鼠疫耶爾森菌低鈣應答V抗原人源單克隆抗體篩選與鑒定

張 黎,鄭濱洋,張 琪,吳海蓮,潘紅星,朱鳳才,吳海生,周劍芳

鼠疫俗稱黑死病,是由鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis,以下簡稱鼠疫菌)感染引起的一種自然疫源性烈性傳染病,為我國法定甲類傳染病[1]。人感染鼠疫后可表現為腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫等,其中肺鼠疫發病急、傳染性強(可通過飛沫傳播),不及時治療病死率可達100%。鼠疫在人類歷史上共引起3次大流行,導致約1.6億人喪生[2]。

鼠疫菌屬于耶爾森菌屬(Yersinia),該屬的典型形態是短而粗、兩極濃染的小桿菌,有莢膜,無鞭毛和芽孢的革蘭陰性菌。鼠疫菌的主要保護性抗原為F1抗原和低鈣應答V抗原(low-calcium response V antigen,LcrV),即V抗原。其中F1抗原為細菌莢膜,是鼠疫的主要保護性抗原[3]?？笷1抗體可協同干擾類鞭狀體結構(injectosome)上的V抗原與免疫細胞間的整合,對抗病菌的入侵[4-5]。V抗原和其他分泌性耶氏菌外膜蛋白(Yersinia outer protein,Yop),如YopB及YopD等,由75 kb pCD1質粒編碼,構成重要的III型分泌系統(type III secretion system, T3SS),是鼠疫菌感染入侵的基本毒力因子和誘導機體產生保護性應答的重要抗原[6-7],抗V抗體可阻止效應蛋白Yop的遞送[8]。V抗原一直是鼠疫研究的熱點,同樣作為保護性抗原,V抗原和F1抗原具有協同保護效應,目前在研的鼠疫重組亞單位疫苗也都是采用F1+V的組合[9]。V抗原的單克隆抗體也具有與F1抗體協同保護效果,甚至非保護性的V抗體也能明顯提高F1抗體的保護效果[10]。

本研究采用基因工程手段,從鼠疫疫苗臨床試驗受試者外周血中獲得針對鼠疫V抗原的全人源單克隆抗體,初步評價鼠疫抗體與抗原結合特異性參數及對動物的保護效果,進而深入了解鼠疫的致病機制,為研究人體針對鼠疫抗原免疫應答奠定基礎,為制備針對鼠疫的診斷及治療制劑提供候選分子。

1 材料與方法

1.1 抗原、全血標本、菌株和實驗動物 鼠疫耶爾森菌重組V抗原由蘭州生物制品研究所保存并提供;5份全血標本來自于蘭州生物制品研究所有限責任公司的鼠疫重組疫苗II期臨床項目(臨床試驗批件號:2012L01329);鼠疫菌強毒株141株由青海地方病預防控制所鼠疫專業實驗室分離鑒定并保存;BALB/c小鼠購自江蘇華創信諾生物公司?？寺【闐H5α、建庫菌株XL1-Blue均由本室保存。

1.2 載體、細胞、試劑耗材 建庫載體pComb3-XSS、抗體IgG表達載體pGI由本室構建及保存;HEK293F購自ATCC;人單核細胞系THP-1由本室保存;反轉錄試劑盒、PCR試劑購自TaKaRa公司;SfiI內切酶、T4鏈接酶購自NEB公司;TNF-α CBA試劑盒購自BD公司;其他化學試劑均為分析純。

1.3 文庫構建 經知情同意及倫理審查,從鼠疫疫苗II期臨床項目中采集完成3次免疫后的志愿者全血標本共5份,每份采集10 mL抗凝血。使用Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞(PBMC),使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取總RNA,然后采用Roche公司的第一鏈cDNA合成試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis for RT-PCR進行反轉錄。根據文獻報道方法擴增抗體的輕鏈及重鏈可變區基因,并且經過融合PCR鏈接成ScFv片段[11]。ScFv片段經SfiI酶切后與同樣經SfiI酶切的pComb3XSS載體鏈接后電擊宿主菌XL1-Blue感受態制備噬菌體抗體文庫,噬菌體抗體文庫經野生型輔助噬菌體VCSM13包裝后進行后續篩選,具體方法按文獻進行[12]。

1.4 文庫篩選 按照結合、洗滌、洗脫、擴增的方式,對上述噬菌體展示抗體文庫進行親和淘選。將重組表達的鼠疫LcrV抗原包被于免疫管中進行固相化,包被濃度依次為500、300、200 ng/mL。具體步驟如下:向免疫管中加入相應量的LcrV蛋白,4 ℃包被過夜;棄上清,0.05% PBST 洗板3次,加入 3% BSA 37 ℃封閉 2 h;棄封閉液,0.05% PBST 洗板3次,加入抗體文庫,37 ℃先振蕩孵育1 h,再靜置孵育1 h;棄上清,0.1% PBST洗滌10次,加入pH2.2的0.1 mol/L Gly-HCl洗脫,再用2 mol/L Tris中和至pH7.0,取10 μL測定滴度,剩余噬菌體感染XL1-Blue宿主菌后進行擴增,次日用PEG6000沉淀噬菌體再進行下一輪篩選。

1.5 陽性克隆鑒定 從第三輪篩選測滴度的平板上隨機挑取96個單菌落于96孔深孔板中,37 ℃、260 r/min培養4 h,然后1∶10轉接至新的深孔板中再震蕩培養4 h,加入1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導過夜。次日用間接ELISA法檢測上清中抗體的表達,具體如下:首先將鼠疫LcrV抗原以200 ng/孔包被于96孔酶標板中,加入50 μL 3%脫脂牛奶和50 μL經IPTG誘導的細菌上清,37 ℃震蕩孵育1 h,PBST洗板3次,加入HRP標記的抗M13噬菌體單克隆抗體,37 ℃孵育30 min后,PBST洗板,加入TMB顯色液顯色10 min,用2 mol/L硫酸溶液終止反應后讀取OD450的吸光度值。陽性克隆提質粒后送測序,測序結果經IMGT數據庫比對抗體可變區的基因序列,選取序列有差異的克隆進行全抗體表達。

1.6 抗鼠疫LcrV人源IgG1型全抗體表達 將LcrV抗體的重鏈可變區基因經AgeI和SalI酶切位點克隆入全抗體表達載體pGI-H,輕鏈基因經AgeI和Bsiw I酶切位點克隆入pGI-K載體。測序正確后,使用PEI轉染試劑將雙質粒共轉染293F細胞,5 d后收取細胞上清,用Protein A柱純化目的抗體。

1.7 LcrV人源抗體與LcrV抗原結合特異性鑒定 采用間接ELISA及Western blot法鑒定人源抗體與LcrV抗原的結合特異性。首先,將LcrV蛋白以200 ng/孔包被96孔酶標板,純化抗體從1 μg/mL開始倍比稀釋,一抗37 ℃孵育1 h,PBST洗滌后加入HRP標記的抗人IgG,然后37 ℃孵育30 min,后TMB顯色,終止后讀取OD450吸光度值,每個樣品重復3次取平均值。然后,對目的抗體進行Western blot檢測,將10 μg的LcrV蛋白經SDS-PAGE后,將PAGE膠上蛋白轉印到PVDF膜中,經3%脫脂牛奶封閉及重組LcrV人源單抗孵育,洗滌后加入HRP標記的抗人IgG。最后用DAB直接在PVDF膜上顯色。

1.8 抗體親和力測定 本研究使用生物膜干涉技術(BLI)檢測人源抗體與LcrV抗原結合的親和力及動力學參數[13]。使用Pro A傳感器將抗體固化于傳感器表面,再與稀釋后的LcrV抗原反應,通過分析表面光干涉的改變得到分子間相互作用的的信息。使用Octet Red 96 大分子作用儀實時監測整個結合及解離過程。具體操作方法參考儀器說明書。

1.9 重組單抗對LcrV抗原激活免疫細胞的影響 將THP-1細胞株以4×105/孔接種于12孔板中,加入5 μg/mL的PMA(Sigma, p8139)37 ℃培養48 h,換無血清Opti-MEM培養過夜。次日,將測試單抗以50 μg/mL與5 μg/mL的LcrV抗原先37 ℃孵育1 h,加入誘導分化的THP-1細胞中,只加5 μg/mL的LcrV抗原作為陽性對照,用THP-1細胞作為mock對照。所有細胞培養24 h后收集上清,用BD TNF-α CBA(CB45641127)試劑盒檢測,以標準品濃度曲線計算待測上清中TNF-α濃度值。

1.10 動物保護試驗 在青海省地方病預防控制所鼠疫專業BSL-3實驗室完成該部分實驗工作。每組4只6～8周齡雌性BALB/c小鼠,將500 μg/只的重組LcrV抗體提前24 h經腹腔注射小鼠,次日經皮下多點注射攻毒100 MLD的強毒標準株141鼠疫菌。同時用4只未免疫抗體的小鼠注射100 MLD強毒株做未免對照,用于驗證毒株的毒力。完成免疫及攻毒后,將小鼠飼養在密封動物籠具中,每日記錄小鼠死亡情況,對于死亡的小鼠進行解剖后,取心、肝、肺臟器進行壓印平板培養鼠疫菌,對培養陽性菌用鼠疫菌特異性噬菌體裂解驗證。

2 結 果

2.1 人源抗鼠疫耶爾森菌噬菌體文庫的構建 收集了5份鼠疫疫苗接種自愿者的外周全血,通過密度梯度離心分離出PBMC,分別提取RNA和反轉錄,然后將cDNA等比例混合后用19對人ScFv引物分別擴增抗體的輕重鏈可變區基因。酶切后連接噬菌體載體,連接產物電擊2次XL1-Blue感受態細胞,測定文庫的庫容量達7.54×108CFU,經菌落PCR驗證文庫中正確插入率為100%。

2.2 人源抗體的篩選及抗體序列分析 經3輪篩選后,挑取的96個單克隆菌落,經過IPTG誘導及噬菌體ELISA,確定OD450值>1.0的陽性克隆29個,經測序后得到輕重鏈序列完整的克隆26株,如圖1。經過IMGT數據庫比對序列,獲得3株特異性單克隆抗體,分別命名為RV-B4、RV-D1、 RV-E8。3株抗體序列經IMGT數據庫分析,發現RV-B4抗體的VH基因為VH1-46家族,輕鏈為Lambda 1-51;RV-D1和RV-E8重鏈均為VH3-30,輕鏈分別為Kappa鏈的VK3-20和VK1-39胚系基因,如表1所示。3株抗體的重輕鏈CDR區氨基酸序列如表2,其中RV-E8的重鏈CDR3長達22個氨基酸,這提示該抗體經歷過較長的進化成熟,其親和力理論上較高。

圖1 噬菌體ELISA篩選文庫中的目的抗體Fig.1 Using phage ELISA to select antibodies in library

表1 3株LcrV特異性抗胚系基因及變異度分析Tab.1 Germline variation and deviation analysis of 3 LcrV-specific antibodies

表2 3株LcrV抗體CDR區氨基酸序列比對Tab.2 Amino acid sequence alignment of 3 LcrV antibodies’ CDR

2.3 人源抗體與LcrV抗原結合特異性鑒定 為了進一步確定表達純化的3株人源抗體與LcrV抗原結合的特異性,我們分別進行了抗體與LcrV重組蛋白的間接ELISA和Western blot實驗。如圖2A,3株人源抗體與LcrV重組蛋白ELISA結果顯示此抗體均能與LcrV抗原特異性結合,且對該重組抗體的檢測靈敏度可達3 ng/mL左右。Western blot結果顯示2株抗體均能與LcrV抗原反應,在37 kDa處出現明顯條帶,同時此結果顯示該抗體均識別抗原上的線性表位,如圖2B。

注:A. 3株人源單抗與LcrV蛋白間接ELISA結果;B. 3株抗體與LcrV蛋白的Western blot結果;M. 相對分子質量標準;1、2和3分別為RV-B4、RV-D1和RV-E8抗體。圖2 3株人源單克隆抗體與LcrV重組蛋白結合特異性鑒定Fig.2 Characterization of binding specificity of 3 mAbs to LcrV antigen

2.4 抗體親和力測定 利用膜干涉技術,對3個人源單克隆抗體分別與LcrV抗原結合、解離數據進行分析。結果表明,3個鼠疫抗體與LcrV抗原都有很高的親和力,其中RV-E8的KD值最高,為1.24 nmol/L,而RV-B4和RV-D1的KD值分別為2.1 nmol/L和42 nmol/L。見圖3。

圖3 3株人源抗體與LcrV抗原結合的動力學分析結果Fig.3 Kinetic analysis result of 3 human antibodies binding to LcrV protein

2.5 重組RV單抗對LcrV抗原免疫調節功能的影響 已發現的抗LcrV主要通過調理作用,干擾V抗原抑制單核細胞、中性粒細胞等吞噬細胞的吞噬功能和炎性應答。我們選擇人單核細胞株THP-1為靶細胞系,用PMA在體外將其誘導分化為巨噬細胞,模擬研究LcrV抗原對吞噬細胞的免疫調節。發現與mock細胞相比出現,LcrV抗原刺激后,細胞活化,分泌高水平的TNF-α,將3株單抗分別與LcrV抗原預孵育后, 發現RV-D1抗體有下調TNF-α的趨勢,但與陽性對照LcrV經非參數配對t檢驗,差異無統計學意義(P=0.25),如圖4。提示這3株抗LcrV單抗體外干擾V抗原的免疫調節功能不顯著,為進一步明確,我們進行了3株抗體的動物保護實驗。

圖4 單抗對LcrV抗原激活免疫細胞釋放TNF-α的影響Fig.4 Effect of mAbs on LcrV-induced TNF-α releasing from THP-1 cells

2.6 動物實驗結果 小鼠經過免疫單抗、鼠疫141強毒菌株攻毒后,發現所有動物均在觀察期內死亡,包括只注射100 MLD的對照組動物。結果提示3株RV抗體均沒有對BALB/c小鼠有免于死亡的保護作用,100 MLD的未免疫對照組小鼠也全部死亡,如圖5A。所有死亡小鼠取心、肝、脾、肺臟經過壓印赫氏平皿,次日平皿上均有菌落長出(圖5B),經鼠疫菌鑒別噬菌體裂解驗證,壓印菌均出現紅色虛線區域的清晰噬菌帶(圖5C),確認小鼠死亡皆由鼠疫菌導致。

注:A. 攻毒試驗中小鼠生存曲線;B. 死亡動物心、肝、脾、肺壓印赫氏平皿后細菌生長情況;C.鼠疫特異性噬菌體裂解鼠疫菌形成的噬菌帶。圖5 LcrV重組單抗對小鼠保護性試驗Fig.5 Protection ability of anti-LcrV mAbs against Y. psetis

3 討 論

雖然現在并非處于鼠疫大流行的時期,但是鼠疫仍然處于高度散發狀態。根據WHO統計,2013-2018年全球共報告了2 886例鼠疫,其中死亡504例[14]。

F1單抗具有保護性已經得到了充分的驗證,1997年美國陸軍傳染病醫學研究所最早報道了1株針對F1抗原的F1-04-A-G1單抗,此抗體在小鼠模型中具有100%的保護力,由于安全原因,該抗體的序列至今沒有公布[15]。2017年陳薇院士團隊報道的F2H5鼠單抗,同樣也是針對F1靶標,該抗體進行了人源化后100 μg即可對小鼠起到完全保護[16]。吳智遠等[17]于2018年報道了1株針對F1的4C6鼠單抗。關于LcrV抗體報道的比較少,目前能檢索到的僅Hill J等報道的mAb7.3單克隆抗體為第1個具有保護性的抗-V抗原抗體[10],后續又發現mAb7.3與F1-04-A-G1聯用具有協同作用[18]。

據之前文獻報道LcrV是通過識別免疫細胞表面的TLR2/6和CD14分子而進行免疫調節[19],然而,根據本研究從多個角度對3株單抗的生物學活性進行評測結果來看,此3株抗體雖為LcrV特異性人源單抗抗體,但是在體外并不能明顯影響LcrV與TLR2/6和CD14分子的結合,進而減弱其對免疫細胞的進一步活化。同時,也沒有在動物實驗中表現出明顯的動物體內保護性的效果,根據英國學者Hill J等[18]報道,LcrV單抗在與F1單抗連用時候可以明顯提高抗體組合的保護效果,其說明LcrV單抗對F1單抗有一定的協同效應,本研究報道的3株單抗是否也具有此特性,有待進一步研究。

利益沖突：無