1起ST19型鼠傷寒沙門氏菌引起的食物中毒調查、溯源分析與探討

余樹坤,劉 浪,譚雅心,崔紫妍,徐興宇,陶志陽

沙門氏菌作為食源性腹瀉常見的病原菌之一[1],廣泛地存在于自然界中,其傳播主要與受污染的動物肉類和蛋類食品有關,能引起各種家禽和哺乳動物的傳染病,也可引起人類感染,以腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌感染常見,具有重要的公共衛生意義[2-3]。

2022年1月19日,武漢市某區人民醫院發熱門診先后收治多名進食晚餐后出現發熱、腹瀉、嘔吐等胃腸道癥狀的患者,均來自同一項目工地,具有共同進餐史,調查顯示項目工地20名員工于1月19日共同進食晚餐后,其中有7人發病,臨床癥狀以發熱、腹瀉為主。根據流行病學調查及實驗室結果,高度懷疑為沙門氏菌引起的食物中毒。本研究對采集的樣本進行了微生物相關致病菌檢測,并對檢測到的沙門氏菌應用脈沖場凝膠電泳技術進行分子分型和全基因組測序,以期為今后類似事件的調查檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣本來源 現場共采集相關樣本20份,其中7份病例(含2名廚師)肛拭子樣本;2份病例糞便樣本;5份共同進餐工作人員肛拭子樣本;6份外環境涂抹樣本來自圓砧板、小砧板、刀把手、灶臺。因項目工地食堂無剩余熟食,且無剩余未加工的原材料,無法進行可疑食物樣品采集。

1.1.2 主要儀器 高通量測序系統(Illumina公司,型號:Illumina MiSeq),實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司,型號:QuantStudio 7 Flex),全自動核酸提取儀(西安天隆科技有限公司,型號:NP968-C),全自動微生物鑒定藥敏分析儀(碧迪醫療器械有限公司,型號:BD Phoenix M50),脈沖場凝膠電泳系統(Bio-Rad公司,型號:Chef mapper),病原微生物生信分析平臺(杭州柏熠科技有限公司,版本V5.0)。

1.1.3 培養基與試劑 18種食源性病原體核酸多重實時熒光PCR檢測試劑盒(上海卓成惠生,批號:T202207158),SC增菌液(北京路橋有限公司,批號:221216),沙門顯色瓊脂培養基(青島海博有限公司,批號:20230227),革蘭氏陰性菌鑒定/藥敏板(碧迪醫療器械(上海)有限公司,批號:2067245),沙門氏菌屬139種診斷血清(寧波天潤,批號:20220701), 細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,批號:X1017),MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)測序試劑盒(Illumina公司,批號:20680866)。

1.2 方 法

1.2.1 病例定義 自1月17日以來在該工地食堂就餐后出現發熱(≥37.3 ℃)、腹瀉(≥3次/24 h,并伴大便性狀改變)、嘔吐等癥狀,判定為疑似病例。

1.2.2 流行病學調查 按照《食品安全事故流行病學調查技術指南(2021版)》,根據病例定義對搜索到的全部病例進行個案調查。調查內容主要有人口學信息、發病和治療經過。調查該項目部食堂中所用食物原材料來源,食物加工方法、制作過程,食物原材料及成品保存方法、保存環境等。

1.2.3 致病原的多重PCR檢測及分離鑒定

1.2.3.1 樣本總DNA/RNA的提取及多重PCR檢測 將采集的20份樣本充分震蕩混勻后,用全自動核酸提取儀提取核酸,按照18種食源性病原體核酸多重實時熒光PCR檢測試劑盒操作說明開展多重PCR檢測。

1.2.3.2 致病菌的分離鑒定 根據多重PCR初篩結果,將鹽水管采集的肛拭子和外環境涂抹樣本及糞便樣本各吸取少許液體接種到SC增菌液中增菌培養,增菌液劃線接種到相應的選擇培養基,36 ℃培養24 h后觀察結果?？梢删浞旨兣囵B后采用全自動微生物分析儀進行系統生物鑒定,陽性菌株進行血清學實驗。

1.2.4 藥敏試驗 選用全自動細菌生化鑒定儀配套的革蘭陰性細菌藥敏卡,包含20種抗生素,對12株菌株進行藥敏實驗,按照試劑盒說明書操作并判定結果。

1.2.5 PFGE分子分型 使用Xbal限制性內切酶進行內切消化,并按照《國家致病菌識別網實驗室監測手冊(2022版)》中沙門菌PFGE分型程序操作說明進行菌株分型。經GelRed染色成像,使用BioNumerics軟件以90%相似度進行聚類分型。

1.2.6 全基因組測序分析

1.2.6.1 測序 根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA,DNA濃度高于100 ng/μL后,經Illumia測序平臺測序,然后通過柏熠病原微生物分析平臺(V 5.0)用fastp軟件(v0.23.2版本)進行數據質量質控,過濾后的clean data使用SPAdes軟件(v3.15.3版本)對沙門氏菌全基因組序列進行組裝。

1.2.6.2 生物信息學分析 根據沙門氏菌的基因組信息和抗性基因數據庫中的基因信息,使用abricate(V1.0.1)軟件進行耐藥注釋分析 。沙門氏菌血清型鑒定使用seqsero2(V1.2.1)軟件分析注釋。使用mlst(V2.23.0)針對沙門氏菌管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA進行多位點序列分型(MLST),使用cgmlstfinder(V1.2.0)進行核心基因組多位點序列分型(cgMLST)。使用snippy對樣本進行全基因組單核苷酸位點分析(wgSNP)。對比NCBI assembly同源數據庫,采用fastANI(V 1.33)對數據庫進行同源性分析,選取同源性排序前50株樣本使用fasttree(V2.1.11)構建進化樹,計算進化樹上進化距離關系,從而獲得最近源序列。

2 結 果

2.1 流行病學調查結果 該項目工地共有員工20名,可提供三餐及住宿,食堂由2名廚師(肖某、陳某)輪流值班,環境衛生一般,宿舍為搭建的活動板房,無空調,密封條件差。經調查,符合患者定義的共有7例,首例病例發病時間為1月20日0∶00,末例病例發病時間為1月20日6∶00,發病高峰為1月20日0∶00-02∶00。最短潛伏期約為7 h,最長潛伏期約13 h,平均潛伏期為9.1 h。7例病例臨床癥狀以發熱、嘔吐、腹瀉為主,并伴有頭痛、頭暈等癥狀?；颊呔鶠槌赡昴行?最小32歲,最大71歲。所有患者經抗炎補液及對癥治療后均已痊愈返崗。

2.2 樣本檢測結果

2.2.1 多重PCR鑒定結果 20份樣本中,12份樣本多重初篩沙門氏菌陽性,其中病例肛拭子樣本7份、病例糞便樣本2份,工作人員肛拭子樣本3份,其余樣本均為陰性。

2.2.2 沙門氏菌分離鑒定及血清學結果 參考多重PCR結果,對12份樣本進行沙門氏菌分離,增菌后的樣本中均檢出疑似沙門氏菌,經革蘭染色、生化系統鑒定均為陽性,與多重PCR結果一致,菌株編號為DXH001～DXH012,其中DXH010與DXH005為病例5不同發病時期樣本分離株,DXH011與DXH002為病例2不同類型樣本分離株,DXH012與DXH003為病例3不同類型樣本分離株。

對分離到的12株沙門氏菌進行血清型分析,A-F沙門菌多價血清凝集陽性,O4、O12抗原血清凝集陽性,Hi、H2抗原血清凝集陽性,生理鹽水對照陰性。得到的抗原為4,12:i:2,查詢Kauffman-White表,均為鼠傷寒沙門氏血清型,見表1。

表1 食物中毒相關樣本分離結果Tab.1 Isolated Salmonella strains from samples related to food poisoning

2.3 藥敏分析結果 12株菌株耐藥譜完全一致,均對阿米卡星、氨芐西林、頭孢唑啉、慶大霉素、哌拉西林、 四環素耐藥,其余14種均敏感。

2.4 PFGE分析結果 考慮DXH010與DXH005(病例5)、DXH011與DXH002(病例2)、DXH012與DXH003(病例3)分別來自同一人員不同時期或不同類型樣本分離株,且其生化和血清分型結果一致,后續PFGE和基因測序僅選取DXH001～DXH009菌株進行分析。

將上述9株沙門氏菌株使用限制性內切酶XbaI酶切后進行PFGE,膠塊經Gelred染液染色后成像,結果顯示9株沙門氏菌產生的電泳條帶均相同且分子量大小一致,再將9株沙門氏菌的脈沖場電泳圖譜導入BIoNumercis軟件進行聚類分析,結果顯示9株菌株相識度為100%,說明為同一型別菌株,見圖1。

圖1 9株沙門氏菌分子分型聚類分析圖Fig.1 Diagram of molecular typing and clustering analysis of nine strains of Salmonella

2.5 基因測序與溯源分析結果

2.5.1 全基因組測序、組裝結果 經Illumina測序平臺和fastp軟件質控后,共得到約4.2 G的原始數據,組裝后的9株沙門氏菌的基因組大小在4 929 134～4 930 589 bp,GC含量為52.15%～52.16%。

2.5.2 血清凝集分型與全基因組分型結果比較 WGS分型結果均為B群鼠傷寒沙門氏菌,O1、O4、O15、O12抗原血清凝集陽性,Hi、H1、H2抗原血清凝集陽性,與常規血清分型結果一致,兩種方法符合率為100%。

2.5.3 耐藥基因預測分析與耐藥表型比較 基因組耐藥基因注釋分析發現,每株鼠傷寒沙門氏菌含有10種數量相等的耐藥基因,作用機制全部為抗生素外排型。預測顯示,9株菌株基因組均含有單菌霉碳、碳青霉烯、頭孢菌素、頭霉素、青霉烷、利膽醇類、青霉烯、氟喹諾酮、甘氨酰環素、四環素、利福霉素、三氯生、氨基香豆素、硝基咪唑、氨基糖苷類耐藥基因。進一步分析發現多種耐藥基因可針對一種抗生素產生抗性,例如預測3種耐藥基因acrB、mdsB和mdsC均可產生對青霉烷類、氟喹諾酮、氨基香豆素耐藥,mdsB和mdsC耐藥基因同時可以產生頭孢菌素耐藥。通過比較,WGS預測的沙門氏菌耐藥基因與藥敏結果的符合率較高,對氨基糖苷類、頭孢菌素、青霉烷、四環素預測的結果完全一致,見表2。

表2 9株鼠傷寒沙門氏菌基因組耐藥基因注釋分析結果Tab.2 Genome drug resistance gene annotation analysis of nine strains of Salmonella typhimurium

2.5.4 MLST與cgMLST分型結果 為了進一步對9株沙門氏菌進行基因組溯源分析,我們首先使用MLST分析菌株間的相關性?；谌蚪M序列的MLST分析結果顯示9株菌株均為ST19型別?？紤]到MLST分辨力低,對不同暴發或者沒有直接流行病學關聯的菌株區分能力差,我們進一步進行核心基因組多位點序列分型(core genomemultilocus sequence typing,cgMLST)分析,cgMLST 檢測和比對成百上千個基因位點的序列差異,比傳統的 MLST 方法具有更高的分辨力。分析結果顯示,其分型結果均為cgST 264803 型別,見表3。

表3 cgMLST結果統計信息表Tab.3 The cgMLST results of statistical information

2.5.5 核心基因組單核苷酸多態性分析結果 考慮到同一起暴發性事件往往為同一傳播鏈樣本,其基因組差異相對較小。全基因組測序的單核酸多態性分型(whole genome-based singlenucleotide polymorphisms,wgSNP) 是在全基因組序列的水平上選擇一定數目的 SNP,比較不同細菌基因組中 SNP 的信息,具有更高的分辨率。9株鼠傷寒沙門氏菌間存在有17個變異位點,樣本之間直接SNP差異數為1～6個位點。9株菌SNP最小生成樹見圖2。

圖2 9株ST19型的鼠傷寒沙門氏菌最小生成樹分析圖Fig.2 Diagrams of minimum spanning trees for nine strains of Salmonella typhimurium ST19

2.5.6 系統發育分析 為了更全面的分析樣本之間的系統進化關系,我們加入NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中篩選過濾后的完整基因組中沙門氏菌1 188株的數據,然后進行ANI同源性分析,選取同源性排序前50株樣本使用fasttree構建進化樹。9例樣本之間同源性明顯高于來源于數據庫中的其他樣本,并且處于同一進化分支上。在與公共數據庫中其他樣本比較時,我們發現同源性最高的是來源于江西的GCF_020221795.1樣本,詳見圖3。

圖3 59株沙門氏菌(9株ST19型的鼠傷寒沙門氏菌與50株NCBI數據庫沙門氏菌)進化樹與樣本來源分析圖Fig.3 Analysis of the evolutionary tree and sample sources of 59 strains of Salmonella, including nine strains of Salmonella typhimurium ST19 and 50 strains of Salmonella obtained from the NCBI database

3 討 論

沙門氏菌屬是一類危害人和動物健康的重要致病菌,廣泛地存在于自然界中,其傳播主要與受污染的動物肉類和蛋類食品有關。在世界各國的各類細菌性食物事件中,沙門氏菌引起的食物中毒事件數量常居榜首,其中以鼠傷寒沙門氏和腸炎沙門氏菌感染最常見。沙門氏菌引起的食物中毒的發病潛伏期為6～48 h,患者主要癥狀包括不同程度的惡心、嘔吐、發熱、腹痛、腹瀉,嚴重者可出現身體脫水和電解質紊亂[4],本次食物中毒事件中的患者符合這一發病特征,患者在同一時間、同一地點用餐后發病,臨床癥狀相似,發病潛伏期7～13 h,流行曲線呈點源式暴發。根據流行病學調查以及實驗室檢測結果判斷為一起由鼠傷寒沙門氏菌感染引起的食物中毒事件。鼠傷寒沙門氏菌病一年四季均可發生,但主要發生在第二季度和第三季度,沒有嚴格的地域性。

本次事件發生當天氣溫為1～13 ℃,提示沙門氏菌對惡劣環境的抵抗能力強,其表面生物膜使得沙門氏菌在嚴酷的環境中得以生存,增加沙門氏菌到達腸道的機會,導致了食物中毒感染事件的發生[5]。

近年來,隨著分子生物技術的廣泛普及,實時熒光定量PCR技術已成為檢測沙門氏菌的常用方法,具有敏感性高、特異性強的特點,可及時提供快速、準確的病原學診斷。本次食物中毒檢測分析過程采用了18種食源性致病菌的多重PCR檢測技術,可快速識別食物中毒事件感染的病原體,縮短了傳統培養時間,提升了臨床檢測效率。實驗室結果顯示多重PCR結果與分離鑒定結果一致,12株沙門氏菌血清分型均為B群鼠傷寒沙門氏菌,其中7株來自7份病例肛拭子樣本(含2名廚師),2株來自2份病例糞便樣本,3株來自3份工作人員肛拭樣本。鼠傷寒沙門氏菌作為一群泛嗜性沙門氏菌,其多重耐藥性正逐年增強[6-7],在2020-2021年我國吉林省收集的133株鼠傷寒沙門氏菌藥敏試驗結果證實,對氨芐西林和四環素耐藥的菌株比率均為73.5%,且其中多重耐藥菌株高達94株,這與國內很多地區對沙門氏菌耐藥性的研究類似[8]。細菌基因組所含有的耐藥基因與其耐藥性表型呈現良好相關性[9]。本研究發現每株鼠傷寒沙門氏菌均攜帶多種耐藥基因,提示菌株均有形成耐藥基因所針對抗生素的抗性的潛力。從耐藥基因的攜帶推斷抗菌藥物的耐性來看,應用WGS預測的氨基糖苷類、頭孢菌素、青霉烷、四環素的耐藥性與藥敏結果完全一致,與張璐等的相關研究相符[10]。同時,這9株菌株對阿米卡星、氨芐西林、頭孢唑啉、慶大霉素、哌拉西林、四環素多重耐藥,與全國的沙門氏菌多重耐藥現象相符[11-12],提示臨床應合理用藥,減少耐藥株的出現。此次患者治療可首選頭孢噻肟、頭孢他啶、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦等敏感抗生素。臨床選用頭孢他啶靜脈滴注后,患者全部治愈。

PFGE 是20 世紀80年代中期發展起來的一種非常有效的分子分型方法,被稱為細菌分子生物學分型技術的“金標準”[13-14]。本文通過XbaI酶切,應用PFGE技術,對一起食物中毒分離株進行分子分型,產生的電泳條帶較為理想,每株約產生12條30～700 kb條帶,9株鼠傷寒沙門氏菌獲得完全一致的PFGE 圖譜,提示它們為同源菌株。鑒于此方法分辨能力有限,故采用了基因測序溯源的手段對菌株進行了進一步分析。分析結果顯示9株沙門氏菌的MLST型別均為ST19型,其基因長度分布、類別數量分布、MLST分型管家基因序列種類編號均高度一致,為鼠傷寒沙門氏菌最常見的ST型[15]。cgMLST是使用某一個種的細菌核心基因組中的上千個基因位點的序列差異對菌株進行區分和分型,與傳統的MLST分析相比具有更高的分辨力,在金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團菌、結核分枝桿菌等多種病原菌的分型和分子流行病學研究中,顯示了非常好的應用前景。在本次分析的9株樣本中,其cgMLST的cgST分型為264803,表明了樣本之間的高度同源性。為了進一步區分樣本之間的關系,我們還進一步進行了wgSNP分析。從SNP的系統發育樹來看,本次食物中毒事件各菌株間SNP差異數為1～6。有文獻報道,SNP差值小于21為劃定暴發聚集的共同閾值[16],因此可判定本次事件為同一暴發來源,進一步明確了各菌株間關系。梁少溢等[17]研究報道,除去蠅、蟲和鼠等因素外,廚師也是極易引起食物中毒事件的關鍵因素。2015年北京東城區咸水鴨食物中毒事件中,4名廚師均為無癥狀STy攜帶者[18]。本次事件9株測序樣本中,2株來源于廚師,兩者之間SNP差異個數為2,與其他樣本來源菌株SNP差異數最大為6,提示廚師和該起食物中毒事件密切相關,可能是污染的來源。從進化樹關系分析可以看出,9株菌自成一簇,與數據庫其他沙門氏菌相差甚遠,屬于新的克隆分支。通過WGS序列分析發現,本次事件9株ST19型鼠傷寒沙門氏菌與江西省分離的2020年參考菌株(GCF_020221795.1)的親緣關系接近。兩者間可能存在未知途徑的傳播,待進一步研究考證。

本研究對鼠傷寒沙門氏菌引起的食物中毒暴發菌株從PFGE與WGS遞進角度進行了分析,有助于我們迅速發現不同分離分離菌株的相關性,深度揭示細菌性傳染病暴發可能來源,對食源性疫情暴發可以起到有效的控制,也可以為今后順利開展食源性病原菌的實驗室診斷和應急處置工作提供準確的依據。本次分離菌株存在多重耐藥現象,提示在今后工作中應加強國家致病菌識別網監測和細菌耐藥監測,指導臨床有針對型的選用抗菌藥物,避免多重耐藥菌株的發生。本次調查存在的不足是,在應急處置過程中僅采集了肛拭子和環境樣本,未進行食品樣本的采集,傳播證據鏈條還不夠完整,無法判定何種途徑導致病原體傳播。今后,相關部門要加強對餐飲食堂的監管力度,督促其認真落實食品留樣制度,合力防范食品安全事件的發生。

致謝：武漢市疾病預防控制中心病原微生物所周軍波老師和費小圓老師在PFGE分型檢測中給予大力幫助,在此一并致謝。

利益沖突：無