不同生物質炭浸提液對蘿卜種子萌發與幼苗生長的毒害效應

胡曉飄，韓佳琳，夏宏蕾，王 蕾，方朝儲，王敏艷，張 進,3，單勝道,3

（1.浙江科技學院 環境與資源學院，浙江 杭州 310023；2.浙江農林大學 環境與資源學院，浙江 杭州 311300；3.浙江科技學院 浙江省廢棄生物質循環利用與生態處理技術重點實驗室，浙江 杭州 310023）

生物質炭是一類新型環境功能材料，具有發達的孔隙結構、較高的比表面積、豐富的表面官能團和良好的吸附性能[1]。諸多研究證實：生物質炭可改善土壤孔隙結構、持水性、生態功能[2]，具有緩釋營養物質的作用，在促進植物生長的同時還能減少農業面源污染。因此，生物質炭研究是目前全球研究的熱點之一[3]。然而生物質炭制備原料大多是農林業殘留物、畜禽糞污等廢棄生物質，其中可能含有重金屬等污染物[4]，其制備過程會將原料中的污染物濃縮，并產生有機酸、焦油、多環芳烴等有機污染物[5]，生物質炭對環境存在潛在威脅，在土壤中大規模應用可能會對土壤-植物-微生物系統產生毒害作用[6-7]。因此，在生物質炭應用于土壤前有必要對其安全性進行評估，明確其對作物生長發育的影響，從而科學、合理利用生物質炭。

作物種子萌發、幼苗生長狀況決定著作物的產量[8]。無土培養法可評估生物質炭對植物的毒害效應，適用于早期植物毒性檢測[9]。蘿卜Raphanussativus在中國各地普遍栽培，具有生長周期短、抗病害能力強等特點?；诖?，本研究利用不同生物質炭浸提液培養蘿卜種子，探究浸提液對蘿卜種子萌發、幼苗生長發育的影響，揭示不同種類生物質炭對蘿卜的潛在危害，為典型廢棄生物質炭化農業應用潛力篩選及安全利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蘿卜購自北京大一韓日國際種苗有限公司。供試生物質炭分別是水稻秸稈炭(RB)、豬糞沼渣炭(PB)和廚余垃圾炭(KB)，水稻秸稈采自杭州市富陽區生物質炭農田科學施用研究示范基地，豬糞沼渣采自浙江省一景生態牧業有限公司，廚余垃圾采自浙江科技學院西和公寓食堂。

采用管式熱解氣氛爐制備生物質炭。制備條件：熱解終溫為400 ℃，停留2 h，升溫速率為10 ℃·min-1。全程通氮氣保證無氧環境[10]。

1.2 實驗設計

1.2.1 生物質炭浸提液制備 3 種生物質炭分別與去離子水按m(炭)∶V(水)=1∶20、1∶50、1∶100 的比例混合，在室溫(約25 ℃)下振蕩24 h，抽濾得生物質炭浸提液。浸提液中砷(As)、納(Na)、鉀(K)等典型重金屬，鈣(Ca)、鉀(K)、鎂(Mg)、鈉(Na)等礦質元素和無機鹽總量見表1。浸提液中多環芳烴等有機污染物低于檢出限，后續不再分析。

表1 生物質炭浸提液中總無機鹽、重金屬和礦質元素Table 1 Concentrations of the total inorganic salts, the typical toxic metals and mineral elements in de-ionized water elutent from biochars

1.2.2 蘿卜種子萌發實驗 選取20 粒飽滿、大小均一的蘿卜種子置于培養皿中，分別加入10 mL 上述浸提液，對照組添加10 mL 去離子水(ck)，每個處理重復3 次，置于恒溫光照培養箱中進行培養。培養溫度為25 ℃，光照為3 000 lx，光照時間為12 h·d-1。以芽長超過1 mm 為發芽標準，每天9:00 統計蘿卜種子的發芽數，連續7 d，計算發芽率、發芽勢、發芽指數。

1.2.3 蘿卜幼苗表觀及生理指標測定 在育苗桶內放置育苗籃，每桶加入20 粒催好芽的、發育狀態一致的蘿卜種子，分別加入20 mL 上述生物質炭浸提液，對照組添加20 mL 去離子水，每天觀察育苗桶內干濕度，補充浸提液或去離子水3～5 mL，各處理添加量維持相同，持續15 d。

1.3 樣品分析與指標測定

種子發芽勢為日發芽種子數達到最高峰時的發芽種子占比；種子發芽率為萌發第7 天時種子萌發比例；種子發芽指數(GI)計算：GI=Σ(Gt/Dt)，其中Gt為在第t天的發芽數，Dt為相應的發芽日數。

隨機選取育苗盆中長勢較為平均的9 株蘿卜幼苗，用直尺測量其根長、苗高、葉寬，用游標卡尺測量其莖粗，取平均值，未發芽種子的幼苗不做記錄。

生理指標主要包括蘿卜幼苗組織內葉綠素質量分數、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)質量摩爾濃度、根系活力、過氧化氫酶(CAT)活性。葉綠素質量分數測定采用乙醇提取法，SOD 活性測定采用氮藍四唑法(NBT 法)，CAT 活性測定采用紫外吸收法，MDA 質量摩爾濃度測定采用硫代巴比妥酸法，根系活力測定采用TTC 法。

1.4 數據處理與分析

用Excel 2019 整理數據，應用SPSS 26 進行統計分析，采用單因素方差分析和Waller Duncan’s 多重比較評價不同處理對蘿卜種子的萌發和幼苗生長發育的顯著性影響，使用Origin 2021 制圖。

2 結果與分析

2.1 生物質炭浸提液對蘿卜種子萌發的影響

按照GB 8978—1996《污水綜合排放標準》最高允許排放質量濃度：As 限值為0.5 mg·L-1，Zn 限值為5.0 mg·L-1，Cu 限值為2.0 mg·L-1。本研究表明：m(炭)∶V(水)=1∶20 的廚余垃圾炭中As 超標；m(炭)∶V(水)=1∶50 的豬糞沼渣炭中Cu、Zn 超標，水稻秸稈炭中As、Zn 超標(表1)。

由表2 可知：浸提液對種子萌發有顯著抑制作用(P＜0.05)，浸提液質量體積比越大，對蘿卜種子萌發越不利。m(炭)∶V(水)=1∶100 處理下，種子發芽率、發芽勢、發芽指數與對照差異不顯著。m(炭)∶V(水)=1∶20 的廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭、水稻秸稈炭浸提液培養的種子發芽率分別比對照降低了56.41%、23.07%、35.90%，不同種類生物質炭之間差異顯著(P＜0.05)，作用從大到小依次為廚余垃圾炭、水稻秸稈炭、豬糞沼渣炭。m(炭)∶V(水)=1∶50 的廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭、水稻秸稈炭浸提液培養的種子發芽率分別降低了10.26%、10.26%、5.13%。相比于對照，m(炭)∶V(水)=1∶20 的浸提液處理下種子發芽勢顯著降低(P＜0.05)，但不同種類生物質炭之間無顯著差異；m(炭)∶V(水)=1∶50 的豬糞沼渣炭發芽勢與對照相比無顯著差異，其他處理的發芽勢均顯著低于對照(P＜0.05)。

表2 不同生物質炭浸提液對蘿卜種子萌發的影響Table 2 Effects of different biochar extract solutions on the seed germination of radish

種子發芽指數綜合反映了堆肥的植物毒性，被認為是最敏感、最可靠的堆肥腐熟度評價指標。一般情況下，發芽指數大于50 可認為堆肥對種子基本無毒性。由表2 可知：m(炭)∶V(水)=1∶100 的浸提液培養的蘿卜種子發芽指數均超過50，且與對照相比無顯著差異，表明m(炭)∶V(水)=1∶100 的浸提液對種子發芽基本無毒副影響。m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下蘿卜種子發芽指數為46.55～49.45，略低于50，顯現出輕微的毒害效應。m(炭)∶V(水)=1∶20 條件下蘿卜種子發芽指數為21.45～34.25，遠低于50，毒性顯著(P＜0.05)。

2.2 生物質炭浸提液對蘿卜幼苗生長的影響

2.2.1 生物質炭浸提液對蘿卜幼苗表觀指標的影響 從表3 可見：m(炭)∶V(水)=1∶20 條件下，水稻秸稈炭浸提液培育的蘿卜幼苗存活率為11.67%，豬糞沼渣炭和廚余垃圾炭浸提液培育的蘿卜幼苗存活率分別僅為6.67%和3.33%，這導致后續表觀指標與生理指標測定無法進行，故育苗實驗只探討m(炭)∶V(水)為1∶50 和1∶100 條件下生物質炭浸提液對蘿卜幼苗的影響。

表3 不同生物質炭浸提液對蘿卜幼苗存活率的影響Table 3 Effects of different biochar extracts on radish seedling survival rate

由表4 可知：生物質炭浸提液對蘿卜幼苗葉片數無顯著影響，說明蘿卜幼苗發育程度基本一致。m(炭)∶V(水)=1∶100 條件下蘿卜幼苗長勢與對照接近，m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下生物質炭浸提液對蘿卜幼苗生長發育抑制作用明顯，不同生物質炭之間差異顯著(P＜0.05)，作用從大到小依次為廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭、水稻秸稈炭。與對照相比，m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭、水稻秸稈炭浸提液處理下的蘿卜幼苗的鮮質量分別降低了65.98%、29.55%、51.89%；苗長分別降低了56.01%、37.73%、48.68%；根長分別降低了76.04%、20.77%、53.16%。

表4 生物質炭浸提液對蘿卜幼苗生長的影響Table 4 Effect of biochar extract solutions on the growth of seedling radish

廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭、水稻秸稈炭浸提液處理下均出現死苗現象。觀察發現：廚余垃圾炭浸提液培育的蘿卜幼苗先是出現爛根，在莖葉交匯處出現莖桿自上而下干枯，后幼苗死亡的現象；類似地，水稻秸稈炭浸提液培育的幼苗也是先在莖葉交匯處出現莖桿失水，短時間內莖桿自上而下干枯，后幼苗死亡的現象；豬糞沼渣炭浸提液培育的幼苗則是先出現葉片莖桿發蔫，后出現蘿卜幼苗死亡，且蘿卜幼苗葉片顏色偏黃。m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下豬糞沼渣炭浸提液培育的幼苗表觀與對照最接近，但死苗率高達31.65%。結合表1 和表2 可判斷：高質量分數的Cu、Zn 對植物幼苗起毒害作用；廚余垃圾炭浸提液中過高的無機鹽總量不僅降低植物幼苗存活率，對植物幼苗的生長發育也有明顯的抑制效應；水稻秸稈炭浸提液對蘿卜幼苗的毒害機理與廚余垃圾炭相似，但無機鹽總量低于廚余垃圾炭，對蘿卜幼苗生長發育的抑制效果減輕，幼苗存活率也提高。

2.2.2 生物質炭浸提液對蘿卜幼苗生理指標的影響 與對照相比，m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下生物質炭浸提液對蘿卜種子萌發、幼苗生長的影響顯著(P＜0.05)，m(炭)∶V(水)=1∶100 的生物質炭浸提液影響不顯著(表2 和表4)，故只探究m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下生物質炭浸提液對蘿卜幼苗生理指標的影響。

m(炭)∶V(水)=1∶50 的廚余垃圾炭浸提液、豬糞沼渣炭浸提液、水稻秸稈炭浸提液培育的蘿卜幼苗葉綠素總量較對照相比分別降低了21.85%、12.00%、24.32%；葉綠素a 分別降低了21.55%、11.44%、24.51%；葉綠素b 分別降低了21.85%、13.27%、24.32%，變化趨勢一致。廚余垃圾炭和水稻秸稈炭浸提液處理無顯著差異(圖1)，說明兩者對幼苗生長發育影響機理接近。浸提液培養對蘿卜幼苗葉綠素的影響與對蘿卜幼苗表觀(鮮質量、苗長、根長)的影響趨勢基本一致。廚余垃圾炭和豬糞沼渣炭浸提液培育的蘿卜幼苗SOD 活性相比于對照分別降低了71.95%、19.04%，水稻秸稈炭浸提液培育下提高了37.85% (圖2A)。廚余垃圾炭浸提液培育的蘿卜幼苗CAT 活性相比于對照降低了63.09%，水稻秸稈炭浸提液培育下提高了9.87%，而豬糞沼渣炭浸提液培育下CAT 活性相比于對照差異不顯著(圖2B)，變化趨勢與葉寬一致。廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭、水稻秸稈炭浸提液培育的蘿卜幼苗根系活力相比于對照分別降低了83.57%、39.95%、65.93% (圖2C)，降低趨勢與根長接近。廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭浸提液培育的蘿卜幼苗MDA 質量摩爾濃度相比于對照分別增加了59.46%、17.49%、30.58% (圖2D)，變化趨勢與根系活力相反。

圖1 不同生物質炭浸提液對幼苗葉綠素質量分數的影響Figure 1 Effects of different biochar extracts on chlorophyll content in seedlings

圖2 不同生物質炭浸提液對幼苗生理指標的影響Figure 2 Effects of different biochar extracts on physiological indexes of seedlings

2.3 浸提液內物質與蘿卜種子萌發及幼苗生長發育的相關性分析

生物質炭浸提液pH、無機鹽總量、As 與蘿卜種子萌發和幼苗生長發育均呈顯著負相關(P＜0.05)(圖3)，是抑制蘿卜生長發育的重要環境因子，也是影響蘿卜幼苗存活率的主要因素。除生物質炭浸提液的pH、無機鹽總量外，蘿卜幼苗苗長、葉綠素與K 呈顯著負相關(P＜0.05)；根長、葉寬、CAT 和SOD 活性與Na 呈顯著負相關(P＜0.05)；MDA 與Na 呈顯著正相關(P＜0.05)。

圖3 浸提液內物質與蘿卜種子萌發及幼苗生長發育的相關性Figure 3 Correlation analysis of extracts with seed germination and seedling growth of radish

3 討論

3.1 生物質炭與蘿卜種子萌發的關系

pH 對植物的營養代謝有較大的影響，生物質炭pH 和無機鹽總量，生物質炭制備原料、溫度、升溫速率有關[11]。本研究所制備的生物質炭pH 為堿性，高質量體積比條件下浸提液為堿性高鹽環境，會對種胚細胞結構造成破壞，從而抑制種子萌發[12-13]，因此蘿卜種子萌發與生物質炭浸提液的pH、無機鹽總量呈極顯著負相關(P＜0.01)。蘿卜種子發芽率、發芽勢、發芽指數均與As 呈顯著負相關(P＜0.05)，這與符佳豪等[14]的研究結果一致。As 對種子萌發有明顯的抑制作用，且As 質量分數越大抑制作用越強。K、Mg 是植物生長發育所必需的營養元素，但本研究中，蘿卜種子發芽指數與K、Mg 呈顯著負相關(P＜0.05)，說明浸提液中K、Mg 質量分數過高，已對蘿卜種子的萌發造成脅迫。

本研究設置的3 個處理中，隨著質量體積比的降低，浸提液pH 降低，對蘿卜種子萌發的抑制作用減輕，浸提液對蘿卜種子的毒害作用減輕。生物質炭種類不同，浸提液的pH、無機鹽總量和種類存在差異，發芽過程中種子從浸提液吸收的水分和有害物質存在差異，故發芽率存在差異。生物質炭種類對蘿卜種子毒害作用從大到小依次為廚余垃圾炭、水稻秸稈炭、豬糞沼渣炭。

3.2 生物質炭與蘿卜幼苗表觀生長發育的關系

蘿卜種子萌發期主要靠種子胚提供營養，而幼苗期生長發育則需從外界吸收營養，因此生物質炭浸提液對幼苗的影響強于對種子的影響。m(炭)∶V(水)=1∶20 條件下，較高的pH 不僅破壞種胚細胞結構，抑制蘿卜種子萌發，還嚴重破壞蘿卜幼苗輸導組織與分生組織，導致幼苗死亡[15-16]。

As 在環境中易累積、難降解，是強毒性環境污染的重金屬元素，對植物生長發育有明顯的抑制作用[17-18]。K、Na、Ca 離子在植物中具有復雜的信號功能，是植物生長發育所必需的營養元素，但當浸提液中K、Na、Ca 過高時會改變滲透勢，因此影響植物生長發育。本研究生物質炭浸提液中的K、Na、Ca 等元素已對蘿卜幼苗生長發育造成脅迫。

蘿卜幼苗的根部比冠部對有害物質更敏感，受抑制作用影響也更明顯[19]。廚余垃圾炭、水稻秸稈炭浸提液處理下，有害物質通過抑制幼苗根部細胞有絲分裂過程進而影響幼苗根部生長[20]。當幼苗根部受抑制程度達一定閾值時，幼苗組織內的水分、養分運輸就會受阻，影響幼苗冠部生長發育[21]。廚余垃圾炭浸提液較高的pH 和無機鹽導致幼苗的根部無法進行正常的養分吸收[22]；水稻秸稈炭浸提液中無機鹽稍低于廚余垃圾炭，蘿卜幼苗根部可以吸收營養物質供幼苗生長發育，但水稻秸稈炭浸提液中較高的K+、Na+，會影響幼苗信號傳遞功能，阻礙幼苗生長發育[23-25]。豬糞沼渣炭浸提液中有害物質并未抑制蘿卜幼苗根部的有絲分裂，但較高的重金屬元素抑制了蘿卜幼苗的生長發育[26]。

3.3 生物質炭對蘿卜幼苗生理指標的影響

葉綠素減少會導致幼苗光合作用效率降低[27]。生物質炭浸提液降低了蘿卜幼苗葉綠素質量分數，因此減弱了幼苗光合作用效率，從而抑制了蘿卜冠部生長發育。

與對照相比，m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下，生物質炭浸提液增加了蘿卜幼苗MDA 質量摩爾濃度，植物處于受脅迫環境時會啟動抗氧化保護酶系統，減輕外界對植物的損傷[28]。表明蘿卜幼苗正處于逆境脅迫中。幼苗MDA 質量摩爾濃度增長趨勢與根系活力降低趨勢一致，進一步證明浸提液對幼苗根部細胞有絲分裂過程有抑制作用。

m(炭)∶V(水)=1∶50 條件下，廚余垃圾炭浸提液培育的蘿卜幼苗MDA 質量摩爾濃度增加最顯著(P＜0.05)，同時SOD、CAT 活性最低，表明蘿卜幼苗在廚余垃圾炭浸提液形成的高鹽脅迫環境下抗氧化保護酶系統受到了嚴重損傷，無法自主調節抗氧化酶活性。水稻秸稈炭浸提液培育的幼苗MDA 質量摩爾濃度增加量低于廚余垃圾炭，但SOD、CAT 活性均高于對照，表明水稻秸稈炭浸提液雖對幼苗造成鹽脅迫，但幼苗可通過自主調節抗氧化酶活性，增強幼苗清除活性氧的能力，減輕環境對幼苗造成的損傷[29]。豬糞沼渣炭浸提液培育的幼苗MDA 質量摩爾濃度增加量最少，CAT 活性與對照差異不顯著，SOD活性低于對照，表明豬糞沼渣炭浸提液對蘿卜幼苗幾乎不造成鹽脅迫，但依然對蘿卜幼苗有毒害作用。

4 結論

本研究表明：廚余垃圾炭、豬糞沼渣炭、水稻秸稈炭浸提液在m(炭)∶V(水)＞1∶50 條件下，對蘿卜種子萌發及幼苗生長發育均存在顯著抑制作用，抑制作用從大到小依次為廚余垃圾炭、水稻秸稈炭、豬糞沼渣炭，且在蘿卜幼苗生長過程中均存在氧化應激。這表明以上3 種生物質炭對蘿卜種子萌發和幼苗生長存在潛在危害。因此，在每種生物質炭廣泛應用于農田改良之前，應對其進行相應的植物響應分析研究，以確保其科學合理使用。