血清色氨酸、酪氨酸與阿爾茨海默病之間的關系

任蜀江 敬小鈞 張華

（重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是最常見的神經退行性疾病，也是老年性癡呆最主要的原因，其發生及進展機制目前尚不明確。越來越多的研究表明，代謝物紊亂與AD的發生、發展密切相關［1-4］。在AD的疾病進展過程中，許多代謝途徑受到影響，包括能量代謝、脂質代謝、神經遞質等［5］。腦葡萄糖代謝受損發生在AD認知功能障礙發作前數十年［6-7］。越來越多的證據支持胰島素抵抗可促進AD發病機制的概念，因此，AD可被視為部分由腦胰島素和胰島素樣生長因子抵抗介導的代謝性疾?。?］。為研究代謝物與疾病發生和進展之間的關系，AD代謝組學聯盟（Alzheimer’s Disease Metabolomics Consortium，ADMC）與AD神經成像倡議（Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative，ADNI）合作，正在為ADNI-1隊列中的患者創建一個全面的生化數據庫［8］。

皮質下單胺能系統結構和功能的異常與AD的病理生理學之間有著令人信服的聯系。研究發現，改善單胺能系統，既可以恢復認知功能，又可以減少神經退行性動物模型中與AD相關的病理改變［9-10］。而色氨酸（tryptophan，Trp）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）均為單胺類神經遞質（多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺（5-HT））的前體物質。動物實驗表明，大鼠大腦中單胺能神經元合成神經遞質的速度取決于氨基酸前體色氨酸（用于5-HT）和酪氨酸（用于多巴胺和去甲腎上腺素）的可用性［11］。

色氨酸、酪氨酸均可通過特定的主動轉運系統通過血腦屏障進入大腦［12］。越來越多的研究表明，體外補充色氨酸、酪氨酸有利于認知功能的改善［12-15］。AD的小鼠模型中，攝入Trp-Tyr肽還抑制了小膠質細胞炎癥和β淀粉樣蛋白（Aβ）的累積，從而改善認知能力下降［16］。目前，AD患者血清色氨酸、酪氨酸減少已得到充分證明［17］。

然而，血清色氨酸、酪氨酸是否能作為AD外周生物標志物仍需進一步探討。本研究利用來自ADNI數據庫的實驗數據分析了在認知正常（cognitive normal，CN）組、穩定性輕度認知功能障礙（stable mild cognitive impairments，sMCI）組、進行性認知功能障礙（progressive mild cognitive impairments，pMCI）組和AD所致癡呆組血清色氨酸、酪氨酸水平差異，檢驗了血清色氨酸、酪氨酸對AD是否具有診斷價值，通過簡易精神狀態檢查（mini-mental state examination，MMSE）、阿爾茨海默病評估量表認知分量表（Alzheimer’s disease assessment scale cognitive subscale，ADAS-cog 13）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和18F-氟脫氧葡萄糖正電子發射斷層掃描（18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography，FDG-PET）等數據，分析了血清色氨酸、酪氨酸與腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）核心標志物、認知、腦結構和腦代謝之間的關系。

1 數據來源與分析方法

1.1 數據來源

本文所用數據來自ADNI數據庫（http://adni.loni.usc.edu）。ADNI是一項持續的縱向研究，于2003年啟動，作為公私合作伙伴關系推出，由首席研究員Michael W. Weiner領導。ADNI的主要目標是測試序列MRI、正電子發射斷層顯像（positron emission tomography，PET）、其他生物標記以及臨床和神經心理學評估是否可以結合起來，以測量輕度認知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）和早期AD的進展。ADNI的參與者是從美國和加拿大的59個地點招募。這項研究得到了所有參與機構/研究網站的機構審查委員會的批準。獲得了每個站點所有參與者的知情書面同意。如需更多信息，請訪問http://www.adni-info.org。

在這項研究中，參與者由55~90歲的AD、MCI和健康對照者組成，他們完成了腰椎穿刺、MMSE、ADAS-cog13、臨床癡呆評分（clinical dementia rating，CDR）和MRI。根據ADNI提供的臨床和行為測量，本文選取其中一個隊列（ADNI-1），除了數據庫對CN（n=207）、MCI、AD（n=186）的分類外，本文根據隨訪期間病程是否進展將MCI分為sMCI（n=201）、pMCI（n=171）。

1.2 ADNI數據庫使用的實驗方法

1.2.1 分類標準

CN、MCI或AD癡呆癥的診斷是根據認知評估進行的，具體的納入和排除標準在既往的報告中已有詳細描述［18］。CN受試者沒有記憶力缺陷，而MCI和AD癡呆癥受試者確實有記憶力缺陷。CN的標準包括MMSE評分介于24和30之間，CDR評分為0［19］。MCI的標準包括存在主觀記憶缺陷，MMSE評分在24至30之間，CDR為0.5，日常生活活動保持，無癡呆［20］。除了可能AD的NINCD/ADRDA標準外，AD癡呆患者的MMSE評分在20和26之間，CDR為0.5或1.0［21-22］。本文將sMCI定義為在至少2年的隨訪期間未進展為AD的MCI受試者，將pMCI定義為在隨訪期間的任何時間進展為AD的MCI受試者。排除了在基線時被診斷為MCI但在隨訪期間恢復為CN的受試者，以及在基線時被診斷為AD但在隨訪期間恢復為MCI 的受試者。

1.2.2 血清色氨酸、酪氨酸測定

在隔夜禁食后，在CSF采集前的上午8點采集血液標本，立即放在干冰上，并于同一天運送到賓夕法尼亞大學的ADNI生物標志物核心進行處理。使用Absolute IDQ-p180試劑盒（BIOCRA TES Life Science AG，Innsbruck，Austria）和超高效液相色譜（UPLC）/MS/MS系統，采用靶向代謝組學方法定量測量血清代謝物。AbsoluteIDQ-p180試劑盒已根據歐洲醫藥機構生物分析方法驗證指南進行了充分驗證。氨基酸使用苯基異硫氰酸酯衍生化，并使用AB SCIEX 4000 QTrap質譜儀（AB SCIEX，Darmstadt，Germany）通過液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）進行電噴霧電離分析［23-24］。以μmol/L為單位測量每種代謝物的濃度。

1.2.3 CSF中t-tau、p-tau181測定

使用多重xMAP-Luminex平臺（Luminex Corp，Austin，TX，USA）和Innogenetics INNOBIA AlzBio3免疫分析試劑定量測定CSF磷酸化tau蛋白（phosphorylated-tau at threonine，p-tau）和總tau蛋白（total-tau，t-tau）。有關CSF采集和測量的ADNI方法以及質量控制程序的更多詳細信息，請訪問http://www.adni-info.org。

1.2.4 認知功能評估

受試者的認知功能由MMSE和ADAS-cog13評分評估。所有受試者都進行了5次評分：基線、12、24、36和48個月。

1.2.5 神經影像學方法

MRI協議，包括掃描儀規格、圖像采集和圖像處理，詳見www.adni-info.org。簡而言之，協議包括T1加權MR圖像，包括1.25 mm×1.25 mm平面空間分辨率的矢狀體積3D MPRAGE，1.2 mm厚的矢狀切片，8°翻轉角度，目標TR約為8.9 mm，TE約為3.9 ms［25］。本文使用海馬和腦室體積來表示神經系統退行性病變。選擇了5個時間點的成像數據：基線、12個月、24個月、36個月和48個月。

1.2.6 腦代謝

利用FDG-PET研究腦葡萄糖代謝。ADNI中PET成像數據的獲取和處理參照Lovelace等［26］的描述。注射后30~60 min采集FDG圖像數據，并在預處理后從ADNI網站下載圖像。使用外側和內側前額葉、前扣帶和后扣帶區域以及外側頂葉和外側顳葉的平均計數來估計每個參與者的FDG標準化吸收值比值（standardized uptake value ratio，SUVR）。FDG-PET圖像數據是在基線和12個月、24個月、36個月和48個月時獲得的。

1.3 統計方法

利用方差分析和卡方檢驗分析組間基線人口統計學顯著差異。采用LSD檢驗分別分析色氨酸、酪氨酸各組間差異。Spearman相關性用于分析色氨酸、酪氨酸與其他AD核心標志物之間的關系。使用ROC曲線分析獲得每個生物標記物的總體診斷準確率（曲線下面積，AUC）。使用bootstrap方法分析來自所有兩對不同變量的兩個AUC之間的潛在差異。色氨酸、酪氨酸與AD發病率之間的相關性通過使用調整年齡和性別的比例風險回歸分析計算95%置信區間（CIs）的風險比（HRs）來評估。在進行Cox比例風險回歸分析時，根據每個生物標志物的中位數將血清色氨酸、酪氨酸分為兩組。用線性混合效應模型分別分析血清色氨酸、酪氨酸水平與縱向腦代謝、腦結構和認知的關系。然后將截距（基線值）和斜率（變化率）用作線性回歸模型中的結果，其中分別將色氨酸、酪氨酸作為預測因子（分析血清色氨酸、酪氨酸與腦代謝之間關系時調整年齡、性別；分析血清色氨酸、酪氨酸與腦室容積之間關系時調整年齡、性別、顱內容積；分析血清色氨酸、酪氨酸與海馬體積之間關系時調整年齡、性別、腦室容積及顱內容積；分析血清色氨酸、酪氨酸與認知之間的關系時調整年齡、性別、受教育程度）在診斷組內。所有統計數據均使用SPSS 22版進行。所有分析的統計顯著性定義為P<0.05。

2 結果

2.1 人口統計學結果

本文研究對象的基線人口統計學、生物標志物的差異如表1所示。各組間年齡無明顯差異。各組間性別、受教育年限、APOEε4基因型個體百分比、生物標志物水平、平均MMSE、平均ADAS-cog13、腦室體積、海馬體積和全腦體積均具有顯著差異（表1）。

Table 1 Demographics of subjects at baseline

2.2 血清色氨酸、酪氨酸各組間差異

與CN組相比，AD組（71.03±14.54 ）μmol/L（P<0.01）、pMCI組（69.97±15.66）μmol/L（P<0.001）和sMCI組（72.55±15.72）μmol/L（P<0.05）血清色氨酸水平均顯著低于CN組（74.88±13.7）μmol/L。然而，sMCI組與pMCI組之間以及sMCI組與AD組之間血清色氨酸水平無顯著差異。pMCI組和AD組之間血清色氨酸水平亦無顯著差異。AD組（81.12±18.43）μmol/L（P<0.01）和pMCI組（82.69±17.78）μmol/L（P<0.05）血清酪氨酸水平均明顯低于CN組（86.48±21.19）μmol/L。然而AD組與sMCI組、pMCI組之間，sMCI組與CN組、pMCI組之間無顯著差異（圖1）。

2.3 血清色氨酸、酪氨酸分別與Tau的關系

在CN組（Try，r=0.146，P=0.148；Tyr，r=-0.056，P=0.583）、sMCI組（Try，r=-0.082，P=0.433；Tyr，r=0.049，P=0.644）、pMCI組（Try，r=-0.134，P=0.220；Tyr，r=-0.113，P=0.301）、AD組（Try，r=-0.113，P=0.275；Tyr，r=0.018，P=0.860）中，血清色氨酸和酪氨酸與腦脊液t-tau之間均無顯著相關性（圖2a，c，e，g）。不同診斷組血清色氨酸和酪氨酸與腦脊液P-Tau之間亦無顯著相關性（CN：Try，r=0.149，P=0.140；Tyr，r=-0.066，P=0.514；sMCI：Try，r=-0.092，P=0.378；Tyr，r=0.036，P=0.731；pMCI：Try，r=-0.129，P=0.239；Tyr，r=-0.114，P=0.297；AD：Try，r=-0.123，P=0.234；Tyr，r=-0.020，P=0.844），（圖2b，d，f，h）。

2.4 血清色氨酸、酪氨酸和腦脊液核心標志物對MCI及AD診斷的準確性

進行ROC分析，檢測血清色氨酸、酪氨酸、CSF t-tau和CSF p-tau與sMCI、pMCI和AD臨床診斷的相關性。與CN相比，CSF t-tau和p-tau對sMCI（表2和圖3a）、pMCI（表2和圖3b）和AD（表2和圖3c）有顯著的診斷準確性。血清色氨酸對pMCI（表2和圖3b）、AD（表2和圖3c）有顯著的診斷準確性，而對sMCI（表2和圖3a）無顯著診斷準確性。血清酪氨酸僅對AD（表2和圖3c）具有顯著診斷的準確性，而對sMCI（表2和圖3a）、pMCI（表2和圖3b）均無診斷價值。與單獨的CSF t-tau、CSF p-tau相比，血清色氨酸、酪氨酸分別與CSF t-tau或CSF p-tau的組合能提高對sMCI、AD診斷的準確性（表2和圖3a，c），但沒有統計學差異。與單獨的CSF t-tau相比，血清色氨酸、酪氨酸分別與CSF t-tau的組合能提高對pMCI診斷的準確性（表2和圖3b）。與CSF p-tau相比，血清色氨酸、酪氨酸分別與CSF p-tau的組合并不能提高對pMCI診斷的準確性（表2和圖3b）。

Fig.2 Serum tryptophan and tyrosine in relation to CSF tau

Table 2 AUC of biomarkers

Fig.3 ROC analyses

2.5 血清色氨酸、酪氨酸是否能預測MCI向AD轉化

本文研究了血清色氨酸、酪氨酸是否能預測MCI到AD的轉化。校正性別、年齡和受教育年限后，對作為連續變量的血清色氨酸、酪氨酸進行Cox比例風險回歸。使用血清色氨酸、酪氨酸的中位值作為閾值，計算血清色氨酸、酪氨酸的HRs作為二分變量。結果表明，血清色氨酸、酪氨酸均不能預測MCI向AD的轉化（圖4a，b）。

Fig.4 Baseline serum measures of tryptophan and tyrosine as a predictor of conversion from MCI to AD

2.6 血清色氨酸、酪氨酸與認知功能之間的關系

在各診斷組中，血清色氨酸與基線時的MMSE、ADAS-cog13評分或隨訪期間MMSE、ADAS-cog13的變化率無關（圖5a，b，e，f）。同樣的，血清酪氨酸與基線時的MMSE、ADAS-cog13評分或隨訪期間MMSE、ADAS-cog13的變化率亦無關（圖5c，d，g，h）。

Fig.5 Serum tryptophan and tyrosine in relation to cognition and future cognitive change

2.7 血清色氨酸、酪氨酸與腦結構、腦代謝之間的關系

最后，本文探索了血清色氨酸、酪氨酸與通過MRI測得的腦室容積、海馬體積和通過FDG-PET測得的腦代謝之間的關系。在各診斷組中，血清色氨酸、酪氨酸與基線時的腦室容積、海馬體積沒有相關性（圖6a，c，e，g），與隨訪期間腦室容積、海馬體積的變化率亦沒有相關性（圖6b，d，f，h）。同樣的，血清色氨酸、酪氨酸與基線時的FDG-PET、隨訪期間FDG-PET的變化率均沒有相關性（圖6i，j-l）。

Fig.6 Serum tryptophan and tyrosine in relation to brain structure and FDG-PET

3 討論

本文分析了ADNI-1隊列中血清色氨酸、酪氨酸與AD的診斷、核心生物標志物、腦結構、認知功能及腦代謝之間的關系。分析結果表明：與CN組相比，AD組、pMCI組和sMCI組血清色氨酸水平明顯偏低；與CN組相比，AD組和pMCI組血清酪氨酸水平明顯偏低。在各診斷組中，血清色氨酸、酪氨酸與tau蛋白無相關性。血清色氨酸對pMCI、AD均具有診斷準確性；血清酪氨酸對AD具有診斷準確性。血清色氨酸、酪氨酸均不能預測MCI向AD的轉化。血清色氨酸、酪氨酸與認知功能、腦結構、腦代謝均無明顯關系。

越來越多研究表明，AD是一種代謝性疾病，受影響的代謝途徑包括能量代謝、脂質代謝、氨基酸代謝、神經遞質代謝、激素代謝等［23，27］。色氨酸是必須由飲食供給的必需氨基酸，是5-HT、褪黑素及犬尿氨酸（KYN）的前體物質［10，26-27］。色氨酸主要通過5-HT途徑和犬尿氨酸途徑（KP）分解代謝成多種生物活性代謝物［28］。色氨酸被色氨酸羥化酶（TPH）催化為5-羥基色氨酸（5-HTP），5-HTP經芳香脫羧酶催化產生5-HT。5-HT最終可轉化為褪黑素。KP是色氨酸代謝的主要分解代謝途徑。在吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO-1）或色氨酸2,3-雙加氧酶（TDO）作用下將色氨酸轉化為N-甲?；虬彼?，然后產生KYN、犬尿酸（KYNA）、喹啉酸（QUIN）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）等。5-HT能神經元的缺失與AD的嚴重程度、記憶功能障礙和精神癥狀相關［29］。褪黑素在AD的動物模型中可以防止β淀粉樣蛋白肽的毒性聚集［30-31］。補充褪黑素，可以改善睡眠質量［32］。研究表明，睡眠障礙會導致中老年人AD的患病風險增加［33］。KP的過分激活會導致包括KYNA在內的神經毒性產物在神經膠質細胞中的累積［10］。NAD+在線粒體能量代謝中起著重要的作用［1］。在神經免疫反應期間能量需求大幅增加，故KP是大腦免疫系統的關鍵調節器［34］。色氨酸代謝物還具有影響小膠質細胞和相關細胞因子的能力，以調節引發AD促炎細胞毒性的神經炎癥和神經免疫因子［28］。急性色氨酸耗竭通過降低其前體L-色氨酸的可用性，導致大腦中5-HT合成暫時整體減少［35］。有研究表明，在AD和帕金森?。≒D）的色氨酸耗竭實驗期間，整體認知狀態會降低［36］。

酪氨酸是去甲腎上腺素和多巴胺的前體物質。酪氨酸被限速酶酪氨酸羥化酶轉化為l-3,4-二羥基苯丙氨酸，然后催化成多巴胺。在β羥化酶將多巴胺轉化為去甲腎上腺素。由于酪氨酸羥化酶僅約75%被酪氨酸飽和，酪氨酸的膳食補充可以增加多巴胺和去甲腎上腺素的合成和傳遞［37］。多巴胺和去甲腎上腺素均為兒茶酚胺類神經遞質。去甲腎上腺素可以通過β腎上腺素能依賴性誘導生長因子和p-tau去除直接預防Aβ誘導的毒性作用。在動物模型中，產生去甲腎上腺素和多巴胺的藍斑損傷誘導淀粉樣斑塊周圍的星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生以及細胞因子和促炎因子的釋放?？傊?，AD中的兒茶酚胺能損傷在神經退行性和神經炎癥過程中起著關鍵作用［38］。實驗表明，補充酪氨酸可逆轉應激或認知需求下的認知能力下降［13-15］。小鼠實驗表明含Trp-Tyr的肽可穿透大腦，抑制單胺氧化酶B（MAO-B）活性并增加大腦中的多巴胺（DA）水平，從而預防與年齡相關的認知能力下降［39］。早在1989年，一項針對血漿氨基酸的研究表明，AD患者血漿色氨酸、酪氨酸濃度均低于正常對照組［40］。

本文的分析結果表明，與CN組相比，AD組、pMCI組、sMCI組的血清色氨酸顯著降低，但pMCI與sMCI組、pMCI組與AD組之間無顯著差異。與CN組相比，AD組、pMCI組的血清酪氨酸顯著降低，但CN組與sMCI組之間，sMCI組與pMCI組、AD組之間，pMCI組與AD組之間均無明顯差異。上述結果提示在AD的疾病進展過程中，血清色氨酸、酪氨酸的濃度變化緩慢。目前已有研究結果表明，與正常對照組相比，MCI組及AD組血清色氨酸濃度明顯偏低［41］，AD組血清酪氨酸濃度明顯偏低［17］。本文的分析與之前的研究結果一致，表明血清色氨酸、酪氨酸測定有助于AD的早期診斷。

p-tau和t-tau是公認的生物標志物，廣泛用于AD的早期診斷［42-43］。目前已有大量關于色氨酸、酪氨酸及其代謝產物與AD發病機制之間的聯系的相關研究，但尚無血清色氨酸、酪氨酸對于MCI、AD的診斷價值的相關研究。本文的分析結果表明，血清色氨酸對pMCI、AD具有顯著的診斷準確性，血清酪氨酸對AD具有顯著的診斷準確性。雖然色氨酸、酪氨酸對AD的診斷敏感性明顯弱于p-tau、t-tau。與單獨使用t-tau、p-tau相比，血清色氨酸、酪氨酸分別聯合t-tau或p-tau對AD的診斷準確性提高，提示血清色氨酸、酪氨酸可與AD的核心診斷標志物聯合使用以提高AD的診斷準確性。

多尺度代謝物共表達網絡顯示，色氨酸和酪氨酸與AD的嚴重程度和認知特征顯著相關［44］。AD的代謝網絡分析提示，MCI和AD與色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和嘌呤途徑的重疊擾動模式相關，并表明深刻的生化改變與異常的Aβ42和tau蛋白代謝有關［9］。目前已知在MCI和AD患者中，CSF tau蛋白含量升高，認知功能明顯減退，腦室體積增大，海馬及大腦體積縮小，腦代謝率降低。單胺能神經系統退行性病變與認知功能障礙密切相關［10］。已知色氨酸代謝產物NAD+在線粒體能量代謝中起著重要的作用［1］，因此推測血清色氨酸含量與腦代謝相關，但目前尚無相關研究證明其相關性。在本研究中，血清色氨酸、酪氨酸與tau、認知功能、腦結構、腦代謝之間均無相關性?？赡茉蛉缦拢貉迳彼?、酪氨酸受多種代謝途徑影響；本文未糾正飲食、藥物和APOE4等混雜因素影響。因此，色氨酸、酪氨酸是否能作為AD患者早期診斷生物標志物仍需進一步探討。

4 研究的局限性

首先，ADNI數據庫參與者均為受過高等教育的白人，這可能會導致選擇上的偏差。其次，目前仍不能確定血清色氨酸、酪氨酸水平是否能反映顱內色氨酸、酪氨酸的水平。最后，只有基線是血清色氨酸、酪氨酸水平測定，無縱向比較，不能直接反映疾病發展過程中血清色氨酸、酪氨酸水平的變化。因此，未來還需要在種族、受教育水平多樣化的樣本中，在疾病發展的不同階段采集血液樣本，驗證本文的研究結果，進一步探討疾病的發病機制。

5 結論

sMCI、pMCI和AD患者血清色氨酸濃度均明顯降低，且色氨酸對pMCI和AD具有一定的診斷準確性。pMCI和AD患者血清酪氨酸濃度明顯偏低，且血清酪氨酸對AD具有一定的診斷準確性。由于血清色氨酸、酪氨酸與AD核心標志物、認知功能、腦結構、腦代謝之間均無明顯相關性，血清色氨酸、酪氨酸可能不能作為AD的外周生物標志物。未來，需要將色氨酸、酪氨酸定位為參與AD發病機制的關鍵代謝途徑，為AD治療方面提供新的治療靶點。