Hib莢膜多糖在疫苗制備周期中的結構穩定性

張騰騰，秦春君，尹珊珊，劉翠，劉建凱，尹健，佟巍

1.北京民海生物科技有限公司，北京 102600；

2.江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122

b 型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzaetype b，Hib）是引起兒童侵襲性細菌感染的主要原因之一［1］。兒童感染后會引起腦膜炎、肺炎、敗血癥、化膿性關節炎、骨髓炎、心包炎、蜂窩織炎、會厭炎等疾?。?-3］。Hib的主要毒力因子為莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS），其基本單元為聚核糖基核糖醇磷酸酯（polyribosylribitol phosphate，PRP），具有較好的免疫原性，能在人體中誘導產生保護性抗體［4-5］。預防和控制Hib 傳染病的有效措施是接種Hib 疫苗［6-7］。由于多糖疫苗不能引發T 細胞依賴型免疫反應，在嬰幼兒中保護效果較差，現已被結合疫苗取代［8-9］。Hib 結合疫苗是將多糖PRP 與載體蛋白通過共價鍵連接，使其由非T 細胞依賴性抗原轉變成T 細胞依賴性抗原，從而激發細胞免疫，產生免疫記憶［7，10-11］。Hib莢膜多糖PRP重復單元的結構見圖1［12］。

圖1 Hib莢膜多糖PRP重復單元結構圖Fig.1 Structure diagram of Hib capsular polysaccharide PRP repeat unit

核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）技術是研究原子核對射頻輻射的吸收，類似紅外或紫外光譜，在適當的磁場條件下，樣品能夠吸收射頻區的電輻射，而且所吸收的輻射頻率取決于樣品特性，用吸收峰頻率對吸收峰強度繪圖構成NMR譜圖［13］。NMR是對各種有機物、無機物的成分或結構進行定性或定量分析的最有效工具之一，其在分析化學、生命科學、材料檢測等領域廣泛應用［14-18］。特別是2D NMR 的出現和發展，使NMR成為糖類物質結構解析的主要工具［19］。

結構是多糖活性的基礎，不同化學結構的多糖具有不同的生物活性，解析多糖的結構是揭示其構效關系的關鍵環節［20-21］。Hib 結合疫苗制備過程中存在劇烈的化學反應。為探討Hib 結合疫苗制備過程中PRP 的結構變化情況，本研究采用1H-NMR、13CNMR、31P-NMR及1H-1H COSY、1H-13C HSQC等2D-NMR技術，探討Hib PRP 在疫苗制備周期中的結構變化，以期評價Hib PRP在疫苗制備周期中的穩定性。

1 材料與方法

1.1菌株 Hib菌種源自常州市第二人民醫院3月齡重癥肺炎患兒，編號：MH200201［22］。本研究獲得江南大學醫學倫理委員會批準（JNU20020104IRB09）。

1.2主要試劑及儀器 胰蛋白胨購自美國Thermo Fisher公司；酵母浸出粉購自德國MERCK公司；破傷風類毒素購自北京民海生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨購自美國VWR Chemicals LLC；酪蛋白胨、氯化血紅素、輔酶、溴化氰、己二酰肼（ADH）、碳二亞胺、乙腈購自美國SIGMA-ALDRICH 公司；Sepharose 4 Fast Flow 購自美國Cytiva 公司；600 L 發酵罐購自上海高機生物工程有限公司；pH 計購自瑞士梅特勒托利多；層析系統購自美國GE公司；400 MHz核磁共振譜儀和DRX 600 MHz核磁共振波譜儀購自德國Bruker公司。

1.3Hib 精制多糖的制備 將Hib 菌種于35 ～38 ℃條件下培養14 ～20 h，傳2代后，于36 ～38 ℃條件下培養2 ～5 h，再傳2代，按A550為0.05 ～0.3時的接種密度接種至600 L發酵罐，控制pH為7 ～7.2、溫度為36 ～38 ℃，進行發酵培養，并適時補充500 g／L葡糖糖，6 h后停止發酵，加入1%甲醛溶液滅活。將滅活的發酵液（12 000 ～20 000）×g連續流去菌體后，采用十六烷基三甲基溴化銨沉淀收集復合多糖，再經乙醇、丙酮、苯酚進一步提取，得到Hib精制多糖。試驗重復2 次。獲得3 批（34-20011001、34-20011002、34-20031003）Hib 精制多糖。按照《中國藥典》三部（2020版）［23］要求進行相關檢測。

1.4Hib多糖衍生物的制備 參考尹珊珊［24］方法，使用氯化鈉溶液分別溶解34-20011001、34-20011002、34-20031003 批Hib 精制多糖，并調節pH 至10 ～11，按照（0.5 ～1.0）mg 溴化氰／mg 多糖的比例，加入溴化氰溶液，活化多糖；多糖活化后，再次調節pH 至8.5 ～9.5，按照3.5 mg ADH／mg 多糖的比例，加入ADH 溶液衍生多糖，使ADH 與多糖共價連接；用氯化鈉溶液從衍生后多糖溶液中置換出殘留溴化氰、ADH 等雜質，獲得Hib 多糖衍生物。試驗重復2 次。獲得3 批（34-20123038、34-20123041、34-20123044）Hib 多糖衍生物。按照《中國藥典》三部（2020 版）［23］要求進行相關檢測。

1.5Hib 多糖蛋白結合物的制備將Hib 多糖衍生物的pH 調節至5.7±0.3，參考孫曉東等［22］方法，按照破傷風類毒素∶多糖質量比為0.8∶1 ～1∶1，向多糖衍生物中加入破傷風類毒素。同時向上述反應體系中加入碳二亞胺至終濃度為20 ～60 mg／mL，并維持pH 為5.8±0.3，于2 ～8 ℃反應2 ～6 h，以便破傷風類毒素通過ADH 與多糖共價連接；結合物經氯化鈉溶液透析后，用Sepharose 4 Fast Flow 層析柱純化，流動相為氯化鈉溶液，監測波長為280 nm，收集V0附近洗脫液，獲得Hib多糖蛋白結合物。試驗重復2次。獲得3 批（34-20123038、34-20123041、34-20123044）Hib 多糖蛋白結合物，按照《中國藥典》三部（2020版）［23］要求進行相關檢測。

1.6核磁方法 參考QIN等［16］方法進行1H-NMR、31PNMR掃描；13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC、HMBC的參數設置見表1。

表1 NMR參數設置Tab.1 NMR parameter setting

2 結果

2.1Hib精制多糖的鑒定Hib精制多糖的各項檢查結果均符合標準要求，且3批精制多糖檢測結果基本一致，見表2。表明Hib精制多糖的制備工藝穩定性良好。

表2 Hib精制多糖鑒定結果Tab.2 Identification results of Hib capsular polysaccharides

3批Hib 精制多糖的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR譜圖具有良好的一致性，見圖2。表明3 批Hib 精制多糖品質良好且穩定，精制多糖制備工藝穩定。

圖2 3批Hib精制多糖的NMR譜圖Fig.2 NMR spectroscopy of three batches of Hib capsular polysaccharides

3批精制多糖的NMR譜圖均具有良好的一致性，因此選擇34-20011001 批精制多糖作為研究對象，其1H-NMR報告：δ=5.04、4.59、4.23、4.16、4.16、4.08、3.99 ～3.90、3.88 ～3.82、3.75、3.73 ～3.64、3.61、2.20、1.15 ppm，13C-NMR 報告：δ = 106.64、81.90、74.25、73.70、73.67、71.33、70.88、70.05、68.55、66.68、62.26、57.41、16.79 ppm，31P-NMR報告：δ=0.17 ppm。根據PRP的化學結構結合Hib精制多糖的1H-13C HSQC、1H-1H COSY 譜圖分析，可知1H-NMR 中3.61 ppm 附近為乙醇的亞甲基（-CH2）中H 信號，2.20 ppm 附近為丙酮的甲基（-CH3）中H 信號，1.15 ppm 附近為乙醇的甲基（-CH3）中H信號，其余均為Hib莢膜多糖相關H 信號；13C-NMR 圖譜中57.41 ppm 附近為乙醇的亞甲基（-CH2）中C 信號，16.79 ppm 附近為乙醇的甲基（-CH3）中C 信號，其余均為Hib 莢膜多糖相關C 信號；31P-NMR在0.17 ppm附近有磷酸酯中P信號。在1HNMR、13C-NMR、31P-NMR、1H-13C HSQC、1H-1H COSY譜圖中，將每個峰進行歸屬。見圖3。

圖3 Hib莢膜多糖的NMR譜圖Fig.3 NMR spectroscopy of Hib capsular polysaccharides

2.2Hib多糖衍生物的鑒定 Hib多糖衍生物各項檢測結果均符合標準要求，且3 批多糖衍生物檢測結果一致，見表3。表明Hib 多糖衍生物的制備工藝穩定性良好。

表3 多糖衍生物的鑒定結果Tab.3 Identification results of polysaccharide derivatives

3 批Hib 多糖衍生物的1H-NMR、13C-NMR、31PNMR 譜圖具有良好的一致性，見圖4。表明3 批Hib多糖衍生物品質良好且穩定，多糖衍生物的制備工藝穩定。

圖4 3批Hib多糖衍生物的NMR譜圖Fig.4 NMR spectroscopy of three batches of Hib polysaccharide derivatives

3 批Hib 多糖衍生物的NMR 譜圖均具有良好的一致性，因此選擇34-20123038 批多糖衍生物作為研究對象，在其1H-NMR 譜圖1.60、2.26 ppm 附近，發現與ADH 相關的H 信號；在13C-NMR 譜圖24.5、33.28、175.3 ppm 附近，發現ADH 的C 信號；同時在1H-13C HSQC、1H-1H COSY、HMBC 譜圖中，均發現了與ADH 相關的信號。見圖5。表明Hib 多糖衍生物已連接ADH。

圖5 Hib多糖衍生物的NMR譜圖Fig.5 NMR spectroscopy of Hib polysaccharide derivatives

2.3Hib多糖蛋白結合物的鑒定 Hib多糖蛋白結合物各項檢測結果均符合標準要求，且3 批多糖蛋白結合物檢測結果一致，見表4。表明Hib 多糖蛋白結合物的制備工藝穩定性良好。

表4 多糖蛋白結合物的鑒定結果Tab.4 Identification results of protein-conjugated polysaccharides

3 批Hib 多糖蛋白結合物的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR 譜圖具有良好的一致性，見圖6。表明3 批Hib多糖蛋白結合物品質良好且穩定，多糖蛋白結合物的制備工藝穩定。

圖6 3批Hib多糖蛋白結合物NMR譜圖Fig.6 NMR spectroscopy of three batches of protein-conjugated polysaccharides

3 批Hib 多糖蛋白結合物NMR 譜圖均具有良好的一致性，因此選擇34-20123038批多糖蛋白結合物作為研究對象，在其1H-NMR譜圖0.75 ～3.0 ppm處，有相應H信號，有別于Hib精制多糖和多糖衍生物1HNMR譜圖，推測為ADH和蛋白質上的相關H信號；在13C-NMR譜圖24.5、33.28、175.3 ppm附近，ADH相關C信號不明顯，可能是連接上載體蛋白后，ADH 相對含量較低導致未能體現在譜圖中；同時在1H-13C HSQC、1H-1H COSY 譜圖，發現與Hib 精制多糖相似的信號，表明Hib多糖已連接上了蛋白質。見圖7。

圖7 Hib多糖蛋白結合物的NMR譜圖Fig.7 NMR spectroscopy of Hib protein-conjugated polysaccharides

2.4PRP 結構的變化情況 為探討PRP 在疫苗制備全生命周期中結構的變化情況，將Hib 精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白結合物的1H-NMR、13C-NMR、31PNMR 譜圖分別進行疊加對比，可以看出除乙醇、丙酮、ADH相關信號峰的差異外，與PRP結構相關的信號峰基本一致，見圖8。表明PRP 結構在Hib 精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白結合物中的譜圖均未發生明顯變化。

圖8 Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白結合物的譜圖對比圖Fig.8 Comparison of spectroscopy of Hib capsular polysaccharides，derivatives and protein-conjugated polysaccharides

3 討論

Hib 莢膜多糖是由多個聚核糖基核糖醇磷酸酯重復單元組成，是Hib 結合疫苗中的免疫原［25］。結構是多糖活性的基礎［26］，研究多糖結構的變化情況有重要意義。Hib 結合疫苗制備過程中Hib 莢膜多糖經過化學反應（活化、衍生），再與載體蛋白進行偶聯，該過程中涉及劇烈的化學反應，Hib PRP 的結構是否發生變化是值得探討的問題。本研究依托Hib PRP 的基本結構，利用核磁譜圖進行解析，在1HNMR、13C-NMR、31P-NMR 譜圖中，將Hib PRP 基本單元中的H、C、P 一一歸屬，并與已報道的Hib 多糖1HNMR 譜圖［27］經對比基本一致。Hib 莢膜多糖的1HNMR、13C-NMR 譜圖中具有乙醇和丙酮相關信號，表明Hib 精制多糖中殘留一定的乙醇和丙酮，但在Hib多糖衍生物和多糖蛋白結合物的1H-NMR、13C-NMR譜圖中并未發現與乙醇和丙酮相關信號，表明后續工藝可顯著降低乙醇和丙酮的殘留水平。Hib 多糖衍生物的1H-NMR、13C-NMR 譜圖可明顯看出ADH 相關信號，表明已將ADH 連接至Hib 多糖上。而Hib多糖蛋白結合物1H-NMR 譜圖中的0.75 ～3.0 ppm處具有與蛋白相關的H 信號，但不能清晰歸屬；13CNMR 譜圖ADH 相關信號峰也未能在譜圖中很好體現，均與Hib 多糖衍生物連接上蛋白載體后，導致多糖和ADH相對濃度較低相關。

本研究通過NMR 技術研究Hib 莢膜多糖、多糖衍生物、結合物的結構，結果顯示，Hib莢膜多糖到多糖衍生物再到結合物，其基本結構并未發生變化，表明作為Hib 結合疫苗主要抗原的PRP 結構，在疫苗制備的全生命周期內，具有良好的穩定性，即Hib 結合疫苗主要抗原基本結構在疫苗制備周期內具有良好的穩定性。