循環腫瘤DNA的檢測技術及在癌癥診療中的應用價值*

張潔潔 牛春艷 董蓮華 楊怡 李會杰 楊靖亞

（1）上海海洋大學食品學院，上海 201306；2）中國計量科學研究院前沿中心，北京 100029）

腫瘤是目前全球衛生保健問題日益嚴重的因素之一，每年有超過百萬的新確診患者。它是由相關基因功能紊亂引起的遺傳變化導致的多基因疾病，有較高的發病率和死亡率［1］。目前，組織活檢是臨床上最常用的診斷癌癥手段，被廣泛用于表征腫瘤類型。然而，組織活檢是一種侵入式取樣方式，在取樣過程中很有可能因為組織本身的異質性或沒有在病變位置采樣而引起癌癥錯判［2-4］。除此之外，還會由于活檢本身不能反復取樣的特性而不能對腫瘤進行實時監控。所以組織活檢技術在操作成本、診斷精確性，以及癌癥的高效治療方面仍然面臨更多的挑戰。為了克服以上問題，有研究人員開發一種新型的非侵入式檢測方式，稱其為液體活檢［5-7］。該檢測是基于對循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA［8］）、循環腫瘤細胞［9］和血漿中其他腫瘤衍生物質［10］的分析。它們來源于腫瘤組織，存在于血液中，可以反映腫瘤發展進程以及耐藥性等信息，指導個體化精準治療。液體活檢中對ctDNA的檢測可以發現單核苷酸變異、拷貝數變異［11-12］、甲基化［13］等多種表觀遺傳學改變。它攜帶腫瘤組織的信息密碼，是一種很好的腫瘤檢測生物標志物，在腫瘤檢測方面有較高的準確性和安全性，所以備受關注并被廣泛研究。

1 ctDNA來源及性質

ctDNA是來源于腫瘤組織的一種循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA），通過腫瘤細胞的凋亡、壞死和分泌外泌體釋放到血液中。Mandel等［14］在1948年首次發現cfDNA存在于健康人的血液中。研究顯示，在健康個體血漿中cfDNA濃度約為1~10 μg/L［15］。但是在運動、急性創傷、移植、感染后cfDNA的濃度會升高，這一特征為其成為潛在的生物標志物奠定了基礎。1989年Stroun等［16］發現，在腫瘤患者血漿中的部分cfDNA來自于腫瘤細胞，因為它具有腫瘤DNA特有的雙鏈不穩定性。1994年Sorenson等［17］首次報道用等位基因特異性聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法在胰腺癌患者血漿中發現的KRAS突變與在腫瘤中發現的KRAS突變相同，從而證實了血漿中突變的DNA片段是腫瘤起源，于是就產生了ctDNA這個術語?；颊哐褐衏tDNA的存在及其水平的變化與腫瘤負荷和腫瘤進展有關，并且ctDNA已被證實存在于多種實體惡性腫瘤患者中（如肺癌［18］、結直腸癌［19］、乳腺癌［20］、黑色素瘤［21］、前列腺癌［22］、胃癌［23］等）。

基于細胞不同的死亡機制，ctDNA的長度具有可變性，來自壞死細胞的ctDNA片段長度可能超過10 000 bp，而來自凋亡細胞的ctDNA片段長度一般為180 bp左右（以及180 bp的倍數）［15，24］，這可能與核小體有關。近年來基于測序的方法檢測cfDNA時通常在166 bp［25-26］處識別出一個顯著的峰，這是包裹在核小體周圍的DNA長度（147 bp）加上與組蛋白相關的連接子DNA的長度。但是，有研究表明，ctDNA的片段長度比非癌癥突變的cfDNA要短20~40 bp，在大鼠移植模型中，ctDNA片段長度在134~144 bp，造成這種截短的原因尚不明確［27］。An等［28］發現，cfDNA片段化過程受到DNA甲基化的調控，DNA甲基化可影響核酸酶的結合以及切割位點，從而決定cfDNA片段化的模式。低水平的DNA甲基化可以增加核小體的可及性，并改變DNA片段化過程中核酸酶的切割活性，從而進一步導致cfDNA切割位點和大小分布的變化。

ctDNA的半衰期較短，約15 min~2 h［29-31］，被核酸酶水解進入循環系統，并由腎臟排泄到尿液中。因此，ctDNA可以作為腫瘤動態的高度特異性標志物，對腫瘤的進程和術后反應進行實時監測，ctDNA的分析與檢測開啟了腫瘤進展過程中無創檢測特定癌癥突變的可能性。

2 ctDNA樣品處理

由于片段小、容易丟失和降解，所以從血液中分離ctDNA進行定量是具有挑戰性的。雖然ctDNA的濃度會隨著分期和腫瘤大小的增加而提高，但是ctDNA在血液中的總百分比極低，這對樣品處理過程提出了更高要求［32］。

首先在樣品采集方面，為了避免由于細胞裂解和血液凝固過程中DNA的釋放造成ctDNA的稀釋，最好用血漿來提取ctDNA［33-34］。血漿樣品也不能儲存過長時間，研究顯示-80℃保存的血漿中的DNA水平每年下降30%［35］。另外抗凝劑管的選擇也很關鍵，Wong等［36］通過對孕婦血漿中循環游離胎兒DNA分子分析，調查和驗證了進行無創產前檢查的血液運輸和儲存條件。結果顯示，相比于EDTA抗凝管，Streck BCT抗凝管能夠最大限度地減少細胞降解。

其次在樣品提取方面，Fong等［37］比較了不同的cfDNA提取方法（苯酚-氯仿法、碘化鈉法、QIAamp DNA試劑盒等），發現碘化鈉方法的得率最高。為了排除由于DNA提取物中存在各種PCR抑制劑而導致擴增結果錯誤，可以用亞硫酸鹽轉化去除PCR抑制成分（蛋白質、EDTA和乙醇等）［38］，從而提高檢測效率。

3 ctDNA檢測技術

近年來，分子生物學技術正在迅速發展，促進了ctDNA的研究與檢測［39］。目前ctDNA的主要檢測方法一類是基于PCR的方法，包括實時熒光定量PCR（real-time fluorogenic quantitative PCR）、數字PCR（digital PCR，dPCR）、BEAMing（beads，emulsion，amplification，and magnetics）、ARMS-PCR（amplification-refractory mutation system PCR），另一類是基于下一代測序（nextgeneration sequencing，NGS）方法。除此之外，一些新技術，特別是基于納米技術的生物傳感器在檢測ctDNA方面具有巨大潛力，為低成本臨床應用提供了一種簡單而高性能的通用策略。主要有電化學生物傳感器、熒光生物傳感器、表面增強拉曼散射生物傳感器、比色/共振光散射生物傳感器等（圖1，表1）。

Table 1 Comparison of ctDNA detection techniques表1 循環腫瘤DNA檢測技術對比

Fig.1 Flowchart of the principle of the main detection methods for ctDNA圖1 循環腫瘤DNA主要檢測方法的原理流程圖

3.1 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是檢測ctDNA最常用的技術之一，可以對其進行相對定量，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好等特點。然而，實時熒光定量PCR對反應中目標序列的“絕對”量是相對于從已知數量或拷貝數的樣品生成的標準曲線進行校準［40-41］。Fleischhacker等［42］使用3種不同的參考基因（GAPDH、β-globin、ERV）通過實時熒光定量PCR對血漿中的ctDNA進行檢測，結果β-globin與另外兩種參考基因的檢測結果有很大差異。對于用實時熒光定量PCR技術進行ctDNA定量分析，擁有統一且穩定的參考基因和已知拷貝數的ctDNA標準物質是問題的關鍵。

3.2 dPCR

dPCR是被稱為能夠對樣品中存在的目標核酸進行絕對定量的第三代PCR技術［43］。在dPCR中，首先將樣品分為許多獨立的PCR反應單元，使得每個微小單元中包一個目標序列或不包含目標序列。眾多的微小單元在相同的條件下進行PCR擴增，擴增結束以后，可以統計發出熒光信號的單元個數占總微滴個數的比例，通過泊松分布計算目標序列的濃度和絕對數目。并且目標序列集中在分離的微小單元里，這種濃度效應減少了模板競爭，從而能夠在野生型序列的背景下檢測罕見的突變。根據形成微小單元的不同原理，數字PCR又可以分為芯片式數字PCR和微滴式數字PCR。

液滴式數字PCR能產生體積達20 000 nl的油包水液滴，這些液滴同時進行PCR擴增，然后用熒光探測器對這些液滴進行分析，可以實現對相對較低濃度的樣本進行絕對定量，比如對ctDNA基因突變檢出限可以低至0.01%［44-45］，并且能夠同時檢測多種靶標。Guo等［46］評估了dPCR對ctDNA樣本EGFR基因3種突變類型（E746-A750del、L858R和T790M）的檢測性能，檢測特異性為100%，檢出限分別為0.05%、0.05%和0.1%。De kock等［45］同時檢測了EGFR突變中的19DEL、L858R、L861Q、G719S、S768I等常見突變，當ctDNA的輸入量為10 ng時，這些基因的檢出限分別為5%、1%、0.25%、0.1%和0.01%。dPCR由于可以對目標基因進行絕對定量并且檢測限極低已被廣泛應用，但是其通量低且只能檢測已知點突變。

3.3 BEAMing

BEAMing是指集合微珠、乳液、擴增、磁性，可以來測量突變型基因和野生型基因的技術［47］。該技術制造出幾百萬個油包水乳濁液小泡，每個乳濁液小泡中，有一個小的磁珠，通過磁珠上包被基因特異的引物來擴增目的序列，每個磁珠包含原始DNA分子序列的數千個拷貝。然后可以利用熒光探針與磁珠上的DNA片段進行雜交，并使用流式細胞術計數來評估群體中變異DNA分子的數量。Janku等［48］證明了使用BEAMing技術檢測癌癥晚期患者血漿ctDNA中BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因的21個致癌突變是可行的，其結果與組織活檢有較高的一致性（BRAF，91%；EGFR，99%；KRAS，83%；PIK3CA，91%）。Higgins等［49］使用BEAMing評估了同時獲得的晚期乳腺癌患者的血漿和腫瘤組織樣本，二者之間PIK3CA突變有100%的一致性。BEAMing技術的優點一是能夠分析ctDNA分子中的微小變異，其突變等位基因頻率的檢出限約為0.02%，二是代表突變等位基因的稀有磁珠不僅可以定量，還可以純化以供后續分析。

3.4 ARMS-PCR

ARMS-PCR［50］指擴增受阻突變體系，又稱為等位基因特異性擴增法，是一種簡單而經濟的SNP基因分型方法，包括PCR反應及凝膠電泳。使用特殊的兩組引物在PCR反應中分別擴增已知點突變的模板和正常的模板，然后與微孔板陣列對角線凝膠電泳技術相結合，可以將點突變的模板與正常模板區分開。Xu等［51］評估了ARMS-PCR檢測非小細胞肺癌患者（non-samll cell lung cancer，NSCLC）的EGFRT790M突變的敏感性和特異性。結果顯示該方法敏感特異性強、成本低、操作簡單。但是這種方法的引物設計部分關鍵且耗時，而且需要借助專門的引物設計計算機程序。

3.5 NGS

NGS被稱為二代測序技術，是將DNA隨機片段化、加接頭、制備測序文庫，通過對文庫中數以萬計的克隆進行延伸反應，然后通過檢測信號，而得到序列信息的技術［52］。因其具有據有高通量的優勢，可以檢測多個已知或未知的點突變，被廣泛應用于ctDNA的檢測［53-54］。

由NGS衍生出了不同的測序類型，包括全基因組測序（WGS）、全外顯子測序（WES）、標記擴增子深度測序（Tam-Seq）、腫瘤個性化深度測序（CAPP-Seq）等。WGS能提供完整的罕見腫瘤基因組信息，在協助罕見基因突變的臨床決策和治療方案的選擇方面顯示出巨大的潛力［55］，但由于昂貴且耗時以及一些倫理問題限制了它在臨床中的應用。WES測序可用于對人類基因組編碼區進行測序，以檢測常見或罕見疾病的相關突變。與傳統測序技術相比，有成本低、速度快的優勢［56］。Tam-Seq能夠同時對數百萬個DNA分子進行測序，從而能夠對一個物種的轉錄本和基因組進行詳細分析，其通量高、成本低、測序時間短［47］。CAPPSeq可以識別同類型癌癥患者的多重突變，改善腫瘤異質性的評估，從而提供更全面的診斷信息［55，57］。

3.6 生物傳感器

PCR和測序的方法使ctDNA檢測取得了重大進展，使用少量的起始材料并提供高靈敏度和特異性。然而一些關鍵點限制了它們的應用，以及在臨床環境中的開發：測序的方法操作復雜且過于昂貴，PCR法容易受到序列特異性擴增的影響，并且需要樣品預處理，從而增加了分析成本和時間成本。因此，研究者開發了適合臨床常規使用的低成本和便攜式平臺［58］，通過簡單的操作過程，能夠準確檢測未經處理的血清或血漿中的特定ctDNA突變。

3.6.1 電化學生物傳感器

Cai等［59］報道了一種基于肽核酸探針-金納米顆粒和磷酸鉛載鐵蛋白的雙生物標志物檢測平臺，用于檢測ctDNA中PIK3CA基因甲基化和腫瘤特異性突變。肽核酸探針和抗5甲基胞嘧啶抗體用于識別ctDNA的不同部分，在電極表面上形成三明治結構。通過方波伏安法檢測電極上的載鐵蛋白釋放的鉛離子電化學信號，從而實現對ctDNA高度特異性和靈敏性檢測。該傳感器可以對ctDNA濃度產生50~10 000 fmol/L的線性電流響應，檢出限為10 fmol/L，并成功檢測出從癌癥患者血清中收集的ctDNA。

3.6.2 熒光生物傳感器

Li等［60］開發了一種基于雜交鏈式反應和鄰位連接調控CRISPR-Cas12a系統的ctDNA靈敏檢測雙信號擴增策略。CRISPR-Cas系統除了非凡的基因編輯能力外，還具有等溫信號放大的作用，開啟了生物傳感應用的新時代。ctDNA通過兩個發夾探針的連續雜交啟動雜交鏈式反應，產生許多帶切口的雙鏈DNA納米片段，這些片段繼續連接來激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性。在這種情況下，可以切割雙標記的單鏈DNA熒光基團以產生強烈的熒光信號。由于雜交鏈式反應和CRISPR-Cas12a的雙重擴增，該方法對ctDNA表現出高靈敏度，檢出限低至5.43 fmol/L。

4 ctDNA標準物質在NGS中的重要性

NGS的應用越來越廣泛，有望成為實現人類癌癥基因組醫學的有用工具。然而，其臨床應用的前提是需要確保數據的可靠性和準確性。應用NGS進行基因突變檢測包括樣品制備、核酸提取、文庫制備以及序列測定、數據分析等多個步驟，因此確保所有步驟的有效性面臨極大挑戰［61］。已知濃度和突變豐度的ctDNA標準物質可用于校準NGS測量和評估診斷性能，通過ctDNA標準物質產生的標準數據集可對二代測序各個過程進行質量控制。因此，提倡使用標準物質驗證整個診斷系統［62］。

ctDNA標準物質對ctDNA分析性能全面評估起著關鍵作用。已知序列的合成DNA可用作驗證DNA測序的標準［63］，但理想情況是使用更接近真實臨床樣本的病理標本，以驗證包括樣本制備在內的整個診斷過程［64］。當待測基因數量較少時，可以保存一部分臨床標本并作為特定基因的標準物質，但為多基因檢測的測序方法中所有基因制備此類標準物質仍存在一定困難。此外，對于某些遺傳疾病，由于突變的罕見性，很難獲得真實的臨床樣本。用已突變細胞系作為原料制備ctDNA標準物質比合成DNA更接近臨床樣品，更易獲得且可以保持穩定供應，因此可以用于制備均勻穩定的標準物質，對NGS檢測過程進行驗證和評估［65-66］。

目前國內外利用標準物質開展對ctDNA分析方法進行性能評估的研究還較少。2021年由美國食品藥品監督管理局（FDA）牽頭的一項研究［52］報告了對業界領先的5種ctDNA測序分析方法的多位點、跨平臺分析性能評估結果。該研究使用標準化的來源于細胞系的標準物質對ctDNA測序工作流程的每個階段進行了評估及驗證。研究結果表明，樣本突變頻率、覆蓋深度和異質性、DNA樣本量、外顯子邊緣效應等因素是測序流程中重要的影響因素，當等位基因突變頻率高于0.5%時，5種測序檢測方法均能以較高的靈敏度、準確性和重復性檢測到ctDNA突變，但低于這一范圍時，檢測就變得不可靠，不同檢測方法之間的差異很大。這種對ctDNA分析性能的全面評估有助于為最佳實踐指南提供參考。

5 ctDNA在癌癥診療中的應用

5.1 疾病的早期篩查

在癌癥早期，通過液體活檢去檢測特定基因的常見突變位點，可以對癌癥進行早期篩查［67］。Beaver等［68］用dPCR檢測了30名乳腺癌患者術前的血液樣本，同時做了腫瘤組織分析，結果顯示血液樣本和腫瘤組織中的PIK3CA突變率有很高的一致性。說明檢測血漿中ctDNA基因熱點突變位點可以作為腫瘤組織檢測的補充。在早期篩查中發現的原發性腫瘤患者，僅通過手術治愈癌癥的可能性很高［69］。因此，這種早期篩查是未來降低癌癥發病率和死亡率的最有希望的方法之一。但是，血液中ctDNA濃度在癌癥早期普遍較低，所以通過該手段進行癌癥早篩仍具有一定挑戰性。

5.2 靶向藥物的用藥指導

在進展期NSCLC液體活檢聲明中［70］，ctDNA已被明確推薦用于指導NSCLC患者靶向藥物選擇。歐洲藥品管理局（EMA）和FDA已批準使用羅氏診斷的EGFR 突變檢測試劑盒作為伴隨診斷［71］，以幫助從無法進行腫瘤活檢的患者中選擇EGFR突變陽性的NSCLC患者進行吉非替尼、厄洛替尼和奧西替尼治療。FDA已批準Guardant Health基于NGS的液體活檢測定法用于識別EGFR基因突變的NSCLC患者進行奧西替尼的治療［71］。這些測試的臨床實用性展示了ctDNA作為生物標志物的潛力。表2列舉了一些已經批準用于ctDNA液體活檢相關標志物檢測試劑盒或檢測試劑。

Table 2 ctDNA related marker detection kit or detection reagent表2 循環腫瘤DNA相關標志物檢測試劑盒或檢測試劑

5.3 治療效果的實時監控

Dawson等［74］評估了利用ctDNA來監測轉移性乳腺癌治療效果。將30名接受全身治療的轉移性乳腺癌患者的ctDNA、循環腫瘤細胞和癌癥抗原（CA15-3）的測定進行了比較。用WGS來鑒定體細胞基因組改變，并設計了特殊的方法來量化連續收集的血漿樣品中ctDNA。與此同時測量癌癥抗原水平和循環腫瘤細胞的數量。結果發現，在體細胞基因組改變的女性中，分別以97%、78%、87%的比例檢測到ctDNA、循環腫瘤細胞和癌癥抗原。ctDNA水平顯示出更廣泛的動態范圍，并且與腫瘤負荷變化的相關性更大。表明ctDNA能夠為轉移性乳腺癌患者提供豐富的信息，是具有高特異性和高靈敏性的生物標志物。

5.4 微小殘留病灶以及復發風險的預后評估

微小殘留病灶用于描述治療后體內存在少量腫瘤細胞［75］。在患者實施切除腫瘤手術后，一般會有較高的復發風險，因此，更好地評估微小殘留病灶是癌癥管理的關鍵。ctDNA分析可以作為復發監測工具。在術后的不同時間點采集一系列的血漿樣本，檢測已知存在的原發性腫瘤細胞突變，數據顯示ctDNA的檢出與轉移性復發風險的增加密切相關［76］。在該領域早期的一項研究報道［77］，對20名長期隨訪的原發性乳腺癌的患者進行ctDNA動態監測，通過微滴式dPCR對血漿中ctDNA腫瘤特異性染色體重排進行檢測，首次發現ctDNA監測能準確區分病人是否出現臨床檢測到的術后復發?；赾tDNA的檢測，在86%的患者中提前11個月預測到復發風險。另外，基于NGS的ctDNA檢測也可以評估患者的微小殘留病灶水平，在預測疾病復發風險方面具有較高的敏感性和特異性［78］。能夠使醫生動態監測和確認疾病的緩解，發現復發的早期跡象，并盡早開始治療以有效管理癌癥。該領域正在進行大量研究，盡管許多研究已經表明ctDNA檢測微小殘留病灶的臨床效用［79］，但仍然有許多局限性問題待研究者解決。

5.5 疾病進展檢測

血漿中ctDNA濃度的增加與疾病進展之間存在相關性。Janssen等［80］成功開發了一個非線性混合效應模型，描述了接受厄洛替尼或吉非替尼治療的NSCLC患者血漿中L858R、19Del和T790M濃度的動力學。此外，通過使用參數時間事件模型，L858R和19Del濃度的相對變化被確定為該患者群體疾病進展的重要預測因素。先前已經表明，在患者血漿中測量的ctDNA濃度趨勢與患者腫瘤組織中檢測到的突變以及通過CT掃描測量的腫瘤體積變化相關。在這項研究中，與可檢測到ctDNA濃度的患者相比，ctDNA濃度低于檢出限的患者表現出更長的無進展生存期和總生存期。與標準CT掃描診斷相比，ctDNA的檢測可以更早地發現非小細胞肺癌復發。

6 總結與展望

ctDNA檢測具有微創、可實時取樣、反映的信息全面等特點，可以應用于癌癥的早期篩查、靶向藥物選擇、療效實時監控，以及復發風險的預后評估等方面。此外，ctDNA檢測可與其他多組生物標志物協同使用，如早期檢測抗原、表觀遺傳標記物、循環腫瘤RNA、外泌體相關免疫標記物等，以增強早期檢測。盡管ctDNA釋放到血液中的確切途徑尚不完全清楚，但其存在以及數量與腫瘤負荷或轉移有關，對癌癥患者的診斷及治療有重要價值。

隨著NGS和dPCR等技術的不斷發展，越來越多基于此類技術開發的液體活檢方法已經可用于臨床環境，但仍存在實驗室間檢測結果重復性和再現性較差的難題［81-82］。因此，ctDNA的臨床檢測全過程，包括可靠的血漿和血清收集和存儲方法、DNA分離和富集技術、可信可比的檢測方法和數據分析等，需要建立統一的標準及規范，從而進一步提高ctDNA的臨床應用價值。