許氏平(Sebastes schlegelii)TRAF 基因的鑒定及其響應殺魚愛德華氏菌侵染的表達模式研究*

劉顯通 王寧寧 吳瑞雪 李 超 曹 敏

(青島農業大學海洋科學與工程學院 山東青島 266109)

腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)和腫瘤壞死因子受體超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF)成員參與了多種先天性和適應性免疫過程, 對細胞增殖、發育、死亡、存活、免疫和各種疾病起到調節作用(Locksleyetal, 2001; Colletteetal, 2003)。通常,TNFSF 配體通過結合TNFSF 同源結構域(THD)和TNFRSF 的富半胱氨酸結構域(CRDs)與TNFRSF 通信, 從而介導免疫相關信號通路和其他發育過程(Bodmeretal, 2002)?；罨腡NFRSF 可以通過腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor associated factors, TRAF)在胞內進行信號傳導(Haet al, 2009)。TRAF 是一種兼具重要性和特殊性的胞內轉導通路分子, 可以通過與下游信號分子結合, 激活NF-κB 信號通路, 介導免疫和炎癥反應。TRAF 作為一種有凝聚性的銜接蛋白, 其作用可分為兩個方面:一方面, 通過TRAF 同源域與受體接受外界刺激; 另一方面, 通過N-端指環/鋅指結構與其他蛋白質分子或DNA 結合, 依靠這兩種途徑, 產生一個較為復雜的下端傳遞信號(李影等, 2015)。

大多數TRAFs 成員都含有這樣兩種結構, N-末端指環狀結構域和數目不等的鋅指, C-末端TRAF 結構域是由卷曲螺旋TRAF-N 和TRAF-C 結構域構成,后者是保守的, 這兩個結構域的主要功能是維持蛋白質的構象, 對維持其穩定性起到了重要作用。它們都具有特殊的蛋白質結構, 可以幫助識別和結合受體, 并參與細胞因子的分泌、信號轉導、細胞增殖、凋亡等生理過程(Chenetal, 2013)。在哺乳動物中,TRAF 分子的N 端, 都含有1 個指環結構域, 并且都含有5～7 個鋅指結構域(H?ckeretal, 2011)。需要指出的是, 指環狀結構可以介導DNA-蛋白質和蛋白質-蛋白質這兩種形式的轉換。研究表明, 除了具備介導功能外, 指環狀結構還可以參與到TRAFs 的蛋白酶體依賴的降解過程(Chapardetal, 2012)。其中, TRAF1結構是7 種TRAFs 家族中最為獨特的, 它不僅沒有上述提到過的TRAF 結構N-末端的指環結構域, 也沒有鋅指結構(Zottietal, 2012)。TRAF2 的特點是其結構域中含有 2 個亞結構域, 分別是 TRAF-N 和TRAF-C (Songetal, 2011)。TRAF2 作為一種多功能分子, 可以激活 NF-κB 誘導激酶(NF-κB inducing kinase, NIK)和 c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)信號途徑(Cabal-Hierroetal, 2014)。其中,NIK 是一種可以通過磷酸化和去磷酸化激活NF-κB信號通路的蛋白質激酶; 而JNK 則是一種可以通過磷酸化和去磷酸化激活c-Jun 信號通路的蛋白質激酶。TRAF3 的功能是TRAF 家族中最豐富的。前期研究發現, TRAF3 不但可以對NF-κB 和MAPK 這兩種信號通路進行負性調控, 還可以對Ⅰ型干擾素進行正性調控, 從而發揮抗病毒的作用(Muroetal,2014)。TRAF4 是家族中唯一可以通過核定位的蛋白,這是區別于其他TRAF 家族成員的最大特征(Yoonet al, 2014)。TRAF5 的特征是表達范圍比較廣, 在肺、脾、胸腺、腎等器官中表達。與其他成員不同的是,TRAF6 在與受體結合時表現出特異性, 可以與白介素-1 受體相關激酶、核因子κB 受體激動劑、CD40這種信號分子直接結合(Liuetal, 2012)。TRAF7 的形式比較特殊, 分為長型和短型。長型就是普通的TRAF7, 它可以編碼的氨基酸蛋白數多達670 個。短型則被定名為TRAFs (Fuetal, 2011)。因此, 對TRAF結構和功能的了解, 有助于明確TRAF 與下游信號分子結合, 激活下游信號通路的分子機制。

在硬骨魚中, 對于TRAF 的報道較少, 僅在少數物種的先天免疫中發揮作用。前期研究證明TRAF2,TRAF3和TRAF6可能還參與了先天免疫系統的抗細胞凋亡途徑(Manion, 2012)。例如, 在青魚(Mylopharyngodonpiceus)中,TRAF2可上調MAVS 介導的EPC 細胞中的IFN 信號傳導和抗病毒活性(Chenetal, 2017)。研究表明,TRAF3可以通過多種信號通路的介導, 參與多種抗病毒信號通路。在花鱸(Lateolabraxjaponicas)中,TRAF3與抵抗RGNNV 感染的先天免疫反應有關, 并可能通過RLR 信號通路介導的IFN 反應發揮其抗病毒活性(Zhangetal, 2018)。TRAF3還可以調節黃酸誘導基因I (RIG-I)和干擾素基因刺激因子(STING)基因的表達, 從而增強機體對病毒的防御能力(Fengetal,2011; Wangetal, 2018)。凌露露等克隆獲得了日本鰻鱺(Anguillajaponica)TRAF3, 發現poly(I:C)和遲緩愛德華氏菌刺激可顯著增強AjTRAF3的表達水平且利用免疫熒光和免疫共沉淀等方法證實了AjTRAF3通過其MATH 結構域結合位于線粒體上的MAVS, 從而調控由RLR 介導的Ⅰ型IFN 抗病毒免疫應答(凌露露等, 2023)。同樣,TRAF6還在魚類天然免疫應答中起著重要的調控作用(Phelanetal, 2005)。此外, 虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中的TRAF6可以負調控LPS 誘導的p38MAPK 和JNK 的磷酸化(Jangetal, 2019)。相比在哺乳動物中的研究, 目前對魚類中TRAF的相關研究較少。因此解析魚類中TRAF的類型、結構和響應病原菌刺激后的表達模式的研究, 有助于了解魚類中TRAF基因與哺乳動物中的差異, 并且有助于后續魚類中TRAF介導信號通路的研究, 對于進一步了解魚類中TRAF的免疫應答機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及飼養條件

1.2 許氏平TRAF 基因的全基因組鑒定

本項目利用NCBI 全基因組信息(物種包含人類、鼠和多種硬骨魚), 在NCBI 全基因組范圍內搜索, 下載TRAF基因序列, 構建BLAST 全序列比對數據庫,通過對許氏平全基因組序列的分析, 將其與數據庫中的數據進行比較, 最終確定了TRAF基因的候選基因。隨后用hmmer 搜索程序, 對許氏平的全基因進行了初步篩選, 并對其中包含TRAF重復區域和TRAF功能域的基因進行了確定, 并將部分不包含該功能域的基因進行了初步篩選。在使用hmmer 搜索程序后, 我們發現了一些具許氏平的TRAF基因。通過對hmmer 和blast 的搜索結果的整合, 得到了關于許氏平TRAF家族成員的基因信息。

1.3 許氏平TRAF 基因特征分析

1.4 許氏平TRAF 基因共線性分析

1.5 許氏平TRAF 基因的系統發育分析

為了建立TRAF基因在不同種類間的親緣關系。首先, 利用MUSCLE 算法, 將獲得的TRAF序列進行多個序列的比較, 進而構建出一個數據豐富的大樣本(Edgar, 2004)。采用ProtTest (Abascaletal, 2005)方法, 通過對TRAF基因進行了進化分析, 篩選出最合適TRAF基因的模型。使用BEAST v.2.2 軟件重建了系統發育樹, 選用G+I+T 最優化模型, 不變位點比例選定為0.32, Gamma shape 參數選定為0.56, 四個線程在同一時間內運行10 000 000 代。最后選用進化樹可視化軟件iTOL (http://itol.embl.de/)對系統進化樹進行調整。

1.6 TRAF 家族基因的蛋白質相互作用網絡預測及表達模式分析

1.7 殺魚愛德華氏菌攻毒及實時熒光定量實驗

2 結果與討論

2.1 許氏平TRAF 基因的鑒定與表征

整合Pfam 數據庫中TRAF 保守結構域和BLAST結果, 在許氏平中共鑒定出9 個TRAF基因, 分別命名為TRAF5、TRAF4.1、TRAF4.2、TRAF2.1、TRAF2.2、TRAF3.1、TRAF2.3、TRAF6、TRAF3.2。這些TRAF基因的 mRNA 長度范圍為 231 bp(TRAF4.1)到 1 794 bp (TRAF2.1)不等。與此同時,TRAF 蛋白的長度范圍為76 bp (TRAF4.1)至597 bp(TRAF2.1)之間。其中, TRAF2.1 的分子量最大(67.04 kDa), 其次為TRAF3.1 (66.93 kDa)和TRAF3.2(66.23 kDa), 而TRAF4.1 (8.73 kDa)的相對分子質量最小。結果顯示, 所有基因的pI 值范圍均在5.96～8.39之間。在亞細胞定位的統計分析中, 有7 個基因定位于細胞核內。除此之外, 我們發現TRAF4.1定位于細胞質,TRAF3.2定位于線粒體(表1)。

表1 9 個TRAF 基因的特征Tab.1 Characterization of the 9 TRAF genes

2.2 許氏平TRAF 基因的蛋白質結構域分析

在此次預測結果中, 除了發現TRAF4.1和TRAF4.2外, 其他基因都含有RING 結構域。同時, RING 在不同基因中的相對位置也是有區別的。TRAF3.1、TRAF3.2、TRAF5、TRAF6、TRAF4.2、TRAF2.2、TRAF2.3、TRAF2.1各有一個MATH 結構域。與典型的TRAF蛋白結構域相比, 在TRAF4.1中沒有發現RING 結構域和MATH 結構域。而在TRAF4.2中沒有發現RING 結構域(圖1)。

圖1 TRAF 基因的蛋白質結構域Fig.1 Protein domain structure of the TRAF gene

2.3 許氏平TRAF 基因的基因結構

9 個TRAF基因中, 有4 個(TRAF2.1、TRAF3.1、TRAF3.2、TRAF2.3)含有5'UTR 區域和3'UTR 區域,推測它們是全長基因(圖2)。在TRAF6、TRAF4.1、TRAF4.2中沒有發現UTR 區域, 而TRAF2.2和TRAF5只發現3′UTR 區域, 未發現5′UTR 區域。通過對其外顯子和內含子進行了分析和比較, 進一步對這些TRAF基因的結構多樣性進行了研究。研究結果表明,TRAF3.1和TRAF3.2的內含子/外顯子數量最多, 分別有14 個外顯子和13 個內含子(圖2, 其中黃色框表示CDs 區域, 藍色框表示UTR 區域, 黑線表示內含子), 其余的TRAF基因都有2 個以上外顯子。同時,基因功能結構域顯示除TRAF4.1和TRAF4.2外, 其余基因大多均有Zf-TRAF superfamily 和TRAF_BIRC3_bd 結構域(圖3)。

圖2 許氏平中TRAF 基因的基因結構Fig.2 Gene structure of the TRAF gene in S. schlegelii

圖3 許氏平中TRAF 基因結構域Fig.3 TRAF gene domain in S. schlegelii

2.4 許氏平TRAF 基因共線性分析

為了更好地認識TRAF基因的特點, 我們采用共線性分析方法對許氏平與其他硬骨魚類的TRAF基因進行了標膠分析(圖4)。提取了來自許氏平、斑馬魚、尼羅羅非魚、斑點叉尾、大菱鲆和紅鰭東方的TRAF基因及其上下游的鄰位基因。特別的, 許氏平中的9 個TRAF基因在其他魚類中只部分存在。TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF6基因在上述幾種硬骨魚中均有發現(圖4a)。我們發現在許氏平、斑馬魚、尼羅羅非魚和斑點叉尾中,TRAF均存在多拷貝現象。對在許氏平中的TRAF2.1共線性模塊分析結果中發現, 含上下游基因包括IL6、LIFR、MAST4、PIPNA3、TENN、GRM2B、ZN703、NP-C2、TIA1、EGF7, 與其他物種中TRAF的共線性存在差異。同樣的差異也發現在TRAF2.3中, 但是TRAF2.2在許氏平、斑馬魚、斑點叉尾和大菱鲆中較為保守。與TRAF2相比, 許氏平中TRAF3的共線基因模塊與斑馬魚和斑點叉尾較為相似(圖 4b)。而TRAF4在許氏平、尼羅羅非魚、斑馬魚、紅鰭東方和大菱鲆中的共線性較為接近(圖4c)。我們還發現TRAF5在許氏平、斑馬魚、大黃魚(Larimichthys crocea)和斑點叉尾等物種中具有較高的保守性。MARK1和RCOR3作為TRAF5的兩個鄰位基因, 它們在多個物種中具有相同的序列, 而在許氏平中,TRAF5的相鄰基因和尼羅羅非魚類似(圖4d)。此外,我們發現在許氏平、斑馬魚、尼羅羅非魚中,TRAF6的共線性序列比較保守(圖4e)。

圖4 TRAF 共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of TRAF

2.5 TRAF 基因的系統發育分析

圖5 TRAF 進化樹Fig.5 The TRAF evolutionary tree

2.6 TRAF 基因的PPI 網絡分析

通過PPI 網絡分析, 得到TRAF (TRAF2.2、TRAF2.1、TRAF6、TRAF5、TRAF3.1、TRAF3.2、TRAF4.1、TRAF2.3、TRAF4.2)與其互作蛋白的關聯狀況。如圖6, fadd、tradd、birc2 均顯示出與TRAF具有高度關聯性, 并且在所有TRAF 亞家族的整個PPI 網絡中都發現了map3k14 中樞節點。此外, 預測結果也證明了TRAF 與TNFRSF 存在互作關系(圖6)。

圖6 許氏平中TRAF 互作蛋白的預測分析Fig.6 Predictive analysis of interacting proteins of TRAF in S. schlegelii

2.7 殺魚愛德華氏菌感染許氏平后TRAF 基因在其腸道中的表達模式

圖7 殺魚愛德華氏菌感染后不同時間點許氏平腸道組織中TRAF 基因表達變化Fig.7 Expression changes of TRAF in the intestinal tissues of S. schlegelii at different time points following infection by E. piscicida

3 討論

腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)是TNF 受體超家族和白細胞介素-1 受體/Toll 樣受體超家族的主要信號轉導子, 調節各種細胞活性和先天免疫反應(Wangetal, 2015)。在本研究中, 我們通過整合Pfam數據庫中TRAF保守區域和BLAST 結果, 在許氏平中鑒定出9 個TRAF基因, 發現部分TRAF家族成員存在多個拷貝, 然后獲取了各家族基因的蛋白分子量、等電點以及在染色體上的位置等基本信息。并且通過系統的生物信息學分析了它們的基因結構、功能結構域、共線性排列, 蛋白互作網絡以及系統進化關系, 發現它們在結構和功能上是比較保守的。在許氏平中共鑒定到9 個TRAF基因, 與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco) (8 個) (Nieetal,2022)、大菱鲆(8 個) (Zhouetal, 2023)、半滑舌鰨(7個) (Lietal, 2020)等其他硬骨魚中的數目類似。以前的研究證實大多數硬骨魚缺乏TRAF1或TRAF5基因,并且TRAF1基因的缺失比TRAF5基因的缺失更為普遍, 這表明TRAF5基因可能比TRAF1基因在進化上更為保守(Wajantetal, 1998)。在許氏平中, 就是缺失了TRAF1基因, 保留了TRAF5基因, 與前期的研究結果一致。在鑒定到的9 個TRAF基因中, 有5 個(TRAF2.1、TRAF3.1、TRAF3.2、TRAF5、TRAF2.3)含有5′UTR 區域和3′UTR 區域, 依據這一點可以推測它們是全長基因。在TRAF6、TRAF4.1、TRAF4.2中沒有發現UTR 區域, 而TRAF2.2只發現3′UTR 區域,未發現5′UTR 區域。其中TRAF3.1和TRAF3.2的外顯子數量最多。蛋白質結構域分析結果顯示,TRAF4.1既沒有 RING 結構域, 也沒有 MATH 結構域, 而TRAF4.2有MATH 結構域卻沒有RING 結構域, 其余的TRAF家族基因均含有MATH 結構域和RING 結構域。

TRAF2、TRAF3、TRAF4的多拷貝現象在硬骨魚中較為常見(Lietal, 2020; Nieetal, 2022; Zhouetal,2023)。另外, 我們發現TRAF5在許氏平、大黃魚(Larimichthyscrocea)和斑點叉尾等物種中具有較高的保守性, 而在許氏平中, TRAF5 的相鄰基因和尼羅羅非魚類似。由于TRAF基因存在多拷貝顯現,其共線性結構的保守性也存在很大的差異。進化分析結果顯示,TRAF分為3 大支, 包括TRAF2、TRAF5、TRAF6。從家族分類上解釋, 這些TRAF 可以分為5個主要亞家族: TRAF2 亞家族、TRAF3 亞家族、TRAF4 亞家族、TRAF5 亞家族和TRAF6 亞家族。結果顯示許氏平中的TRAF基因能夠分別和對應的類群聚為一支。其中, TRAF4 亞家族和TRAF6 家族成員關系較近, 這可能與它們具有相似的功能有關(Nieetal, 2022)。蛋白質互作網絡分析結果顯示, FADD、TRADD、BIRC2 均顯示出與TRAF 具有高度關聯性。

已有研究表明魚類中的TRAF基因也發揮重要的免疫防疫作用。在青魚中, 經過病原刺激后, 魚體內的TRAF基因表達水平均顯著升高(Wangetal, 2018)。在東北七鰓鰻(Lethenteronmorii)中,TRAF6在銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染后的成魚的鰓、腸和腎組織中顯著升高(丁少青等, 2019)。半滑舌鰨經哈維氏菌(Vibrioharveyi)刺激48 h 后, 其TRAF基因在各組織中表達量顯著升高(Lietal, 2020)。為了探究TRAF 基因在許氏平腸道中響應病原菌侵染后的表達模式, 我們構建了殺魚愛德華氏菌感染的腸道模式, 并通過熒光定量檢測了9 個TRAF基因在腸道中的表達量。結果顯示除TRAF4.1外, 其余TRAF基因均發生了顯著上調表達。其中,TRAF4.2在感染后96 h 后, 表達量增高了14.24 倍。TRAF6在感染后2 h 上調倍數最大, 為對照組的2.27 倍。但是在嗜水氣單胞菌感染的黃顙魚的肝臟和脾臟中,TRAF4的基因是下調表達的, 而TRAF6也是呈現下調表達的, 與許氏平中的表達模式相反, 但是TRAF2和TRAF3均被誘導表達(Nieetal, 2022)。研究表明TRAF2作為一種多功能分子, 可以激活NF-κB 誘導激酶和c-Jun氨基端激酶信號途徑(Cabal-Hierroetal, 2014)。因此,我們推測TRAF2在許氏平中也是通過這兩種途徑響應病原菌的侵染。但是前期研究發現,TRAF3可以對NF-κB 信號通路進行負性調控(Muroetal, 2014)。但是在大菱鲆中的TRAF2的基因的表達是被抑制的(Zhouetal, 2023)。因此, 我們推測,TRAF3的上調表達可以抑制過渡的炎癥反應, 對機體進行保護。TRAF5在感染后6 h、24 h 和96 h 分別上調2.66 倍、4.57 倍和1.96 倍。研究證明尼羅羅非魚中過表達的TRAF5激活NF-κB (Xiaetal, 2019)。因此, 我們推測許氏平中的TRAF5參與抗細菌免疫應答, 在信號轉導中起著至關重要的作用。

4 結論