河南省胞內分枝桿菌臨床分離株耐藥特征及基因分型

王少華,常文靜,蘇茹月,馬曉光,鄭丹薇,朱巖昆,石 潔,孫國清,孫定勇,郝義彬

河南省疾病預防控制中心 鄭州 450016

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌[1]。NTM在環境中分布廣泛,并且對大多數抗結核藥物天然耐受[2]。NTM中,鳥胞內分枝桿菌復合群(Mycobacteriumaviumcomplex,MAC)是致病NTM中全球分布最廣的分枝桿菌,一項對25篇文獻報道的共38 686株NTM分離株的分析結果顯示,MAC在大洋洲的分離率達到61%,北美洲為51%,非洲為49%,亞洲、南美洲和歐洲達到34%[3];課題組前期研究[4]也表明河南省NTM分離株中MAC占比達78.5%。根據Runyon分類原則,MAC屬于慢生長型NTM,不產色。MAC中最重要的致病菌有鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)和奇美拉分枝桿菌(M.chimaera)[5]。MAC亞種間的臨床特征、毒性、致病能力及對抗菌藥物的體外抗性差異較大[6],因此在臨床中需要對分離的菌株進行鑒定。

可變數目串聯重復序列(variable-number tandem repeat,VNTR)分型是一種以PCR技術為基礎的分型方法,其操作簡單,分辨率高,具有很高的可重復性,已廣泛用于分枝桿菌的基因分型,包括結核分枝桿菌[7-8]、胞內分枝桿菌等[9]。本研究對河南省部分地市的胞內分枝桿菌臨床分離株進行菌種鑒定,藥敏試驗和分子分型分析,旨在為胞內分枝桿菌感染性疾病的臨床診治和分子流行病學防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源68株來源于2019年河南省部分地市結核病?？漆t院患者痰標本分離的胞內分枝桿菌菌株,其中南陽市37株、平頂山市6株、鄭州市5株、洛陽市3株、周口市3株、駐馬店市3株、許昌市3株、信陽市2株、濮陽市2株、鶴壁市2株、開封市2株。

1.2 菌種鑒定用接種環刮取L-J羅氏培養基上生長的分枝桿菌懸于超純水中,95 ℃金屬浴裂解20 min,12 000 r/min離心10 min,取上清備用(-20 ℃冷凍保存)。采用熔解曲線法分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)進行菌種鑒定,該試劑盒可用于臨床和環境中常見的19種分枝桿菌的定性鑒定[10]。具體操作參照試劑盒說明書。采用16S rRNA、rpoB、ITS(16S～23S rRNA internal transcribed spacer)和hsp65基因聯合測序對菌種進行鑒定,引物由上海生工生物工程技術有限公司(Sangon公司)參考文獻[11]設計、合成。PCR反應體系(50 μL):PCR預混液2×Mix(康為世紀生物科技有限公司)25 μL,上下游引物各2 μL,DNA模板5 μL,無菌去離子水 16 μL。反應條件:預變性94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s,共計35個循環;最后72 ℃延伸 7 min。由Sangon公司測序,將基因序列提交NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性分析、比對、判定,相似度≥97%即可確定菌種。

1.3 藥物敏感性測定使用含16種預制凍干藥品的貝索96孔藥敏板(珠海貝索生物技術有限公司)進行藥敏試驗,包括阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、利福平、頭孢西丁、利福布汀、環丙沙星、克拉霉素、多西環素、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環素、莫西沙星、替加環素、妥布霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑和美羅培南。具體操作參照說明書。藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)范圍和臨界值的判定參照文獻[12]和說明書。

1.4 VNTR分型及聚類分析采用16個VNTR基因位點方法進行分型分析[9]。引物由Sangon公司合成。PCR反應體系同1.2。反應條件:預變性94 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共計38個循環;最后72 ℃延伸 7 min。擴增產物在20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,以確定其大小(以M.intracellulareATCC 13950為對照)。根據等位基因大小和基本單位長度計算等位基因重復數。使用Selander多樣公式[13]計算每個基因座等位基因多樣性指數(h),參考文獻[14]計算漢高指數(Hunter-Gaston discriminatory index,HGDI)。使用BioNumerics 8.1(Applied Maths,SintMartensLatem,Belgium)軟件對VNTR數據進行聚類分析。

1.5 統計學處理采用Excel 2010對資料進行整理,采用SPSS 19.0進行統計分析。應用χ2檢驗比較成簇菌株和非成簇菌株耐藥率的差異,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 菌種鑒定結果經鑒定,68株均為胞內分枝桿菌。

2.2 藥敏試驗結果見圖1。藥敏試驗結果顯示,克拉霉素、利福布汀和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑對胞內分枝桿菌具有較好的抗菌作用,耐藥率分別為11.76%(8/68)、5.88%(4/68)、8.82%(6/68),克拉霉素的抑制50%胞內分枝桿菌的MIC(MIC50)和MIC90分別為2和32 mg/L,利福布汀分別為0.5和2 mg/L,甲氧芐啶/磺胺甲惡唑分別為0.25/4.75和2/38 mg/L。同時耐藥4種以上的菌株占95.59%(65/68),耐藥6種以上的菌株占67.65%(46/68),耐藥8種以上的菌株占16.18%(11/68);有兩株(2.94%,2/68)全耐藥。

圖1 68株胞內分枝桿菌16種藥物的MIC(mg/L)分布

2.3 VNTR分型結果VNTR基因座的等位基因多樣性差異很大,h從0.014到0.590,詳見表1。在16個VNTR位點中,有3個位點(VNTR7、12、13)h>0.500。

表1 68株胞內分枝桿菌VNTR等位基因分布 株

2.4 VNTR聚類分析結果經VNTR聚類分析,68株分為45個基因型,其中34株來自11個簇(成簇菌株),34株為獨特模式的分離株(非成簇菌株)。68株的HGDI為0.978,見圖2。最小生成樹結果表明53株構成一個大簇,其余15株位于該簇周圍,見圖3。

圖2 68株胞內分枝桿菌16位點VNTR分型聚類圖

圖3 根據68株胞內分枝桿菌VNTR結果構建的最小生成樹

2.5 成簇和非成簇菌株的耐藥率比較見表2。成簇菌株中利奈唑胺和阿米卡星耐藥率高于非成簇菌株(P<0.05)。成簇菌株和非成簇菌株中克拉霉素、莫西沙星、利福平、利福布汀、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、妥布霉素、環丙沙星、多西環素和米諾環素耐藥率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 成簇和非成簇菌株耐藥率的比較 耐藥株數(%)

*校正χ2;#:確切概率。

3 討論

臨床上,大多數NTM對常見抗結核藥物耐藥。我國2020版《非結核分枝桿菌病診斷與治療指南》對于MAC感染者,推薦聯合使用大環內酯類(阿奇霉素或克拉霉素)、利福平(利福布汀)、乙胺丁醇等藥物,并根據病情變化加用氨基糖苷類藥物(阿米卡星)[15]。本研究結果顯示,河南省胞內分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素的耐藥率為11.76%,高于王淑琦等[16]的2.67%和Lin等[17]的3.7%,與Zhao等[18]的9.6%和李遠春等[19]的9.28%相當。大環內酯類是主要的抗NTM藥物,臨床治療結果也表明其對MAC感染有較好的效果[20-21]。本研究中利福平的耐藥率為97.06%,與Lin等[17]的79.0%相近,高于Zhao等[18]的21.2%,這可能與采取的臨界質量濃度不同有關。本研究使用預制的藥敏板,利福平的耐藥臨界質量濃度為2 mg/L,而Zhao等[18]用的臨界質量濃度為8 mg/L。本研究中利福布汀的耐藥率為5.88%,與肖士林等[22]的4.6%相當;甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的耐藥率為8.82%,遠低于Song等[23]的39.29%。由于不同菌株耐藥性差異較大,因此治療前需進行藥敏試驗,為臨床治療提供必要的支持。

本研究對68株進行了VNTR分型分析,結果表明,位點VNTR 7、12、13的h>0.500。王淑琦等[16]的研究中VNTR 7、11～13及15的h>0.500;Zhao等[18]的研究中VNTR 4、5、7、10、11、15和16的h>0.500;Zheng等[24]報道,除了VNTR 7和11外,其他位點的h>0.500;Lari等[25]的研究顯示位點VNTR 2、3、4、5、7、9、10和13的h>0.500。這表明各地菌株構成遺傳特異性有較大的差異。

本研究68株胞內分枝桿菌臨床分離株被分為45個基因型,包括來自11個簇的34個菌株和34個獨特模式的分離株。胞內分枝桿菌分離株VNTR分型的HGDI值為0.978,與Zheng等[24]的0.995和Lari等[25]的0.993相當,表明分型方法具有較高的分辨力。與Lari等[25]的結果不同,本研究中最小生成樹僅由一個53株菌的大簇構成,表明各地的胞內分枝桿菌菌株的多樣性存在差異。利奈唑胺和阿米卡星耐藥率在成簇菌株中高于非成簇菌株。Zhao等[18]報道莫西沙星耐藥率在成簇菌株中高于非成簇菌株;Zheng等[24]的研究表明左氧氟沙星非成簇菌株對的耐藥性高于成簇菌株;而王淑琦等[16]的研究結果顯示成簇菌株與非成簇菌株耐藥率沒有差異。

綜上,本研究結果表明,克拉霉素、利福布汀和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑等對河南省胞內分枝桿菌臨床分離株具有較好的抗菌活性,VNTR分型方法對胞內分枝桿菌臨床分離株具有較好的分型能力,成簇菌株對利奈唑胺和阿米卡星的耐藥率高于未成簇菌株。