骨肉瘤細胞生長的自分泌和旁分泌調節的研究進展

杜少文，劉翔 綜述，葉凱山 審校

蘭州大學第二醫院骨科甘肅省骨關節疾病重點實驗室，甘肅蘭州 730000

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種間充質來源的侵襲性骨樣生成腫瘤，其形成病因復雜且無法確定，因其細胞可產生骨樣基質而導致被稱為“日光爆發”模式的典型影像學表現［1］。OS常發生于兒童和青少年，好發部位在四肢長骨干骺端，其中一半以上的病例發生于膝關節周圍，具有進展快、預后差的特點。雖然目前的治療策略，如新輔助化療聯合手術對OS是有效的，患者的5 年生存率可提高至65%，但在過去的30年中，患者的生存率并未顯著提高［2］，而且大多數化療藥物均有嚴重的副作用，治療結果仍不佳，高死亡率和預后差也無明顯改善［3］。在過去的幾十年里，人們進行大量研究來證明與OS 細胞生長調節有關的因素，表明細胞因子（cytokine，CK）的復雜網絡是最重要的調節因素之一［4］。

CK 作為細胞間信使的小蛋白質，在免疫系統中發揮重要作用，并控制不同細胞類型的分化和生長［5］。CK由腫瘤細胞和腫瘤微環境通過自分泌及旁分泌途徑產生，作為惡性腫瘤演變發展的激活劑或介質發揮作用。在致癌過程中，CK 參與腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲以及血管生成。CK 不僅影響腫瘤的發展，其受體也與腫瘤密切相關。免疫系統在對抗惡性腫瘤中起至關重要的作用。個體CK 對免疫系統的影響取決于局部CK 濃度、特異性受體的表達和多種信號通路的激活［6］。腫瘤與免疫系統之間的相互作用以及腫瘤本身產生的CK 可導致癌癥患者體內高水平的CK，表明CK 可潛在地用作診斷生物標志物及預后評估［6-7］。目前，在OS中已發現多種與血管生成、腫瘤細胞增殖和轉移相關的CK 及其受體，其中部分CK與患者的預后及病程發展密切相關，如胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、趨化因子5（C-X-C motif chemokine ligand 5，CXCL5）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等，它們各自通過激活不同的信號通路來參與OS 的發生發展過程。因此，了解OS 細胞生長的自分泌和旁分泌CK 的調節非常重要，以便使用特定的免疫學、生物化學或生物技術工具來中斷該刺激過程，為OS 患者的診斷及治療提供策略。

本文對CK 的作用、作用方式及其與OS 細胞的生物學相關性作一綜述，以期為OS 的臨床治療提供有效的新標志物和治療靶點。

1 IGF-1

IGF-1屬于IGF家族成員，其基因位于第12號染色體，多肽鏈由70個氨基酸構成［8］，主要在人體組織器官的生長發育中發揮作用。IGF-1系統包括IGF-1、IGF結合蛋白和IGF-1受體（IGF-1R）［9］。

近年研究發現，IGF-1 及IGF-1R 的高度表達與致癌作用密切相關，有助于腫瘤細胞的存活、轉移及對化療藥物的耐藥性，且被認為是影響多種人類癌癥（包括卵巢癌）發展的危險因素［9］。大量臨床和基礎研究已證明，IGF-1也對骨腫瘤的演變發展起重要作用［9］。LI 等［9］、SERGI 等［10］、HU 等［11］、WANG 等［12］研究發現，OS 細胞中的IGF-1 主要來源于兩條途徑，即肝臟合成和OS 細胞、成骨細胞等自分泌、旁分泌產生，并作用于OS細胞，影響其演變發展。其他組織如大腦、肌肉等也可合成IGF-1，用于自分泌或旁分泌作用。OS 細胞中自分泌和旁分泌來源的IGF-1 對OS的影響主要是通過與IGF-1R結合而發揮作用［12］，但也有研究發現，其還可通過與胰島素受體（insulin receptor，IR）結合發揮同樣的作用［11］。IGF-1在OS中的作用機制是通過與IGF-1R結合，使IGF-1R自動磷酸化，激活PI3K／AKT 和Ras／MAPK 兩條信號通路。而PI3K／AKT 信號通路的激活與OS 的發病機制密切相關［13］，可抑制OS 細胞的凋亡，導致蛋白質的合成增強，從而促進OS 細胞的增殖和化療耐藥性［9，11-13］。Ras／MAPK 盡管在體內尚未發現與OS 相關，但與OS 細胞增殖和侵襲增加及上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）導致的轉移有關［14］。而且體外研究表明，IGF-1可將癌細胞從化療藥物誘導的凋亡中解救出來，其高表達與轉移表型相關［15］。JENTZSCH 等［16］通過組織微陣列發現局部IGF-1 的表達與侵襲性高的腫瘤類型和生存期有關。2015年，MANISCALCO 等［17］研究證實，IGF-1R 的過度表達與OS 患者手術分期和遠處轉移密切相關。IGF-1R的過表達也與OS中的腫瘤增殖、侵襲和遷移相關，其作用機制也是受體-配體相互作用啟動酪氨酸殘基的受體自動磷酸化，隨后激活多種信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號通路。

現代分子藥物療法的發展使某些腫瘤標志物得以被發現，近些年的研究嘗試采用IGF-1作為操作系統的診斷標記物，而靶向局部IGF-1途徑的新型藥物也許會提高治療的成功率［9］。WANG 等［18］研究發現，IGF-1R 是miR-503 的新靶向基因，可通過直接抑制IGF-1R來抑制OS U2OS細胞增殖和侵襲。CHIU等［19］通過分子模型、免疫沉淀、蛋白質印跡和酶聯免疫吸附試驗等表明，6-氟-2-（3-氟苯基）4-（氰基苯胺基）喹唑啉（HMJ-30）可選擇性地靶向IGF-1R 的ATP 結合位點，并抑制其下游PI3K／AKT和Ras／MAPK信號通路，下調基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase，MMP-2）和MMP-9 的表達，進而抑制OS U2OS 細胞的侵襲和遷移。ZHENG 等［20］研究表明，鉤端螺旋體素（leptocarpin，LTC）也能通過抑制IGF-1R 的表達來抑制OS 的增殖、遷移和侵襲。因此，miR-503可能是一個有前景的OS 治療靶點，可應用于OS 的基因治療，而HMJ-30 和LTC 可能是未來治療OS 的候選藥物。

2 TGF-β

TGF-β 是一種屬于跨膜受體家族的CK，該家族中有33 個成員，如TGF-β1、TGF-β2 等［21］。TGF-β 超家族幾乎參與了細胞活動的各個方面，對正常細胞和腫瘤細胞均有不同的作用，即生理條件下，參與血管生成的調節和細胞骨架、細胞外基質以及肌肉骨骼系統的構成。而近年來研究發現，TGF-β 與癌癥發生有關，被認為在腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲中起關鍵作用［22-23］。

TGF-β 是人類OS 進展過程中腫瘤微環境的一種豐富的CK。FRANCK等［24］研究發現，OS細胞或間質細胞分泌TGF-β 可有效地以自分泌和旁分泌方式調節微環境的表型和功能，即促進血管生成、骨重塑和細胞遷移，以及通過抑制免疫監視，在OS中發揮其原生功能。目前研究發現，TGF-β 在腫瘤形成過程中發揮雙重作用，即在腫瘤早期，TGF-β 作為抑制增殖因子，通過誘導細胞凋亡和阻礙細胞周期而發揮抑制腫瘤生長的作用；而在腫瘤后期，TGF-β 可促進腫瘤細胞的增殖［25］。

TGF-β 在OS 形成早期，通過誘導細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的分泌導致細胞凋亡，或降低細胞增殖驅動因子c-Myc 的表達而發揮腫瘤抑制作用［24］。其在OS 形成的晚期發揮腫瘤促進作用，即通過經典信號通路和非經典信號通路參與OS 細胞的增殖、遷移和侵襲。經典信號通路又稱Smads級聯反應：主要通過Smad蛋白傳遞，即TGF-β二聚體通過結合兩種不同膜細胞表面絲氨酸／蘇氨酸激酶受體（TβRⅠ／TβRⅡ受體），誘導兩個TβRⅠ受體和兩個TβRⅡ受體組裝成異四聚體復合物，其中TβRⅡ磷酸化并激活TβRⅠ受體，然后Smad3被TβRⅠ磷酸化和激活，激活的Smad3 從受體激活蛋白的Smad 錨中分離出來，并招募Smad4。酸化的Smad2／3 與Smad4形成復合物被轉運到細胞核中，與輔因子一起調節靶基因的表達，進而促進OS 細胞的增殖、轉移和侵襲［26］。非經典信號：TGF-β 信號通過激活絲裂原活化蛋白激酶和PI3K／AKT 信號通路，發揮腫瘤形成前期的抑制作用，從而抑制OS細胞的增殖［24］。

ZHOU 等［27］研究發現，TGF-β 表達越高，腫瘤壞死率越低，OS 患者越易產生化療耐藥性，導致預后不良。2019 年，ZHANG 等［21］通過實驗表明，雌激素受體β 過表達可通過下調TNG-β 信號通路來抑制細胞增殖、遷移和侵襲，阻斷細胞周期，促進凋亡和自噬。因此，成功阻斷TGF-β 信號，有望成為治療OS的一種新策略。雖然近年已研制出可阻斷TGF-β 信號的藥物，如可溶性TGF-β 受體或受體激酶抑制劑，但臨床試驗的效果并不理想［28］。而LAMORA 等［29］在體外實驗中發現，常山酮可抑制TGF-β／Smad3級聯和參與轉移擴散過程的TGF-β關鍵靶標如MMP-2的反應，進而減少原發性OS的發展和相關的肺轉移。因此，常山酮可能是一個有希望的治療策略，特別是針對肺轉移擴散的OS腫瘤進展。

3 CXCL5

CXCL5 是趨化因子CXC 亞家族的成員，基因定位于4 號染色體q13-q21 部位［30］，主要作用是引誘中性粒細胞促進新生血管的形成。其既能由免疫細胞、非免疫細胞分泌，也能由腫瘤細胞分泌［31］。

近年研究發現，腫瘤和基質細胞分泌的趨化因子可引誘腫瘤相關白細胞的表達和分布，觸發血管生成，促進腫瘤細胞的生長和遷移，而CXCL5被認為是促進人類腫瘤發展和進展的關鍵趨化因子［32］。CXCL5 作為體內外腫瘤血管生成的積極調節因子，通過與受體CXCR2 結合后，可誘導中性粒細胞的趨化性，促進血管生成，啟動細胞的修復和增殖功能，并提高細胞的活動能力，從而導致細胞發生轉移［33］。WANG等［34］的研究顯示，CXCL5在膀胱癌中上調，且CXCL5的高表達與膀胱癌患者的分期、惡性程度、淋巴結轉移和不良預后密切相關。目前，DANG等［35］通過實時定量聚合酶鏈反應和蛋白質印跡法發現，CXCL5 蛋白在OS 組織中的表達顯著增加，且主要以自分泌和旁分泌的方式調節OS的生長。DANG等又通過傷口愈合試驗和Transwell 試驗發現，OS 細胞遷移和侵襲也與CXCL5的高表達顯著相關。CXCL5對OS的調控機制主要是通過與其受體CXCR2結合，激活MAPK 信號通路途徑，癌細胞被吸引至轉移性部位，從而促進OS 細胞的轉移和侵襲［36］，且激活的MAPK 途徑與OS 預后差密切相關［37］。在以往的研究中發現，CXCL5 和受體CXCR2 形成的生物軸也可刺激腫瘤生長和血管生成，并促進宿主細胞的浸潤和活化［36］。此外，CUI 等［38］研究發現，CXCL5 與其受體結合，還可激活JNK 和p38 MAPK 通路來促進OS細胞的增殖。

LABELLE等［39］研究表明，CXCL5還通過CXCL5／CXCR2 軸以旁分泌的方式招募CD11b+MMP-9+Ly6g+粒細胞來促進早期轉移龕影的形成。在OS 治療方面，阻斷CXCL5／CXCR2 軸是抑制腫瘤細胞生長和提高治療敏感性的有效方法。另外，研究發現，SCH-527123 作為一種新型的選擇性CXCR2 拮抗劑，可通過阻斷MAPK 信號通路減少血運重建，進而延緩腫瘤進展［40］?；谶@些臨床前的研究結果，CXCL5／CXCR2軸和CXCR2可作為OS新的治療靶點。

4 IL-8

IL-8是CXC 趨化因子家族的成員，也稱CXCL8，基因定位于4號染色體q12-q13部位。IL-8既能由中心粒細胞、內皮細胞等產生，也可由腫瘤細胞分泌。其不僅參與炎性反應，也與血管生成的過程密切相關。目前已發現IL-8在一系列人類惡性腫瘤中過度表達，包括肺癌、胃癌和乳腺癌，因此，其可能是構成實體腫瘤發展的危險因素［41］。

研究表明，IL-8 參與了包括OS 在內的多種腫瘤的演變發展，其可能通過調節免疫反應和腫瘤細胞增殖，使腫瘤細胞遷移到內皮細胞，進而通過增加膠原酶活性，提高腫瘤細胞體積，從而影響腫瘤的發展［42］。CAMPBELL 等［43］的實驗結果顯示，OS 細胞和骨髓間充質干細胞均分泌IL-8作為自分泌和旁分泌因子，在OS 微環境中可刺激OS 細胞分泌的MMP-1和MMP-3 增多，從而促使腫瘤血管生成。KAWANO等［44］通過共培養實驗也發現，OS 細胞是利用自分泌和旁分泌機制釋放IL-8來促進自身生長。KAWANO等的研究顯示，IL-8 在OS 中調節其發展的機制是通過誘導FAK 和AKT 信號的激活來實現的，而且通過在共培養的細胞中加入抗IL-8 的中和抗體后，肺轉移的形成明顯減少［44-45］。IL-8 也可能有抑制晚期凋亡細胞誘導的抗腫瘤反應的作用，從而加重OS 的進展。JIANG 等［46］發現，IL-8 在OS 的免疫反應中表現出雙重性，即通過CXCL8-CXCR1／2 軸促進腫瘤抵抗和激活上皮-巨噬細胞轉變（epithelial macrophage transformation，EMT）。腫瘤源性IL-8 增加了中性粒細胞和髓源性抑制細胞的浸潤和募集，導致腫瘤微環境進入免疫激活狀態。此外，招募的腫瘤相關中性粒細胞還通過分泌炎性細胞因子和趨化因子促進適應性抗腫瘤免疫反應。

體外研究證明，在宮頸癌的異種移植模型中，阻斷IL-8 會出現明顯的抗腫瘤效果［47］。IL-8 是包括增殖、侵襲和遷移在內的許多重要致瘤表型的最重要因素之一。IL-8 的高表達還與OS 的預后差及對化療的耐藥性有關［48］。因此，IL-8 高表達的檢測可能為OS 的預防、診斷以及預后的判斷提供重要依據。

5 小結及展望

CK 作為細胞間的信使，在免疫系統中發揮重要作用，可通過刺激或抑制細胞應對一系列反應。腫瘤的發生發展與免疫系統密切相關，其中CK 發揮著不可或缺的作用，且在OS中也不例外。

OS 是一種危及生命的疾病，盡管現代多模式的化療、放療取得了效果，但由于轉移和局部復發的風險，OS 的治療效果仍不佳。因此，深入了解OS 的發病機制對于開發新的有效治療策略十分必要。多項研究已證明，OS 細胞及其微環境通過自分泌與旁分泌作用釋放多種CK，如IGF-1、TGF-β、CXCL5、IL-8等，在其發病機制中起著重要作用；通過體外實驗沉默CK 的表達，抑制IGF-1、TGF-β、CXCL5、IL-8等CK激活的信號通路，如PI3K／AKT、JNK、Ras／MAPK及FAK 等，證明可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移以及耐藥性［49-50］。而且，已有一種IGF-1R抑制劑R1507被用于一項隊列研究，即治療2歲及2歲以上復發或難治性OS（https：／／clinicaltrials.gov／ct2／show／study／NCT00642941），其結果尚未公布［9］。因此，探索CK激活的信號通路的功能及其與腫瘤發生發展的關系，可進一步了解CK 及其受體在OS 中的調節機制，最終研究設計CK 及其受體的抑制物，并通過靶向與其對應的信號通路阻斷其功能，從而為OS 發展的預測及治療干預提供新的思路。