化應激、炎癥、免疫反應改變和激素調節等[39]。暴露生物標志物與效應標志物可用于對劑量-反應(效應)關系進行評價,了解內/外暴露與疾病之間的關聯程度[41]。易感性生物標志物是機體接觸某種特定環境因子時,指示個體反應能力的先天性/獲得性缺陷的指標,可用于篩選環境暴露的敏感人群[1]?？傊?生物標志物在揭示環境暴露、人類生物學和疾病之間的關系方面發揮著重要作用(見圖2)。

圖 2 環境暴露與健康效應的關系Fig. 2 Relationship between environmental exposure and health effects

暴露組學旨在同時考察所有與環境暴露相關的標志物以及與疾病相關標志物之間的相關性,從而得到全面可靠的環境與疾病風險的關系。研究的難點在于如何一次性考察復雜生物樣品中所有環境暴露相關標志物以及疾病相關標志物[42]。蛋白質組學和代謝組學是標志物鑒定和污染物效應分析的兩個主要手段。蛋白質組學技術通過對蛋白質高效快捷的定量分析,可從蛋白質水平上研究外源性化合物對機體的毒性作用機制,并從中篩選出具有較高特異性和靈敏度的蛋白質標志物[43]。同位素標記相對和絕對定量技術(iTRAQ)具有測定蛋白質范圍廣泛、檢出限低、分析結果可靠、精度高等優點[44]?；趇TRAQ LC-MS/MS方法,Liu等[45]對暴露于全氟辛酸(PFOA)的SD大鼠肝臟進行了差異蛋白質組學分析,確定了3 327個非冗余蛋白質,其中192個蛋白質在PFOA處理下呈現顯著的改變。與傳統的LC-MS/MS相比,納米液相色譜-串聯質譜分析法(Nano LC-MS/MS)在靈敏度上具有更大優勢[46], Li等[47]采用親水作用液相色譜(HILIC)富集,Nano LC-MS/MS和無標記定量(LFQ)相結合的研究方法,對PFOS暴露的小鼠肝臟進行蛋白質組學分析,識別出2 439種蛋白質和799種糖蛋白,前者有241個發生顯著改變(112個上調,129個下調);后者有134個為差異糖蛋白(60個顯著上調,74個顯著下調)。代謝組學是確定污染物暴露的靶器官、生物標志物和高效解析其毒理作用及機制的重要技術手段[48]。靶向代謝組學專注于對一類特定代謝物的定量,特別是針對某一條通路的關鍵代謝物,可用于對化合物進行毒性評價;非靶向代謝組學專注于對代謝物的全面檢測,更適合全面探究暴露因子作用下代謝譜的改變和作用機理[49,50]。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法結合了超高效液相色譜和高分辨質譜的優點,是一種快速、靈敏度高、分離能力強、數據采集準確的分析技術,被廣泛地應用于復雜化學成分的結構鑒定[51]。Chu等[52]采用UPLC-QTOF-MS分析方法測定血漿代謝組學,評估長期暴露于PM與血漿代謝變化之間的關系。在PM10和PM2.5暴露下,分別檢測到124和162種代謝物。PM2.5暴露下鑒定出的25種差異代謝物大多數是磷脂分解產物,提示長期暴露于PM2.5可能影響磷脂分解代謝;對比PM2.5易感人群和普通人群,在易感人群中確認了6種差異代謝物,其中有2種在空氣凈化器干預前后發生顯著變化,這2種代謝物可作為PM2.5暴露的潛在生物標志物。

2.3 污染物與機體的相互作用

污染物對健康的挑戰不僅在于需明確日常生活中大量接觸化學物質的類型、劑量、頻率和持續時間,還在于他們與機體復雜的相互作用。傳統毒理學研究主要集中在污染物對生物體的劑量-反應關系和毒性終點指標上。然而,生命體由碳水化合物、脂質、核酸和蛋白質等生物大分子構成[53],這些生物大分子之間復雜的相互作用是生命體生長、發育和存在的基礎。污染物對生命健康的危害經常是通過與體內生物大分子的相互作用來實現的,因此進一步在分子水平上研究污染物與生物大分子的相互作用必不可少[54,55]。本文以廣受關注的POPs為例簡要闡述污染物與生物大分子的相互作用。POPs能廣泛、持久地分布于各種環境介質和生物體內,很多還具有生物積累和生物放大效應[56],能造成神經行為障礙[57]、致癌[58]和激素失衡[59]等不良后果,嚴重威脅人類健康。有些POPs與體內的配體或代謝物等物質的結構相似,與蛋白質、核酸、脂質和碳水化合物等生物大分子具有親和力[60],進入機體后會首先作用于生物大分子,改變生物大分子的結構,從而導致一系列的病變。如PFASs與DNA相互作用會誘導DNA變形[61], PFOA與脂質雙分子層的磷脂相互作用能破壞細胞膜結構,誘導細胞死亡[62,63]。與核酸和碳水化合物等其他生物大分子相比,蛋白質與污染物的相互作用更普遍,POPs通過氫鍵、范德華力以及疏水相互作用力與蛋白質靶點(包括酶、血清蛋白、轉錄因子、轉運蛋白和G蛋白偶聯受體(GPCRs)等)相互作用。從污染物的代謝動力學角度來看,研究污染物與蛋白質的相互作用有助于在分子水平上了解POPs的吸收、分布和代謝[64]。在效應學角度來看,POPs通過競爭性抑制和變構等動力學和熱力學過程改變酶、轉錄因子和GPCRs等蛋白質靶點的活性,調節細胞信號傳導過程,導致炎癥和癌癥等多種病理變化[65,66]。因此研究污染物與蛋白質的相互作用是闡明污染物毒性機制的重要手段。POPs進入人體后,與之相互作用的第一類蛋白質是存在于胃中的消化酶,例如PFOA/全氟壬酸(PFNA)暴露導致胃蛋白酶構象發生變化[67]。POPs從胃吸收進入血液,與白蛋白和血紅蛋白等血漿蛋白表現出高度的親和力而阻礙了其生理功能,如殺螟丹與血紅蛋白結合,改變血紅蛋白構象,造成氧結合能力下降,導致高鐵血紅蛋白血癥[68]。有些POPs與體內激素受體、GPCRs、轉運蛋白和離子通道等具有高親和力和特異性,如滴滴涕(DDT)的化學結構與激素相似,能與促卵泡激素受體(FSHR)相互作用,促進環磷酸腺苷(cAMP)的產生并破壞內分泌信號,可能對生殖和性發育產生不利影響[69]。有的POPs進入到細胞質中,進一步與核受體/轉錄因子(如芳香烴受體)相互作用,導致體內平衡破壞,甚至造成遺傳毒性[65]。

2.4 污染物的聯合毒性

化學品對健康的影響信息之前大多來自于流行病學和毒理學的研究,通過分析幾種污染物與特定表型的關系,預測暴露-疾病關系中的機制。然而在日常生活中,大多數化學物質并非孤立存在,人體接觸的是龐大的化合物種類,因此很難孤立地觀察和明確一種化學物質的影響。很多情況下,暴露組學所關注的許多化學物質來自相同或相關的來源(如工業過程、消費品和飲食),這些化學物質在暴露和富集途徑等方面常呈現相互關聯的動態變化模式,這一特征與復雜生物系統中的群落結構類似。因此,通過對相關污染物進行分組可以降低混合污染物的復雜性,進而探索他們對生物體的影響[70]。但是,不同類型、不同來源污染物的聯合效應則更復雜,污染物之間的相互作用可能會加劇他們在機體內的毒性[71](見圖3)。以塑料為例簡要說明這個問題:塑料因其持久性、普遍性和潛在的毒性,已成為環境的主要威脅之一,預計到2050年,自然環境中將有約120億噸塑料廢物[72]。其中,微/納米塑料(MPs/NPs)問題尤其引人關注,這類惰性有毒物質的粒徑決定其容易通過消化道進入機體以及在機體內的分布[73]。MPs/NPs通過表面吸附和空隙填充裝載各種污染物(如重金屬、POPs、藥物、細菌和病毒等)并將其輸送、釋放到新的地點(特別是生物體內)的特性被定義為“特洛伊木馬效應”[74,75]。例如在腸道內環境條件下,會增加塑料中增塑劑雙酚A(BPA)的釋放,BPA進入細胞內可以與雌激素核受體相互作用,干擾內分泌系統的正常功能[54,76]。MPs/NPs的毒性效應不止來源于塑料本身和塑料添加劑,其吸附或負載的污染物對生物產生的綜合毒理學效應涉及多個生命階段,涵蓋發育、行為、基因和代謝毒性、免疫反應和腸屏障功能障礙等諸多方面[77-81],已成為環境毒理學領域的研究熱點之一。多數研究表明,與單個污染物相比,MPs-污染物混合物的毒性更強[82]。MPs/NPs聯合全氟化合物(PFOA和PFOS)暴露,導致蚯蚓對PFOA和PFOS的吸收增加,并顯著減少了蚯蚓的繁殖[83]。MPs暴露于人肝癌細胞株(HepG2)時,不會誘導細胞死亡,但當MPs與多氯聯苯聯合暴露時比多氯聯苯單獨暴露產生的毒性更大[84]。聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)通過誘導線粒體去極化和抑制膜ATP結合盒(ABC)轉運蛋白的活性,增加Caco-2細胞中砷的積累和毒性[85,86]。除MPs/NPs外,PM也可作為其他污染物的載體。PM是造成空氣污染致病的元兇之一,接觸大氣PM與心血管和呼吸系統疾病相關的發病率和死亡率增加有關。據估計,全球每年有650萬人死于空氣污染[87]。近些年來,PM2.5對呼吸系統和心血管系統健康的影響引起了人們的廣泛關注。PM2.5可沉積在整個呼吸道,特別是小氣道和肺泡,導致肺功能降低,誘發哮喘和支氣管炎,引發咳嗽和呼吸困難等癥狀,而且因其粒徑小易被吸收,并且易攜帶重金屬、多環芳烴和微生物等多種污染物質,對老人和小孩等敏感人群的作用尤為明顯[88,89]。研究表明,單獨暴露于甲醛或PM2.5對小鼠大腦幾乎沒有損傷,但對應劑量的甲醛與PM2.5聯合暴露時,有顯著的協同作用,加劇氧化應激和炎癥,造成血腦屏障損傷、β-淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)和過度磷酸化的tau蛋白(p-tau)積累、膠質細胞激活等病理改變,導致認知功能下降[90]。

圖 3 污染物的聯合作用Fig. 3 Combined effects of pollutants

3 總結

本文通過概括“環境-暴露組-健康”間的關系探討了環境暴露對健康的影響。人們長期處于復雜的環境暴露中,需要我們綜合考慮多種物質的共同作用,闡明重點污染物的健康效應、作用機制以及環境因素之間的相互影響,通過改變環境中的不利因素來減少疾病的發生。據估計,人類一生要經歷超過100萬次的暴露,因此認識生命不同階段的暴露組及對健康的特定影響是一項巨大的挑戰。首先,與基因組不同,暴露組在時間和空間上是高度可變的,這增加了描述他們對細胞、器官和生物體水平影響的難度;其次,表征未知分析物是了解暴露組的主要挑戰。隨著社會的發展,化學物質進入環境的速度、數量和種類都在不斷擴大,絕大多數疾病的發生是由未知的暴露因素引起的;最后,找出暴露、暴露影響和其他因素(如遺傳和疾病)之間的統計關聯,需要整合大量內/外暴露檢測數據。環境暴露的復雜性與我們目前的知識數據庫之間存在巨大差距,豐富數據庫任重而道遠。