一種可視化檢測肼的苯并噁唑類熒光增強型探針

王漢林 鄭 漢 黃杰勛 黃衛東 楊龍元 李 武

(1湖北理工學院環境科學與工程學院，黃石 435003)

(2礦區環境污染控制與修復湖北省重點實驗室，黃石 435003)

(3湖北理工學院化學與化工學院，黃石 435003)

肼(N2H4)是一種有毒的物質，具有良好的水溶性、較強的堿性和還原性。作為一種重要的化工原料，它廣泛應用于染料、制藥和農業等領域[1-2]。然而，N2H4在生產、運輸、使用和處理的過程中的泄露或者不合理排放會對環境安全和人體健康造成重大威脅[3]。研究表明，N2H4通過呼吸或皮膚接觸等途徑被人體吸收后，會對人的腎、肝、肺和中樞神經系統等造成嚴重的損傷[4-6]。美國環境保護署(EPA)已將N2H4列為潛在的致癌物，規定它在飲用水中的最高容許濃度為0.31 μmol·L-1[7]。因此，迫切需要開發一種簡單方便、靈敏快捷的方法來檢測環境和生物樣品中N2H4的含量。

熒光探針技術目前已廣泛應用于檢測各種重金屬離子、農藥、有機或無機污染物等有毒有害物質[8-9]。該檢測方法簡便快捷，具有成本低、靈敏度和選擇性高、能原位實時監測等優點，受到了廣大科研人員越來越多的重視[10-11]。自2011年首次報道了第一例用于檢測N2H4的熒光探針以來，到目前為止已經開發了多種這類熒光探針[12-13]。它們絕大多數是熒光增強型的反應型探針，N2H4作為親核試劑，可與探針的識別基團發生環化、開環、基團轉化和脫保護等特異性反應[1,14]。然而，許多探針仍存在抗干擾能力差、響應慢等缺陷，難以在復雜環境中實現N2H4的檢測[7,13,15]。開發靈敏快捷、選擇性好的高性能熒光探針仍然是當前一項挑戰性的研究工作。

苯并噁唑類化合物具有優異的光物理和光化學性能，可用于構建檢測金屬離子或小分子的熒光探針[16-18]?；贕abriel 合成法，我們以鄰苯二甲酸酐等為原料，設計并合成了一種苯并噁唑類熒光增強型探針2-(2-(苯并[d]噁唑-2-基)苯基)異吲哚啉-1，3-二酮(HL2)，其合成路線如Scheme 1 所示。HL2 以苯并噁唑結構單元為熒光團，鄰苯二甲酰亞胺結構單元為識別位點，可實現對N2H4的選擇性識別。HL2 對N2H4表現出較高的靈敏度和選擇性，不僅能應用于水體樣品中N2H4的檢測，還可對HeLa 活細胞中的N2H4進行熒光成像。

Scheme 1 Synthesis of fluorescent probe HL2

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗所用試劑均為市售分析純。所用儀器包括XT4A型顯微熔點儀、Perkin-Elmer 2400元素分析儀、pHS-3C pH 計、Analytik jena Specord 210 紫外光譜儀、Varian-Cary-Eclipse 熒光光譜儀、Applied Biosystems API 2000 LC/MS/MS 質譜儀、Varian 640-IR 紅外光譜儀(KBr 壓片法)、Bruker 400 MHz 核磁共振波譜儀、Brucker APEX-ⅡCCD 單晶衍射儀、Leica DMI 3000B熒光倒置顯微鏡。

1.2 探針HL2的合成

2-(2-氨基苯基)苯并噁唑(1)按照文獻[17]的方法制備。先將鄰苯二甲酸酐(1.48 g，10 mmol)和1(1.05 g，5 mmol)溶于乙酸(30 mL)中，然后將反應混合物攪拌，并于120 ℃回流24 h。反應結束后，將反應液倒入500 mL 冰水中，用1.0 mol·L-1NaOH 水溶液將pH值調至8。抽濾，用蒸餾水洗滌濾餅(30 mL×3)，所得固體于80 ℃干燥12 h 后，再用硅膠柱分離(V石油醚∶V乙酸乙酯=10∶1)，產率為67.8%。m.p.165～167 ℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：7.10～7.28(m，4H)，7.43(d，J=8.0 Hz，1H)，7.58～7.62(m，2H)，7.73～7.78(m，2H)，7.90(d，J=8.0 Hz,2H),8.36(m,1H)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)：109.0，119.0，122.4，123.1，124.1，128.4，128.9，129.9，130.7，131.3，132.8，140.4，148.1,158.5,166.7。ESI-MS(m/z)：341.15[M+H]+。IR(KBr，cm-1)：1 717(s)，1 612(w)，1 496(m)，1 227(w)，733(m),707(w)。C21H12N2O3元素分析計算值(%)：C 74.11；H 3.55；N 8.23；實驗值(%)：C 74.32；H 3.79；N 8.01。

1.3 晶體的測定

選取大小為0.30 mm×0.20 mm×0.20 mm 的淺黃色HL2 晶體，置于Brucker APEX-ⅡCCD 單晶衍射儀上收集X 射線衍射數據，輻射源是石墨單色化的MoKα射線(λ=0.071 073 nm)，溫度為296.15 K，以ω-2θ方式掃描，在2.44°＜θ＜32.03°范圍內收集衍射點數據。全部衍射數據經Lp 因子和經驗吸收校正。晶體結構通過SHELXS-2014 采用直接法進行解析，部分非氫原子坐標在以后的數輪差值傅里葉合成中陸續確定。對所有非氫原子坐標及其溫度因子用全矩陣最小二乘法進行精修[19]。所有氫原子均為理論加氫并按跨式模型(riding model)精修，其溫度因子為其母原子溫度因子平均值的1.2倍～1.5倍。

CCDC：2268187。

1.4 光譜實驗

首先將HL2 配制成1 mmol·L-1的乙醇溶液，各種分析物(F-、Cl-、Br-、I-、SCN-、HSO3-、SO32-、N3-、NO3-、NO2-、NH3、NH2OH、CO(NH2)2、CH3NH2和N2H4)用二次蒸餾水配制成1 mmol·L-1的儲備溶液。測試前，將HL2 和各種分析物混合，然后用EtOH/Tris-HCl緩沖溶液(體積比1∶9，pH=7.4)稀釋至所需濃度。將混合溶液渦旋混勻2 min 后，在室溫下進行紫外光譜和熒光光譜測試(λex=352 nm，λem=445 nm，狹縫：10 nm/10 nm)。

1.5 水體樣品中N2H4的檢測

選取農夫山泉瓶裝礦泉水(中國杭州市)、自來水(黃石市自來水有限公司)和湖水(中國湖北省黃石市磁湖)3 種水樣進行N2H4檢測的回收實驗。3 種水樣在使用前都沒有過濾，直接以其代替熒光測試所用的蒸餾水。采用標準加入法測定3種水樣中不同濃度的N2H4溶液(4.00、8.00 和12.00 μmol·L-1)。測試前，將探針HL2 和加入N2H4的水體樣品渦旋混勻2 min，然后進行熒光光譜測試。

1.6 細胞毒性和熒光成像

在Tris-HCl 緩沖體系中，將事先培養好的HeLa細胞加入5 μmol·L-1的探針HL2 溶液(pH=7.4，VH2O∶VEtOH=9∶1)，于37 ℃分別恒溫培養12 和24 h，不加探針的細胞作為對照組，然后采用MTT 法測定細胞活力。

將探針HL2(5 μmol·L-1)加入到用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3 次后的HeLa 細胞中，于37 ℃恒溫孵育30 min 后，再用PBS 洗3 次以便除去HL2 溶液，然后進行細胞的熒光成像。進一步向上述含HL2 的細胞培養液中加入N2H4溶液(15 μmol·L-1)，在37℃恒溫培養30 min 后，用PBS 清洗3 次，再次進行細胞的熒光成像。

2 結果與討論

2.1 HL2的晶體結構

熒光探針HL2 是一種通過酸酐與有機胺(1)反應得到的酰胺類化合物。將探針HL2 溶解在丙酮中，然后于室溫下靜置2 d 后可得淺黃色的晶體。單晶X 射線衍射分析表明，HL2 的結晶屬于單斜晶系，空間群為C2/c(表1)。在HL2 晶體結構中，苯并噁唑環和相鄰的苯環幾乎共面，二者之間的二面角為5.99(2)°，鄰苯二甲酰亞胺環和它們之間的二面角分別為61.38(1)°和63.03(1)°(圖1)。C—N 鍵的鍵長范圍為0.129 2(2)～0.142 7(2)nm，且C2—N1(氨基)鍵長大于C15—N2(苯并噁唑)鍵長(表2)。鄰苯二甲酰亞胺環上的2 個羰基的C—O(C7—O1 和C8—O2)鍵長基本相等，但它們短于苯并噁唑環上的2 個C—O(C15—O3 和C17—O3)鍵長。C1—C2—N1 和C2—C1—C15 的鍵角分別為121.79(12)°和123.53(12)°，這導致探針HL2呈現V形結構。

表1 HL2的晶體學數據和結構參數Table 1 Crystal data and structure refinements of HL2

表2 HL2的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of HL2

圖1 HL2的橢球概率50%的晶體結構Fig.1 Crystal structure of HL2 with 50% ellipsoid probability

2.2 HL2對N2H4的響應

為了考察探針的選擇性，向10 μmol·L-1HL2 中加入30 μmol·L-1的各種分析物(F-、Cl-、Br-、I-、SCN-、HSO3-、SO32-、N3-、NO3-、NO2-、NH3、NH2OH、CO(NH2)2、CH3NH2和N2H4)，然后測試探針在發射波長(λem=445 nm)處的熒光強度(λex=352 nm)。如圖2所示，N2H4對HL2 表現出顯著的熒光增強效應，而其它分析物幾乎不會明顯改變HL2 的熒光強度，這表明HL2 有優異的選擇性識別N2H4的能力。紫外可見光譜顯示，向HL2(10 μmol·L-1)中加入N2H4(30 μmol·L-1)后，它的最大吸收波長基本沒有變化，但其吸收強度增強(圖3)。向HL2(10 μmol·L-1)與N2H4(30 μmol·L-1)的反應體系中加入各種干擾物(300 μmol·L-1)后，可發現HL2 對N2H4的熒光響應幾乎不受影響(圖4)。故HL2 對N2H4具有良好的選擇性和較強的抗干擾能力，可適合復雜環境中N2H4的檢測。

圖2 HL2對各種分析物的熒光響應Fig.2 Fluorescent response of HL2 to various analytes

圖3 HL2在加入N2H4前后的紫外可見光譜Fig.3 UV-Vis spectra of HL2 before and after addition of N2H4

圖4 在各種干擾物的存在下,HL2識別N2H4(30 μmol·L-1)的熒光響應Fig.4 Fluorescence response of HL2 to N2H4 in the presence of various interferents

進一步利用熒光滴定實驗測試了HL2 對N2H4的靈敏度(圖5a)。HL2 自身的熒光強度較弱，它的量子產率(Φ)為0.08。當向HL2(10 μmol·L-1)中逐漸加入3倍的N2H4后，它的熒光強度逐漸增大，直至達到穩定，此時反應體系的熒光強度增大了15 倍(Φ=0.69)。此外，在實驗中還發現HL2 的熒光強度與N2H4的濃度(0.1～25 μmol·L-1)之間存在良好的線性關系(y=103.61+115.96x，線性相關系數R2=0.987 5，圖5b)。HL2對N2H4的檢出限(3σ/k，σ指空白標準偏差，k是線性方程的斜率)為0.072 μmol·L-1，它遠低于EPA 規定的N2H4的閾限值(0.31 μmol·L-1)。因此，HL2 對N2H4有較高的靈敏度，可以用于定量檢測N2H4。

圖5 (a)滴加不同濃度的N2H4后HL2的熒光光譜;(b)HL2的熒光強度與N2H4濃度之間的線性關系Fig.5 (a)Fluorescence spectra of HL2 upon addition of N2H4 with various concentrations;(b)Linear relationship between the fluorescence intensity of HL2 and the concentration of N2H4

不同pH 值對HL2 的影響如圖6 所示。HL2 的熒光強度在pH=3～10 的范圍內幾乎保持穩定。當加入N2H4后，HL2 的熒光強度隨pH 值增大而逐漸增強，而在pH=5～10 的較寬范圍內，它的熒光強度趨于穩定?？紤]到環境和生物體系中的應用，選擇在生理pH(7.4)下進行所有光譜實驗的測試。HL2對N2H4的響應快速(圖7)。向HL2(10 μmol·L-1)中加入N2H4(30 μmol·L-1)后，反應體系的熒光強度隨著時間的延長逐漸增大，在2 min 后達到最大值，且熒光強度基本保持穩定，證實HL2 是一種快速檢測N2H4的熒光增強型探針。將此時的反應液用波長為365 nm 的紫外燈照射，可用肉眼觀察到加入N2H4前后HL2 溶液的熒光顏色由無色變為藍色(圖7 插圖)。這種明顯的顏色變化和熒光“關-開”響應，表明HL2可以實現對N2H4的可視化檢測。

圖6 在N2H4加入或不加入的條件下，不同pH值對HL2熒光強度的影響Fig.6 Effect of different pH values on the fluorescence intensity of HL2 with and without the addition of N2H4

圖7 HL2在加入N2H4后熒光強度隨時間的變化Fig.7 Time-dependent fluorescence intensity changes of HL2 with the addition of N2H4

2.3 HL2對N2H4的識別機理

為了探索HL2 對N2H4的可能識別機理，進行了核磁氫譜測試。與HL2 的核磁譜圖對比，當加入N2H4后，HL2 的鄰苯二甲酰亞胺基團在δ7.90～8.36處的質子信號消失，并且在δ6.18 處出現新的氨基峰(圖8)。此外，發現HL2與N2H4反應產物的核磁氫譜與化合物1 高度相似，說明HL2 的鄰苯二甲酰亞胺基團肼解后生成了1。這個結果也可通過紅外光譜進一步證實。如圖9 所示，比較HL2、1 和HL2 與N2H4的反應產物的紅外光譜，可發現HL2 在1 717 cm-1處顯示的是鄰苯二甲酰亞胺的羰基特征吸收峰，而在HL2 和N2H4的反應產物中，該峰的信號消失，卻在3 428 和3 323 cm-1處出現了2 個新的氨基吸收峰，并且該產物的紅外譜圖與1 基本相同?；谏鲜鼋Y果，推測了一種HL2 對N2H4的識別機理(Scheme 2)。HL2的鄰苯二甲酰亞胺基團被肼解后，釋放出含有氨基的化合物1，它會產生激發態分子內質子轉移(ESIPT)效應，從而導致了熒光的增強。這種機理也與以前報道的Gabriel 反應型熒光探針檢測N2H4的機理一致[20-21]。

圖8 HL2、HL2+N2H4和化合物1在DMSO-d6中的1H NMR譜圖Fig.81H NMR spectra of HL2,HL2+N2H4 and compound 1 in DMSO-d6

圖9 探針HL2、化合物1和HL2與N2H4反應產物的紅外光譜Fig.9 IR spectra of probe HL2,compound 1 and the product of HL2 and N2H4

Scheme 2 Possible reaction mechanism of probe HL2 and N2H4

2.4 水體樣品中N2H4的檢測

為了考察HL2 的實際應用價值，選取礦泉水、自來水和湖水進行N2H4的加標回收實驗。

向3 種待測水樣中加入不同濃度的N2H4溶液(0、4.00、8.00 和12.00 μmol·L-1)，通過熒光光譜檢測水樣中N2H4的濃度。如表3 所示，HL2 檢測不出礦泉水、自來水和湖水中的N2H4，而向這3個水體樣品中加入外源的N2H4后，N2H4的回收率在95.75%～104.25%之間，相對標準偏差(RSD)在1.27%～4.79%之間，這表明HL2 可定量檢測不同水體樣品中的N2H4，具有較好的準確度和精密度。

表3 不同水樣中N2H4的檢測Table 3 Detection of N2H4 in various water samples

2.5 HL2檢測細胞中的N2H4

首先，采用MTT 法在HeLa 細胞中對HL2 的細胞毒性進行了測試(圖10)。將HL2(5 μmol·L-1)在HeLa 細胞中分別孵育12 或24 h，發現HeLa 細胞的存活率仍保持在90%以上，這證實HL2(5 μmol·L-1)對HeLa細胞沒有明顯的毒性。其次，進一步研究了HL2在HeLa細胞中對N2H4的熒光成像。將5 μmol·L-1HL2 在HeLa 細胞中于37 ℃孵育30 min 后，沒有觀察到熒光信號(圖11A)。再向上述含HL2 的細胞培養液中加入15 μmol·L-1N2H4，繼續在37 ℃孵育30 min后，可發現HeLa細胞呈現出明顯的藍色熒光(圖11C)。同時，與之對應的亮場圖像沒有觀察到HeLa 細胞的凋亡現象(圖11B 和11D)，這說明HL2具有良好的細胞膜通透性，在檢測生物樣品中的N2H4方面有潛在應用。

圖10 與探針HL2共孵育12或24 h后HeLa細胞的存活率Fig.10 Cell viability of HeLa cells incubated with probeHL2 for 12 or 24 h

圖11 探針HL2孵育的HeLa細胞的熒光圖像Fig.11 Fluorescence images of HeLa cells incubated with probe HL2

3 結 論

合成了一種用于可視化檢測N2H4的苯并噁唑類熒光增強型探針HL2，它能在2 min內快速地識別N2H4，并伴隨著熒光顏色由無色變為藍色的明顯變化。HL2 對N2H4具有較高的選擇性和靈敏度，抗干擾能力強，它在各種水體樣品和HeLa 活細胞中對N2H4的檢測表明，HL2 在生物和環境方面具有潛在的應用價值。