藥物相關性頜骨骨壞死臨床前模型建立的研究進展

陶 璐 高 穎 楊柳青 黃晗丹 李昱伸 喻錦鈴 姚經經 劉志輝

雙膦酸鹽類藥物（bisphosphonates，BPs）是治療鈣代謝障礙的一線藥物，在臨床上被廣泛應用于治療患有骨腫瘤、骨質疏松癥、佩吉特氏?。≒aget's Disease）、急性高鈣血癥、多發性骨髓瘤等疾病的患者[1]。2003 年，Marx 學者[2]首次提出，有BPs 治療史的患者，在接受牙科手術后，出現頜骨暴露、感染、疼痛的癥狀，引起了廣大醫務工作者的關注。為了更好地規范疾病管理，2014 年美國口腔頜面外科醫師協會（american association of oral and maxillofacial surgeons，AAOMS）提議[3,4]，結合患者的病史及臨床檢查，將滿足以下條件并區別于其他形式的頜骨壞死，命名為“藥物相關性頜骨骨壞死”（medication-related osteonecrosis of the jaw，MRONJ）：①正在或曾經單獨使用過抗骨吸收劑（antiresorptive drugs，ARDs），或與免疫調節劑、抗血管生成劑（angiogenesis inhibitors，AgI）聯合治療；②頜面部持續存在8 周以上死骨暴露，或深達死骨的瘺管；③頜骨未經過放射治療且無明顯的頜骨轉移性疾病。

動物實驗是研究MRONJ發生機理的重要途徑，動物模型可以模擬MRONJ 的發生、發展全過程，探索致病機制，檢測防治措施的療效。目前，通常采用全身性危險因素（如給予BPs 等藥物），結合口腔局部危險因素的方法來誘導MRONJ的發生，建立標準化的體內實驗模型。但由于MRONJ 的發病率不高（＜5%）[5，6]，臨床前模型的建立具有一定的難度。理想的模型應能完全模擬人類MRONJ的臨床特征，包括頜骨壞死、感染和創口暴露等，但是目前的MRONJ 臨床前模型僅能模擬出部分病理生理學特征。本文從實驗動物種類、全身性因素及口腔局部因素誘導方法等方面，對近年發表的MRONJ體內模型的建立方法進行綜述，旨在為今后造模方法的選擇提供參考。

一、實驗動物

從2003 年至今，小型脊椎動物如大鼠（60%）、小鼠（27%）、稻鼠（2%）和兔（2%），及大型脊椎動物如犬（4%）、豬（3%）、綿羊（2%）等，已被運用于MRONJ 的研究[6]。筆者總結了近年來常見的MRONJ臨床前模型的建模方式（表1）?？梢姮F有建模手段多樣，動物種類、藥物種類、藥物劑量、給藥方式及局部誘導方式各有不同。

表1 已建立的MRONJ臨床前模型

1.小型脊椎動物：如大鼠、小鼠等是MRONJ 建模最常使用的動物[19]。它們具有易于飼養、實驗周期較短、成本低等普遍優勢。且實驗過程簡單，不需要復雜的實驗室設備及大量人力、物力資源。同時，較小體重的實驗動物需要的藥物量相對少，可以節約稀有或貴重試劑的使用量。

小鼠繁殖速度快，多見于基因工程的研究，有利于探索生物學機制[6]。但是，在長實驗周期內（全身藥物誘導+局部手術輔助誘導），大鼠較長的壽命比小鼠更有優勢。另外，近年來新開發的稻鼠MRONJ模型無需機械干預、僅通過飲食調整便可誘發全口或局部性牙周炎，是研究牙周炎與MRONJ相關性的新興得力新選擇[20]。但是，小型脊椎動物口腔較小，在一定程度上限制了復雜的口腔手術操作，血液、齦溝液等體液及頜骨、牙周組織、器官等組織的樣本收集量受到限制。同時，學者們普遍認為，鼠等嚙齒類動物與大型脊椎動物不同，它們缺乏哈弗氏系統，在實驗中不能完全模擬人類的皮質骨重塑[21]。且由于體型的限制，它們的藥物代謝率與人類相差較遠，使得藥物劑量的推算比較困難。因此，小型脊椎動物模型存在一定的局限性。

2.大型脊椎動物：如比格犬、迷你豬、綿羊等的頜骨和牙齒較大，在一定程度上類似于人類。比格犬是最早用于MRONJ研究的動物之一，但目前尚未建立牙源性感染模型。另外，迷你豬具有非季節性發情、雌激素缺乏相關的骨質流失等特性[22]，其骨轉換參數和口腔微生物種類與人類相似，是合適的MRONJ 實驗動物[21，23]。綿羊與人類的骨愈合能力相當，在骨重塑與骨質疏松癥的研究上具有一定潛力[24]。從人道主義出發，在實驗可選擇小型動物的情況下，應限制大型脊椎動物的使用。

二、全身性因素誘導法

1.藥物誘導：臨床前模型通過全身藥物誘導來模擬患者的用藥情況。其中，誘導途徑包括腹腔、靜脈、皮下或肌肉注射等。腹腔注射因操作簡單而被廣泛應用于嚙齒動物模型。靜脈注射是臨床上最常用的給藥方式。在建立動物模型時，靜脈注射精度要求高、操作難度更大，但能起到最高的生物利用度，模擬臨床情況、排除給藥途徑對實驗結果造成的影響。誘導藥物以BPs 和地諾單抗（denosumab,Dmab）為主，通常聯合地塞米松（dexamethasone,Dex）或環磷酰胺（cyclophosphamide, CY），增加對動物骨重塑的抑制作用，但動物模型中的用藥劑量尚未有統一的標準，為了在相對短的實驗期內實現最大化的藥物暴露，多傾向于應用癌癥患者的用藥劑量[25]。

雙膦酸鹽（BPs）：唑來膦酸（zoledronic acid,ZA）是臨床上藥效最強及最長的BPs，也是MRONJ建模中最常選擇的藥物[26]。多數動物模型按照人類治療骨腫瘤的ZA 劑量（4 mg/60 Kg）給藥。此外，Jabbour等[27]按照人類及其他物種之間等效表面積轉換因子，計算得到SD 大鼠的ZA 劑量為0.13 mg/kg/周，Dex 為3.8 mg/kg/周，按此劑量注射，有90%的大鼠在拔牙術后出現了明顯的骨暴露和炎癥創口。由于鼠類的藥物代謝率較快，還有部分研究選擇了骨質疏松劑量的100 倍（0.2 mg/kg）作為藥物劑量，從而確保陽性大鼠模型的成功建立[9]。

雖然與骨質疏松的治療劑量相比，腫瘤的治療劑量致病率更高，但是在動物模型中，MRONJ 的發病率并非與ZA 的劑量成正相關。Messer 等[28]發現，在接受0.02 mg/kg ZA 治療的稻鼠中，MRONJ 的患病率為38%，然而0.125 mg/kg ZA 的患病率僅為26%。這些數據表明，患病率可能具有平臺期，建模時不需過度加大用藥劑量。

地諾單抗（Dmab）：Dmab 通過抑制核因子kappa-B 配體的受體激活劑（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）與核因子-κB 受體激活劑（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）結合，抑制破骨細胞從破骨前體細胞分化的級聯反應，使得破骨細胞的存活率降低[29]。據報道，Dmab 相較于BPs 有更高的致病風險[30，31]。但是，Dmab 對動物RANKL 沒有親和力，其在動物模型中的應用是一項值得挑戰的研究。學者們認為，在研究動物骨骼中RANKL 的抑制作用時，可以用與Dmab 相似程度的抗體來替換Dmab[13]。目前相關的動物模型較少，僅見于MRONJ與破骨細胞抑制的相關性實驗中。Buranaphatthana 等[32]在裸鼠中使用10 mg/kg 劑量的抗小鼠RANKL 單克隆抗體來消耗破骨細胞，從而探究開發的iRANK 細胞與化學二聚化誘導劑（chemical inducer of dimerization，CID）治療對拔牙窩內破骨細胞的形成作用。Williams 等[33]對C57BL/6 小鼠尾靜脈注射0.25 mg 的抗小鼠RANKL 單克隆抗體，有50%發生了MRONJ，高于0.125 mg/kg 劑量的ZA 組（30%），他認為這是實驗組完全抑制破骨細胞生成，而ZA組僅部分抑制的原因。結合臨床上Dmab 更高的MRONJ 發病風險考慮，使用Dmab 治療的患者應提高警惕?？傊?，與傳統的ZA 藥物誘導相比，Dmab 在此方面的研究仍舊空缺，期待更多學者的進一步探討。

其他：ARDs相關的骨壞死已經在臨床前模型中得到了廣泛的研究，但是有關AgI 的研究卻很有限，大多來自于病例報告和病例系列研究等。一般情況下，腫瘤患者會接受ARDs 及AgI 的聯合治療，研究者們很難單獨分析AgI 與MRONJ 的關系，這促使研究者們將目光轉向AgI 相關的動物模型上。已知，抗血管內皮生長因子A（antivascular endothelial growth factor A，VEGFA）單克隆抗體會緩解ZA 與環磷酰胺治療的小鼠骨組織傷口愈合，但不會延緩軟組織愈合[34]。在Messer 等[20]的研究中，與ZA 治療誘發MRONJ 的稻鼠不同，給予抗VEGFA 單克隆抗體治療的稻鼠沒有發生MRONJ，而是在上、下頜骨中產生廣泛的炎癥反應，誘發破壞性的牙周炎，驗證了先前的發現，對MRONJ的病因及病理生理學研究有重要意義。由于現有的研究樣本量小、實驗設計不夠全面，AgI臨床前模型能提供的指導意義有限。

Sakkas 等[35]報告一位使用托珠單抗（Tocilizumab）的患者，在拔牙后發生了MRONJ。同時，一些臨床實踐指南指出，Tocilizumab可降低新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）重癥患者的死亡率，不少醫院已經將其作為COVID-19 的治療選擇[36～38]。這提示在COVID-19大流行的背景下，應該注意Tocilizumab與MRONJ的相關性，它有望成為新的輔助建模藥物。

2.藥物誘導聯合卵巢摘除術：已有不少研究通過卵巢摘除術來建立雌性動物骨質疏松模型[39]。在此基礎上，學者們結合全身ARDs 治療及口腔局部誘導，創建出基于骨質疏松的MRONJ 臨床前模型，從而探討骨質疏松癥治療劑量的ARDs 與MRONJ發生、發展的關系[10]。值得注意的是，Kubek[40]發現C3H 小鼠在卵巢摘除術后，下頜骨也出現了皮質骨重塑。這一發現彌補了嚙齒類動物缺乏哈弗氏系統的不足，使得臨床前模型的建立又多了一種選擇。

三、口腔局部因素誘導法

服用藥物的患者，通常在拔牙、種植等口腔侵入性操作后誘發MRONJ。因此，口腔局部因素的誘導對于動物模型的建立是必不可少的。

1.拔牙誘導法：拔牙已被認為是最重要的獨立危險因素[2，3，42]。全身藥物誘導結合牙拔除術在建模中也是最多見的組合。對于比格犬、迷你豬等大型脊椎動物，可使用牙鉗或高速渦輪手機分冠后，再分別拔除牙根。但是，嚙齒動物牙冠短小、牙根細長，普通拔牙器械無法夾持。Yu 等[43]使用尖銳的牙科探針楔入小鼠磨牙的根分叉，通過左右搖晃引導牙齒脫位。此外，拔牙過程中牙根的折斷時有發生。有研究者將無法取出的斷根保留在迷你豬的頜骨中[17，21]。但是Aguirre 等[6]認為，斷根可能會導致實驗結果受到影響，建議排除來自斷根動物的數據。

由于下頜骨骨質致密、血管分布較少，MRONJ多發生于下頜[44,45]。所以對于比格犬、迷你豬等大型脊椎動物而言，多傾向于選擇拔除下頜磨牙[6]。而嚙齒類動物口腔較小，拔除下頜磨牙還需考慮舌頭的阻擋，如果拔除上頜磨牙，操作時開闊的視野會大大降低手術難度，做到微創拔牙的同時還能減少牙根折斷的可能性，有利于動物恢復攝食能力。

2.牙源性感染誘導法：在拔牙誘導模型中，通常拔除的是健康的牙齒，這可能無法完全模擬臨床情況。有學者認為，部分MRONJ 的發生，是由病灶牙的慢性感染通過拔牙部位擴散而引起，并非拔牙本身所致[46]。此外，近期調查發現，牙源性炎癥也可誘導MRONJ的發生[47]。為了解釋牙源性炎癥在MRONJ病理生理學中的致病作用，相應的感染模型被創建出來。拔除感染性牙齒的改良方法可呈現出更明顯的MRONJ樣病變，更接近臨床實踐中遇到的病變。

牙周炎誘導模型：Kim 等[48]在小鼠牙頸部放置了3 周的結扎絲以誘導牙周炎，與單獨拔牙組相比，拔除具有牙周炎的牙齒會進一步增強骨壞死。移出結扎絲2 周后，牙齦的腫脹程度可見顯著消退。由此說明病理性炎癥狀況會加劇MRONJ的發展，而炎癥消退可改善癥狀。Gkouveris 等[49]在結扎1、2、4 周的小鼠觀察到ZA 組與RANKL 抑制劑組結果相似，結扎區周圍有炎癥浸潤，總血管面積顯著減少，缺氧誘導因子1-α（HIF-1α）增加，而新血管生成與炎癥反應相關的信號級聯減弱，展示了疾病的早期階段向最終骨暴露的病理生理變化過程。這些動物模型無需拔牙，在避免破壞軟組織完整性的同時，還能讓黏膜和骨愈合的環境復雜化，從而允許研究MRONJ發生發展過程中的病理生理改變。

給稻鼠喂食高蔗糖酪蛋白飲食，可以在上下頜誘發全口牙周炎；而喂食標準嚙齒動物食物，則可在上頜第二、三磨牙之間誘導出局部性牙周炎[20，28]。一般來說，實驗室動物建模面臨的挑戰是如何誘導出牙周炎所致的MRONJ模型，而天生易患牙周炎的稻鼠面臨的問題則是如何建立陰性模型。Castillo等[14]通過定期牙周維護、清潔齦溝內的食物殘渣，以及用高水平的可溶性纖維代替標準嚙齒動物食物中的不溶性纖維，從而控制了稻鼠局部牙周炎的發生，為消除稻鼠發生MRONJ 的口腔局部危險因素提供了新的方法。

根尖周病變誘導模型：一些病例報告提及MRONJ 由保守治療的根尖周病變的病灶牙引發[50]。但其作為MRONJ危險因素的證據有限，需要動物模型進一步評估。Rao 等[41]給C57BL/6N 小鼠給予ZA后使用球鉆鉆開磨牙牙冠，從咬合面暴露牙髓組織，用小鼠自身的口腔菌群污染根管，以誘導根尖周病變。ZA 治療雖然減少了根尖周疾病引起的牙槽骨吸收，但是卻顯著增加了骨細胞壞死、MRONJ 的發生幾率。有研究指出，小鼠口腔內的本地共生菌群不會導致MRONJ 的發生，相反，長期使用廣譜抗生素減少共生菌群的數量卻可促進MRONJ 的發展[51]。另外，持續ZA 治療可加劇大鼠根尖周炎癥，使頜骨血液供應減少、無骨重塑并出現壞死區[52]。還有研究并未誘導根尖周病變，而是利用動物自身的自發性根尖周疾病進行實驗。結果提示，經ZA 組與RANKL 抑制劑處理的動物，拔除根尖周病變的牙齒與拔除健康牙相比，病灶牙的拔牙窩暴露、骨愈合能力減弱，HE染色顯示出更多的空骨細胞腔隙和骨壞死區域[53]。盡管如此，如今根尖周病變動物模型研究有限，其對MRONJ的影響尚未得到明確解釋。

3.種植手術誘導法：種植手術被認為是MRONJ 的潛在局部危險因素[54，55]。大多數關于種植體周圍骨骼重塑的動物研究都是使用脛骨或股骨等長骨進行的?？深M骨的生理特點及生長發育與其他骨骼不同，其轉換率是長骨的10 倍，針對長骨的研究可能無法準確反映BPs對頜骨重塑的影響。臨床方面的需求促使研究者們繼續開發和改進動物模型，開始利用頜骨建立種植體模型。

Park 等[56]在對大鼠上頜第一磨牙即刻種植4 周后，皮下注射BPs，觀察到BPs 組骨組織空腔隙數量隨著注射時間的推移而顯著增加，證實BPs 治療可導致種植體周圍骨重塑被抑制。Park等[10]在植入種植體后給予甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH），從而探究PTH 對負載BPs的上頜骨植入物周圍骨骼重塑的刺激作用，是否可以逆轉BPs 對骨骼的惡化效應。但是，由于目前的種植模型仍存在較大局限性，該類MORONJ 種植體植入動物模型的實驗結果還可能需要更大的樣本量及更長的給藥時間來證實。探究觸發MRONJ的機制。此外，頜骨對機械負荷水平敏感，在進一步研究中，應考慮在植入物和周圍骨組織上施加咬合負荷，以模擬患者的口腔狀況。