1例輸入性類鼻疽的病原學診斷及溯源分析

楊紅霞,王春雨,王 洋,郝瑞娥,趙啟玉,鄭 宵

類鼻疽(Melioidosis)是一種由類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)感染引起的人獸共患傳染病。主要流行于東南亞,尤其是馬來西亞、泰國、新加坡以及澳洲北部等南北緯20°之間的地區[1-3],2015年全球類鼻疽發病數估算約165 000例,死亡約89 000例[4]。在我國主要流行于海南、廣東及廣西等地區,在北方地區則較少見報道[5]。

該病臨床表現復雜多變,以肺炎、敗血癥、局部膿腫為主。類鼻疽伯克霍爾德菌是一種環境腐生菌,廣泛存在于水體、土壤等生活環境,對人和動物均具有高度致病性。類鼻疽伯克霍爾德菌侵入人體肺部后,容易形成難治性肺炎、肺部空洞,并可能短期內快速發展為敗血癥而死亡。此外,類鼻疽伯克霍爾德菌還可能引起腦膜炎、前列腺炎、尿路感染及內臟膿腫[6-7]。盡管類鼻疽的發現已有100多年,但因其臨床癥狀多樣化,使得漏診、誤診率及病死率均較高。因此,該病的病原學診斷尤為重要。

該病例是山西省報道的從1例感染發熱的患者血液標本中分離鑒定出類鼻疽伯克霍爾德菌,為明確其診斷和溯源,通過流行病學調查和全基因測序等方法,對該病例進行溯源分析,不僅為全面了解類鼻疽伯克霍爾德菌的分子流行病學特征奠定了基礎,還為山西省預防該病的流行及傳播提供了建議。

1 材料與方法

1.1 病史 患者為男性,21歲,學生,山西人?；颊咦允鲈?022年7月1日至6日在海南旅游。于7月5日上午出現頭暈、咽痛,隨后出現惡心、干嘔、乏力、四肢肌肉酸痛、無法行走,當晚前往三亞市級醫院就診,測體溫39.0 ℃,當地醫院給予頭孢抗炎、補液、退熱等治療(具體不詳)。返回太原后,于7月9日就診于山西省人民醫院急診,入院診斷為:紫癜性腎炎、發熱原因待查、右側胸背部疼痛待查?；颊哂?022年2月曾確診“紫癜性腎炎IIb型”。入院后進行血培養陽性,分離菌株經微生物質譜儀(德國布魯克)鑒定顯示為泰國伯克霍爾德菌(Burkholderiathailandensis),進行藥敏實驗(VITEK-2 COMPACT法國梅里埃,全自動微生物生化鑒定儀,革蘭氏陰性菌藥敏卡AST-GN09)。臨床會診后考慮患者自述在海南旅游期間曾有淋雨史,結合患者癥狀、體征,不能除外類鼻疽伯克霍爾德菌感染可能,遂將菌株送至山西省疾控中心進一步鑒定。7月21日山西省疾控中心鑒定為類鼻疽伯克霍爾德菌。臨床繼續給予美羅培南(2 g/d,靜脈滴注)抗感染治療,病情迅速得以控制,15 d后患者好轉出院。

1.2 細菌鑒定 我中心收到菌株后立即接種哥倫比亞血平板和營養瓊脂平板,37 ℃培養24 h后進行鑒定。觀察菌落形態,涂片革蘭染色。采用甲酸提取法,將細菌滅活后使用微生物質譜儀(德國布魯克MALDI-TOF MS)進行鑒定[8],同時采用API 20NE(法國梅里埃)做系統生化鑒定。

1.3 核酸提取及全基因測序 挑取菌落制成菌懸液,按照細菌DNA基因組核酸提取試劑盒說明書(德國QIAamp DNA 試劑盒)提取核酸。送北京諾禾致遠科技股份有限公司進行全基因測序。測序平臺為Illumina Novaseq 6000,測序文庫大小為350 bp,對基因組進行PE150雙末端高通量測序?；蚪M序列組裝、測序數據的質控、組裝和基因注釋分別采用FastQC、SPAdes v.3.13.1和Prokka v.1.14軟件。

1.4 耐藥基因分析 使用ResFinder 4.0軟件(https://bitbucket.org/genomicepid emiology/resfinder/src/master/)篩選菌株耐藥基因。參數設置為比對最小覆蓋度為60%,核酸比對相似性最小為80%。

1.5 多位點序列分型 (multilocus sequence typing,MLST) 將組裝好的菌株序列上傳至 MLST數據庫(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_bpseudo mallei_seqdef),針對類鼻疽伯克霍爾德菌的ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh7個管家基因進行比對匹配,獲得其所屬 ST型。從數據庫選取我國自1975至今上傳的類鼻疽伯克霍爾德菌共314株92個ST型,采用Bionumerics BN7.6軟件進行MLST聚類分析。

1.6 系統發育進化關系分析 通過美國國家生物技術信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網站搜索類鼻疽伯克霍爾德菌所有已測序組裝的基因組序列,篩選來自全球多個國家及地區,以及海南省相近ST型代表株與本研究分離株共54條全基因組序列做系統發育進化分析。采用全基因組測序單核苷酸多態性(WGS single nucleotide polymorphism,wgSNP)數據構建進化樹,利用fasttree軟件對wgSNP序列構建進化樹,使用pyani(https://github.com/widdowquinn/pyani)的ANIb算法計算菌株間基因組序列的相似性(ANI)。

2 結 果

2.1 菌株鑒定 將菌株接種于哥倫比亞血平板上,培養24 h發現有菌落生長,為圓形、濕潤、突起、透明或半透明小菌落,邊界完整;培養3 d后,形成干燥的白色菌落,表面有皺褶,多呈放射狀。革蘭氏染色陰性,卵圓形短小桿菌,菌體兩端濃染,見圖1。微生物質譜儀鑒定結果為類鼻疽伯克霍爾德菌。API 20NE生化反應顯示,硝酸鹽還原實驗、精氨酸、明膠、葡萄糖、甘露醇及氧化酶等反應陽性,編碼為1156577,鑒定為類鼻疽伯克霍爾德菌,菌株編號SX22_3027BPD。

圖1 類鼻疽伯克霍爾德菌革蘭染色(1 000×)Fig.1 Gram stain characteristics of B. pseudomallei isolates(1 000×)

2.2 抗生素藥物敏感試驗情況 采用微量肉湯稀釋法檢測菌株對常用抗生素的最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration,MIC),包括下列抗生素:哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明/磺胺甲惡唑。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922。藥敏試驗判讀結果參照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI)2016版及2023版中關于類鼻疽伯克霍爾德菌的敏感或耐藥標準進行判定[9-10]。據CLSI 的判讀標準,此分離株對頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦和復方新諾明均表現敏感,未產生耐藥。

2.3 基因測序結果

2.3.1 基本情況 SX22_3027BPD的基因組由連續序列組成,總長度為7 074 398 bp,GC含量為68.27%,共檢測到5 808個蛋白質編碼序列,編碼區域占比為83.39%。

2.3.2 MLST分型分析 類鼻疽伯克霍爾德菌有ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh7個管家基因的等位基因數為1～29個[11]。向MLST數據庫提交全基因組序列,獲得該菌株的ST型為366。該菌株與我國海南省分離的2株菌(BP2016和BP155)為相同ST型。從數據庫選取自1975年至今,我國上傳的309株類鼻疽伯克霍爾德菌(人源275株、環境17株及動物17株),共94個ST型,采用BN軟件進行MLST聚類分析,結果見圖2。

注:每個圓形代表一個ST型,圓形大小代表數量的多少。紅色代表此次鑒定的ST366型菌株,紫色代表MLST型數量在10條以上,綠色代表10條以下。圖2 309株類鼻疽伯克霍爾德菌的MLST最小生成樹Fig.2 MLST minimum spanning tree diagram of 309 strains of Burkholderia pseudomallei

從圖2可以看出在我國ST型較常見有ST46(28,9.1%)、ST58(23,7.4%)、ST70(23,7.4%)、ST50(22,7.1%)、ST55(16,5.1%)、ST32(10,3.2%)、ST37(10,3.2%)及ST1095(10,3.2%),與Fang Y等[12]研究結論一致。

該菌株的MLST分型ST366與ST51親緣關系最近,只有lipA基因不同,其余幾個基因都一致,兩型均為從ST50分支進化而來,見表1。

表1 3株類鼻疽伯克霍爾德菌的MLST分型Tab.1 Multi locus sequence typing of three B. pseudomallei strains

2.3.3 耐藥基因攜帶情況 利用Resfinde軟件進行耐藥基因分析發現,此菌株攜帶β-內酰胺類抗生素耐藥基因blaOXA-59,不攜帶blaOXA-57,與黃靜敏等對廣東省分離株的耐藥基因分析結果一致[13]。

2.3.4 系統發育進化關系分析 構建本研究分離株與遺傳關系相近ST型代表株共54株類鼻疽菌的全基因組單核苷酸多態性系統發育關系(圖3)。這些菌株分離自1976-2022年,來自中國、澳大利亞、新加坡及泰國等國家和地區,宿主包括類鼻疽病人、環境以及動物等,共34個ST型。本研究中的 54 株菌SNP總數為61 794個。從圖上可見這些菌株分成3大簇,ST366共7株,我國分離株6株,美國分離株1株,紅色框中可看到此次分離株SX22_3027BPD與海南的3株ST366進化關系較近,與海南BP2016的ANI相似度值為99.88%,與BP155的相似度為99.74%,與GCA_015320315的相似度為99.95%,這4株菌的親緣關系較近,SNP總數為494個;而與美國1株從食蟹猴中分離的同為ST366的菌株進化關系較遠,位于不同的分支上。

注:系統進化樹從左到右的信息分別表示為菌株所在分支位置、菌株名稱、登錄號、MLST型、分離年份、分離地及菌株來源,左下角紅色框內為聚集成簇的6株ST366型菌株進化關系放大圖。圖3 基于全基因組單核苷酸多態性的類鼻疽伯克霍爾德菌系統發育關系Fig.3 Phylogenetic relationship of B. pseudomallei strains based on whole genome single nucleotide polymorphisms (wgSNPs)

3 討 論

類鼻疽伯克霍爾德菌是一種人獸共患的高致病性細菌,它主要存在于熱帶地區的土壤和水中[14-15],被該菌污染的泥土和水是類鼻疽的主要傳染源,農民、漁民等都是其主要易感人群,另外免疫功能低下者也容易感染類鼻疽伯克霍爾德菌[7]。該病例患者在海南旅游期間有疫區環境暴露史,且曾患有紫癜性腎炎,也是引起此次感染發生的重要易感因素。

類鼻疽發病的初期,患者可出現畏寒、發熱、頭痛、咳嗽、咳痰、胸痛、腹痛、尿頻、尿急、尿痛、骨關節疼痛等一系列非特異性表現,極易被誤診為其他疾病[16-17]。而本例患者剛開始時出現不明原因發熱,并且高燒持續不退而入院,患者入院后,醫生剛開始經驗性使用哌拉西林/他唑巴坦治療,病情有所好轉,但停藥后病情反復、加重,待血培養、細菌鑒定結果均提示可能為類鼻疽伯克霍爾德菌時,臨床專家給予靜脈滴注美羅培南等進行治療[18],病情便迅速得以控制,最后患者康復出院。

本研究中采用微生物質譜儀、API 20NE生化鑒定卡兩種方法同時對菌株進行種屬的鑒定。微生物質譜儀的使用極大提高了臨床對細菌的鑒定范圍和能力,但是它也存在鑒定的缺陷,其中泰國伯克霍爾德菌與類鼻疽伯克氏菌的指紋圖譜極其相似,易發生鑒定錯誤[19]。在此次病例的病原學診斷中,布魯克質譜儀就出現了該菌株首次鑒定錯誤。任何鑒定方法均有局限性,因此在懷疑鑒定結果時,可采用多種鑒定方法同時鑒定。

類鼻疽伯克霍爾德菌可在環境中持久存在,不同地理區域的特定環境分布、疾病臨床表現及發病率等方面均存在明顯差異,從而導致類鼻疽病的流行病學研究變得復雜。多位點序列分型(MLST)是分子流行病學研究中重要分子分型方法,可為研究細菌的遺傳多樣性及流行病學關聯提供證據支持。自2003年以來,MLST已廣泛應用于B.pseudomallei的分子流行病學研究[11]。Fang Y等[12]對中國102株B.pseudomallei的MLST進行分析發現,我國主要的ST型為ST46(12.7%)、ST50(10.8%)、ST58 (10.8%)、ST55 (5.9%)、ST70 (8.8%) 及 ST1095 (6.9%),與本研究MLST數據相類似,當時的41個型別,目前已達到94個ST型,表明我國類鼻疽伯克霍爾德菌具有很高的遺傳多樣性。此次分離株的與海南3株菌的ST型相同均為ST366,ST366與ST51、ST50遺傳相似度較高,而ST50為我國海南省常見的基因型[20-21]。ST型的一致性為此例海南省輸入山西省病例提供了分子流行病學證據。

2004 年,Holden等[22]首次對類鼻疽伯克霍爾德菌進行了全基因組測序,揭示了類鼻疽伯克霍爾德菌的基因組特征,隨后全基因組測序技術被全面運用于類鼻疽伯克霍爾德菌的研究。2017 年,Chewapreecha C等[23]通過對30 多個國家的 469 株類鼻疽伯克霍爾德菌全基因組進行研究,構建了全球類鼻疽伯克霍爾德菌系統發育關系,提示澳大利亞為該病原的源頭,然后傳播到東南亞的泰國、越南、馬來西亞和新加坡等國家。本研究也采用了全基因測序方法進行分析,結果提示病例分離株與海南省ST366型菌株(BP2016、BP155及GCA_015320315)的同源性較高,而與美國相同ST型菌株的相似度較低,也說明與基于7 個管家基因序列的 MLST分子分型方法相比,全基因組測序技術能精確有效的追溯全球各流行地區來源的類鼻疽伯克霍爾德菌株之間的潛在流行病學聯系。

近年來,隨著旅游業的不斷發展,世界范圍內輸入性類鼻疽病例的報道已屢見不鮮[24-27],已不再是單純的熱帶地區流行病,它可通過疫區暴露感染而發病。這不僅給全球醫療衛生應急工作提出了新的挑戰,同時也給類鼻疽診斷和研究提出了新的要求。本研究采用基因測序分析方法對分離的類鼻疽伯克霍爾德菌進行了分子溯源分析,結合流行病學調查,確定該病例為1例海南省輸入性類鼻疽病例。通過對該病例的研究報道,提示醫療機構及疾控部門應加強對類鼻疽的認識,了解該菌在山西省及全國的流行情況,提高診治和防控能力。

利益沖突：無