外泌體及其在中樞神經系統中的功能*

王子源 白宇軒 曹罡 戴金霞**

（1）華中農業大學生命科學技術學院，武漢 430070；2）華中農業大學，農業微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；3）華中農業大學動物醫學院，武漢 430070）

外泌體（exosomes）是一類由活細胞產生并分泌至胞外直徑約40~160 nm的膜性囊泡，于1983年在培養綿羊網織紅細胞的上清液中被首次發現［1］。早期的研究認為，外泌體是一類負責細胞廢棄物排泄的“細胞碎片”，因此一直未被重視。隨著研究的深入，1996年Raposo等［2］發現抗原遞呈細胞分泌的外泌體膜表面存在著抗原肽-主要組織相容性復合體II復合物（major histocompatibility complex II with antigenic peptide（p），p-MHC-II）和共刺激分子，表明外泌體可以介導細胞間的信息交流。2007年Valadi等［3］發現，小鼠肥大細胞來源的外泌體可以被人肥大細胞吸收并將包含的mRNA翻譯成蛋白質，表明外泌體除包含眾多定位于內體、胞內的蛋白質或質膜受體分子外，還可以裝載如miRNA、mRNA等核酸分子，這一成果為外泌體功能的研究翻開了新的篇章。2011年Lachenal等［4］通過體外原代培養的方式首次找到了胚胎皮質神經元釋放外泌體的證據，提示外泌體在神經系統的功能調節中也發揮著重要的作用。

1 外泌體的生物發生及其組成成分

1.1 外泌體的生物發生

外泌體的自然發生過程涉及到細胞質膜的兩次內陷及多囊泡體（multivesicular bodies， MVBs）的形成，并經由胞吐過程將MVBs內的外泌體釋放至胞外［5］。細胞質膜的第一次內陷過程產生了早期胞內體（early-sorting endosome， ESE），其表面及內部分別含有質膜表面膜蛋白及存在于胞外環境中的可溶性蛋白。早期胞內體可以經質子泵介導的酸化成熟過程而轉變為晚期胞內體（late-sorting endosome，LSE）［6］，并隨后在胞內體膜上發生第二次膜內陷產生多個腔內囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），這些ILVs具有很強的異質性，直徑40~160 nm不等，內容物也不盡相同。此時ILVs膜的拓撲取向與細胞膜完全一致，使其能夠裝載來自胞內的貨物分子。MVBs可以與自噬體或溶酶體融合而降解［7］，也可以經由細胞骨架運輸至細胞質膜附近進而與細胞質膜融合，通過胞吐作用將ILVs釋放至胞外成為外泌體。

目前關于外泌體的生物發生和貨物分選機制存在兩種模型（圖1）。

第一種是依賴于轉運所需內體分選復合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）［7］的過程：首先由ESCRT-0復合體識別內體膜上臨時泛素化修飾的蛋白質貨物并招募ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ復合體進行膜泡出芽，隨后由ESCRT-Ⅱ招募ESCRT-Ⅲ復合體在芽體頸部進行多聚化組裝并通過縊縮使囊泡釋放入胞內體腔中形成ILVs，最后由VPS4、VTA1蛋白組裝成的AAA+-ATP酶通過水解ATP供能的方式使ESCRT-Ⅲ復合體解聚并回收再利用。在蛋白質貨物最終分選進入ILVs的過程中，由ESCRT-Ⅲ復合體招募的一種泛素異肽酶AMSH（associated molecular with SH3 domain of STAM）催化的蛋白質去泛素化過程至關重要［8］。在ESCRT途徑中，ESCRT-0亞基成分Hrs、STAM1，ESCRT-Ⅰ亞基成分Tsg101，ESCRT-Ⅲ亞基成分CHMP4，VPS4、VTA1以及ESCRT相關蛋白ALIX參與了MVBs的形成和外泌體的發生調節［9-11］。Tsg101、Vps4和ALIX介導了蛋白質或miRNA貨物加載到外泌體的調節過程［12-14］。

第二種模型是ESCRT非依賴性的，由脂筏和神經酰胺誘導的內體膜出芽和貨物分選途徑。在這種模型中，胞內體表面的膜蛋白向膜內富含膽固醇、鞘磷脂和GPI錨定蛋白的脂筏結構域的轉移使胞內體膜在局部形成彎曲和出芽，并進一步通過向脂筏的摻入使這些蛋白質貨物分選進入ILVs中［15］，最后通過外泌體釋放至胞外。除脂筏成分外，鞘磷脂酶催化產生的鞘磷脂代謝產物神經酰胺也可以參與誘導MVB膜的出芽［16］及miRNA向ILVs的裝載過程［17］。此外，同樣為鞘磷脂代謝產物的鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S-1-P）也可以作為信號分子激活S-1-P受體，再通過激活小分子GTP結合蛋白Ras超家族中的Rho蛋白亞家族成員Cdc42和Rac1誘導微絲蛋白在胞內體膜上的聚合來促進貨物的分選和MVBs的形成［18］。

關于MVBs的定向運輸和外泌體釋放調控機制的研究也是近年來外泌體研究領域的熱點問題。最新研究表明，參與MVBs靶向質膜運輸的小分子GTP結合蛋白Ras超家族的Rab蛋白亞家族成員如Rab11a、Rab27A/B、Rab37、Rab39等［19-20］和介導囊泡與靶膜融合過程的可溶性NSF連接蛋白受體（soluble NSF attachment protein receptor， SNARE）復合物［21］在外泌體分泌的時空調節和分泌量的調節過程中發揮了關鍵作用。

1.2 外泌體的基本組成成分及功能

1.2.1 核酸成分及其功能

外泌體中含有來源細胞特異性的mRNA和大量非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），這是外泌體與其他囊泡最大的區別。早期研究發現，外泌體中的轉錄本與外泌體供體細胞中的各種轉錄本豐度存在差異［3］，表明RNA進入外泌體的過程受到某些分選機制的調節。外泌體中包含的mRNA轉錄本通常是具有功能的，可以通過轉移至受體細胞中進行蛋白質翻譯，從而影響受體細胞的轉錄組和蛋白質組狀態，產生不同的表型。外泌體中的非編碼RNA包括微RNA（micro RNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等。外泌體的miRNA可以參與受體細胞內基因表達的轉錄后調控過程，對細胞和組織狀態具有廣泛的調節作用。例如，含有miR-132的外泌體可以轉移至腦血管的內皮細胞中來調節血管的完整性［22］，在外周神經元受損后分泌的miR-21可能有助于神經元與巨噬細胞間的通訊，調節炎癥反應促進神經修復再生過程［23］。

除RNA外，外泌體也可以隨機或選擇性地包含一些DNA片段。通常，外泌體中包含的DNA片段較短，但現在發現也可以包含長達數千堿基長度的DNA序列。外泌體中的DNA片段可以調節細胞內穩態、腫瘤發生、腫瘤治療和免疫記憶等過程。例如細胞可以通過分泌外泌體的方式去除胞質中有害的DNA片段，從而避免胞質中因DNA積累導致的cGAS-STING信號通路激活而誘導衰老樣細胞周期停滯或細胞凋亡，進而維持細胞內穩態［24］。外泌體DNA還可以在腫瘤發生和腫瘤治療中發揮重要作用，腫瘤細胞可以通過外泌體分泌一些腫瘤特異性突變的DNA片段，通過轉移這些DNA元件產生外周細胞突變庫［25］，而在放療法治療腫瘤的過程中，腫瘤細胞的細胞質中會積累DNA片段并通過外泌體釋放，免疫細胞如樹突狀細胞可以攝取這些含DNA片段的腫瘤細胞外泌體，激活胞內的cGAS-STING信號通路，刺激IFN-1的產生并募集更多的CD8+T淋巴細胞以殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長［26］。一項最新研究表明，抗原遞呈細胞可以通過分泌外泌體向T淋巴細胞中轉移端粒DNA和Rad51重組因子，從而延長T淋巴細胞染色質的端粒長度使其免于衰老并促進長期免疫記憶［27］。通過外泌體在細胞間轉移DNA可能是一種普遍性的機制，關于其分布、功能和生物學意義值得進一步探索和研究。

1.2.2 標志性蛋白質成分及其功能

目前發現并收錄在ExoCarta數據庫［28］中的外泌體蛋白質達到了9 769種，其中包括細胞質膜蛋白、胞質蛋白、內質網相關蛋白和高爾基體相關蛋白等。不同細胞的外泌體發生途徑基本一致，其中大多數外泌體蛋白均與外泌體發生途徑相關，因此這些蛋白質為不同細胞分泌的外泌體所共有，也常被作為標志物來對外泌體進行檢測和鑒定。

外泌體腔內最常見的一類蛋白質是小分子GTP結合蛋白Ras超家族的Rab蛋白亞家族成員，負責調節內體的運輸和膜融合過程。除Rab蛋白外，外泌體還含有許多內體相關蛋白（endosomeassociated protein），這與MVBs的形成、外泌體蛋白貨物分選和裝載過程密不可分。外泌體膜上也存在著豐富的膜蛋白［29］：如協助跨膜運輸和膜融合的膜聯蛋白（annexin），包括膜聯蛋白I、II、IV、V、VI、VII、IX；表面黏附分子如整合素（integrin）和四跨膜蛋白超家族（tetraspanin family），如CD9、CD63、CD81等［30-31］；以及溶酶體相關膜蛋白（lysosomal-associated membrane protein，LAMP）等。除了上述經典的外泌體標志蛋白質外，一項新的研究發現，含EWI基序的免疫球蛋白超家族（IGSF8和PTGFRN）以及MARCKS蛋白質家族（MARCKS、MARKCSL1和BASP1）也在外泌體膜上大量富集［32］，這些蛋白質的富集程度遠高于一直以來被作為外泌體標志物的四跨膜蛋白家族。另一項新的研究通過定量蛋白質組學方法分析了不同類型人源細胞系外泌體的核心蛋白組，發現syntenin-1的豐度在不同來源的外泌體中始終處于最高水平［33］，這表明syntenin-1蛋白有潛力被作為一種新的外泌體通用標志物。此外，外泌體中常見的非特異蛋白成分還包括各種代謝類酶、核糖體蛋白、一些信號轉導因子、細胞骨架蛋白和泛素分子等，它們可能是通過非特異性分選機制被隨機裝載進入外泌體的細胞質成分，或是在特異性分選過程中發揮“標簽”作用的物質如泛素分子。

1.2.3 神經外泌體的特征性內容物

除了前兩節中所述外泌體含有的基本核酸或蛋白質成分外，由中樞神經系統的細胞如神經元和神經膠質細胞分泌的神經外泌體還含有一些特征性的內容物成分。例如：由神經元分泌的外泌體可以載有如神經肽類遞質、人突觸囊泡蛋白（synaptotagmin-4，Syt4）、AMPA型谷氨酸受體亞基、Wnt蛋白、細胞骨架調節蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein，Arc）等多肽或蛋白質成分，以及ARCmRNA、miR-218-5p、miR-132-5p、miR-690等核酸成分；由神經膠質細胞分泌的外泌體可包含如fiblulin-2、載脂蛋白 D（apolipoprotein-D，Apo-D）、熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）、synapsin I膜蛋白等蛋白質成分以及N-花生四烯酰乙醇胺（N-arachidonoyl ethanolamine，AEA）和2-花生四烯酰甘油（2-arachidonoylglycerol，2-AG）等內源性大麻素成分。關于上述神經外泌體特征性成分參與的生理功能將會在第3部分展開敘述。

2 神經外泌體與突觸囊泡的比較

在生理或病理狀態下，神經系統中的各類細胞如神經元和神經膠質細胞均可分泌外泌體，這些外泌體可以統稱為神經外泌體。神經外泌體不僅存在于神經元與神經元的突觸接頭間，也廣泛存在于腦脊液中。神經外泌體與神經元的突觸囊泡（synaptic vesicle，SV）在形成、內容物成分及裝載機制上存在許多相似和差異之處（圖2），下面就這些方面展開比較。

Fig.2 Comparison of biogenesis and release of synaptic vesicles and neural exosomes圖2 突觸囊泡與神經外泌體在生物發生和釋放方面的比較

2.1 神經外泌體與突觸囊泡在生物發生上的差異

神經元中的SV在突觸前膜處通過質膜的內吞作用產生，并在突觸前膜反復回收再利用。目前，SV的發生過程有3種模型。a.“吻-逸”模型［34］：動作電位傳導至突觸前膜，觸發SV與突觸前膜融合形成瞬時融合孔，在內容物被部分或完全釋放后可迅速關閉融合孔并回到胞質，使SV更新。b. 網格蛋白介導的內吞作用［35］：SV與突觸前膜完全融合后，其成分可通過網格蛋白依賴性內吞作用重新回收，并轉移至突觸胞內體（synaptic endosome），并從胞內體再次出芽后通過SV表面的神經遞質轉運蛋白對內容物進行更新。c. 活性依賴性的大型內吞作用［36］：即突觸在受到強烈刺激后，大片突觸前膜通過形成深凹陷直接進行成團性內吞作用，在胞內形成瞬時的巨大胞內體（bulk endosome）結構，并在末端迅速通過出芽形成新的SV并裝載新合成的神經遞質。

外泌體的發生同樣起源于內吞途徑，以胞內體作為周轉的“樞紐”。但其內吞形成的早期內體會再次發生凹陷，產生ILVs，然后成熟為MVBs。在這個過程中，蛋白質、核酸和其他生物活性分子被包裝在ILVs中。隨后與突觸前膜質膜融合的MVBs釋放腔內的ILVs，成為神經外泌體。

2.2 神經外泌體與突觸囊泡在內容物裝載機制上的差異

SV的生物發生過程和內容物裝載是分步進行的，且其內容物裝載是主動的耗能過程：回收的SV首先通過V型H+-ATP泵的活化而重新酸化，在囊泡內外形成H+電化學梯度，SV表面的神經遞質轉運蛋白利用這種梯度將神經遞質分子轉運至腔中，導致SV內容物的快速再填充［37-38］。

與SV不同，外泌體的生物發生過程與內容物裝載是同步進行的，且內容物可以通過ESCRT依賴或非依賴的途徑主動或被動地轉移到ILVs中。在ESCRT途徑中，如前所述，ESCRT-0與泛素化的待分選蛋白結合，并與ESCRT-I、II、III形成ESCRT復合物，介導ILVs內的蛋白質裝載和囊泡出芽過程［7］。除主動裝載外，MVBs膜上的四跨膜蛋白家族還可以與其他蛋白質互相作用，促進后者以不依賴于ESCRT的方式被動裝載到ILVs中。例如有研究發現，金屬蛋白酶CD10可以通過與CD9結合而被分選進入外泌體中，起到調節細胞外基質微環境的作用［39］。此外，一些具有特定基序的miRNA可以通過與分選入ILVs中的RNA結合蛋白，如AGO2的結合被選擇性地裝載到外泌體中分泌［40］。

2.3 神經外泌體與突觸囊泡釋放的異同

外泌體的釋放主要取決于MVBs與突觸前膜的融合，這個過程同所有膜泡靶向運輸一樣需要可溶性NSF連接蛋白受體（soluble NSF attachment protein receptor，SNARE）的參與［21］。研究發現，神經外泌體與SV的釋放過程存在一些相似之處：SV表面的v-SNARE蛋白synaptobrevin［21］和MVB表面的v-SNARE蛋白cellubrevin［41］均通過與突觸前膜上的t-SNARE蛋白（包括syntaxin和SNAP家族）形成SNARE復合物，從而將囊泡錨定在突觸前膜處并促進膜融合而釋放內容物［42-43］。在MVB靶向運輸和突觸前膜錨定的過程中，Rab GTPases（如Rab11、Rab27、Rab35和其他Rab家族成員）也起到了重要作用［19-20］。此外，正如SV膜上存在的突觸結合蛋白（synaptotagmin）作為“Ca2+傳感器”在誘導SNARE復合物解鎖和SV釋放過程發揮調控作用，使SV的量子式釋放依賴于動作電位傳導引發突觸前膜處產生的Ca2+內流［44］，神經細胞內的MVB膜上也同樣存在著突觸結合蛋白synaptotagmin-7作為“Ca2+傳感器”觸發MVB與質膜融合［45］，從而釋放神經外泌體。此前的研究表明，阻斷神經元質膜上的離子型谷氨酸受體（如AMPA受體和NMDA受體）會抑制神經元外泌體的釋放［4］，這也印證了神經外泌體的釋放是受到突觸內Ca2+濃度調控的過程。

綜上所述，神經外泌體的釋放和SV與突觸前膜的融合都依賴于軸突的電生理活動和Ca2+的釋放，但神經外泌體是以囊泡形式存在于胞外且釋放和作用的范圍更加廣泛。相比之下SV則是特化的、專一于突觸接頭處的“電-化學-電”信號轉換過程且僅存在于突觸前膜胞內的一種囊泡結構。

3 神經外泌體的功能

在中樞神經系統中存在著兩類信號傳遞方式：布線傳遞（wiring transmission）和容積傳遞（volume transmission）。其中布線傳遞是細胞與細胞間點對點的精確聯系，常通過化學突觸或電突觸的形式建立，神經元外泌體也在其中發揮了有限的作用。而容積傳遞是一種突觸外滲漏的傳遞系統，以腦脊液或細胞外基質為媒介進行的遠距離、彌散性的信息傳遞方式，其中神經元及神經膠質細胞的外泌體發揮了主要且關鍵作用［46］。

在信息或物質傳遞過程中，外泌體可以通過3種方式與受體細胞相互作用［47］：a. 通過與靶細胞質膜結合，激活特定的信號轉導過程；b. 通過受體介導的內吞途徑重新回到作為周轉“樞紐”的胞內體，走向被溶酶體降解或與胞內體膜融合而釋放內容物的命運；c. 外泌體直接與靶細胞質膜發生融合，釋放蛋白質或核酸內容物進入胞質發揮調節功能。

神經外泌體的釋放和作用范圍廣泛，其功能也十分多樣。神經外泌體可以像傳統神經遞質那樣介導神經沖動的傳遞，也可以通過外泌體膜和腔內裝載的各種蛋白質或mRNA及miRNA貨物介導細胞間傳遞信息或調節細胞生理狀態。神經外泌體還在神經損傷、神經再生及神經退行性疾病等病理過程中發揮了重要作用。接下來將就神經外泌體這些方面的功能展開綜述。

3.1 神經元外泌體介導的神經沖動傳遞

SV內的神經遞質依種類和受體類型與分布的不同，可以直接與突觸后膜的離子型受體（ionotropic receptor）結合調節離子跨膜流動，或與代謝型受體（metabotropic receptor）結合并通過激活信號轉導產生胞內第二信使間接影響離子通道。目前的證據表明，神經元外泌體可以通過激活代謝型而非離子型受體介導突觸后膜的電生理反應，并可能在其間扮演著“非經典神經遞質”的作用［48］。我們認為這與外泌體的結構和組成成分是相關的：能夠激活離子型受體的神經遞質往往是乙酰膽堿、氨基酸或胺類等水溶性小分子物質，外泌體的脂雙層膜性囊泡結構決定了這些分子只可能裝載于外泌體腔內，而研究發現神經肽類神經遞質具有能夠與膜脂結合的特性［49］，因此有可能通過結合在外泌體膜上并激活突觸后膜的代謝型受體來引發較為持久的突觸后反應。

本文以神經肽遞質為例，提出一種通過外泌體介導的突觸間信號傳遞的機制模型：先前釋放的神經肽類遞質可能會部分地與突觸前膜表面結合并經內吞作用轉移至胞內體，最后重新出現在新生ILVs（外泌體）膜的外表面。當突觸接收到軸突傳導來的電位信號后，這些神經元外泌體以Ca2+依賴的方式從突觸前膜大量釋放，其表面可能存在的神經肽類遞質或其他可激活G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）的配體分子便可以通過與神經元外泌體共分泌的方式結合并活化突觸后膜上的相應代謝型受體，并通過激活G蛋白直接與離子通道作用產生興奮或抑制性突觸后電位，或通過第二信使及其下游的信號通路來介導如調節突觸后膜受體數量、改變離子通道狀態或誘導神經元內基因表達等長時程的反應。

3.2 神經外泌體的神經調質樣功能

3.2.1 神經元外泌體的調質樣功能

神經元分泌的神經外泌體除了可以引發突觸后膜的電生理反應外，還可以通過膜結合激活信號傳導或膜融合釋放內容物進入上游或下游神經元的胞質發揮類似神經調質的功能。其中，外泌體介導的Syt4跨突觸傳遞可增強突觸的生長和突觸前膜遞質的釋放［50］，而AMPA型谷氨酸受體亞基的轉運則可進一步促進接受外泌體的神經元興奮性的增強［4］，神經元釋放的外泌體攜帶的Wnt配體也可以補充激活Wnt信號通路，從而幫助調節突觸組裝、神經遞質釋放和突觸的重塑過程［51］。此外，近年來有幾項研究同時表明，在果蠅或如小鼠、人類等哺乳動物的神經元外泌體中含有的細胞骨架調節蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein，Arc）可以通過自組裝形成病毒衣殼樣的結構并封裝編碼自身蛋白的ARCmRNA或非特異性地封裝其他胞內的高豐度mRNA，并跨越突觸接頭在細胞之間進行運輸，以介導突觸成熟和活性依賴的突觸可塑性調節過程［52-53］（圖3）。

Fig.3 Summary of neuromodulator-like function of glial exosomes圖3 神經膠質細胞外泌體的神經調質樣功能總結

3.2.2 神經膠質細胞外泌體的調質樣功能

神經膠質細胞分泌的外泌體主要對神經元或中樞神經系統內的其他膠質細胞起到支持和調節作用（圖3）。星形膠質細胞（astrocyte）是中樞神經系統中分布最多且最普遍的膠質細胞類型，是中樞神經系統微環境的主要調節者和重要組成部分。星形膠質細胞在生理條件下分泌的外泌體表面攜帶的fibulin-2蛋白可以通過介導激活神經元中的TGF-β信號通路促進樹突棘和突觸的形成［54］。而在病理狀態下，星形膠質細胞分泌的外泌體中包含的載脂蛋白D（Apo-D）和熱休克蛋白（HSPs）可在神經元遭受氧化應激等不利于自身條件的狀況時，起到保護神經元的作用：Apo-D可以促進細胞存活并保護神經元功能的完整性［55］；HSPs除了通過發揮分子伴侶作用穩定未折疊蛋白并促進錯誤折疊蛋白降解來維持細胞內環境的穩定外，還可能通過與一些促凋亡蛋白結合，從而破壞凋亡復合物的形成以抑制細胞凋亡［56］。在神經元過度激活或氧化應激的情況下，星形膠質細胞分泌的外泌體表面會攜帶synapsin I膜蛋白，并通過調節神經膠質細胞和神經元之間的相互作用來促進神經突的生長和神經元存活［57］。此外，一項新的研究表明，星形膠質細胞分泌的外泌體還可以通過激活Nrf2信號通路來減少氧化應激和外傷性腦損傷（traumatic brain injuries，TBI）所誘導的神經元凋亡［58］，對中樞神經系統起到保護作用。

小膠質細胞（microglia）分泌的外泌體膜表面攜帶并富集N-花生四烯酰乙醇胺和2-花生四烯酰甘油等內源性大麻素（eCBs），以幫助這些脂溶性信號分子更好地在胞外的水溶性環境中擴散，并作用于靶細胞表面的相應eCB受體來抑制突觸前膜釋放γ氨基丁酸或谷氨酸神經遞質，從而改變興奮性突觸的密度和強度，調節突觸活動和可塑性［59］。此外，小膠質細胞外泌體還在神經退行性疾病的發生和發展中起到了重要作用，這將在下一節進行綜述。

少突膠質細胞（oligodendrocyte）分泌的外泌體主要參與對神經元軸突的營養、保護及神經沖動的增強。研究發現少突膠質細胞分泌的外泌體可以被神經元攝取并產生多種效應，如增加動作電位產生的頻率，保護神經元免受氧化應激和饑餓并維持該條件下神經元軸突的運輸能力等功能［60-61］。

3.3 神經外泌體與神經系統疾病

3.3.1 外泌體促進神經退行性疾病中的作用

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是最常見的一類與年齡相關的神經退行性病變，其病理特征主要是β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）導致的淀粉樣斑塊沉積和Tau蛋白過度磷酸化導致的神經原纖維纏結。有研究發現，淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）及其加工產物和Aβ蛋白可以通過神經元外泌體分泌至胞外［62-63］，且外泌體中上述蛋白質的豐度與其在大腦中的含量呈正相關［64］。研究發現，抑制AD模型小鼠腦中神經元外泌體的分泌可以顯著減少淀粉樣斑塊的出現［65-66］，這表明異常的神經元釋放的外泌體可以作為毒性蛋白Aβ蛋白運輸的載體促進其在腦組織中的擴散分布［67］，或通過類似朊病毒的“播種”作用［68］來啟動Aβ聚集物的形成從而促進淀粉樣斑塊的形成和AD的發展。此外，還有研究發現，Aβ蛋白可以刺激星形膠質細胞分泌富含神經酰胺和前列腺凋亡反應蛋白4（proapoptotic ceramide and prostate apoptosis response 4，PAR-4）的外泌體，并通過誘導附近膠質細胞的凋亡來促進AD的發展［69］。不過也有研究發現，富含鞘糖脂的外泌體可以通過捕獲腦內的Aβ蛋白并通過小膠質細胞的攝取清除來減輕對細胞的毒害作用［70］，顯示出這些神經外泌體在延緩AD病程進展方面也存在著一定程度上的積極作用。Tau蛋白與外泌體的作用關系與Aβ相似，研究發現，小膠質細胞可以通過對受損神經元的吞噬作用和外泌體的分泌來促進異常Tau蛋白在神經元之間的傳播［71］，而通過消耗小膠質細胞或抑制外泌體分泌可以顯著抑制異常Tau蛋白的傳播［72］，這提示小膠質細胞神經外泌體的分泌調控或許可以作為AD治療中一個重要的新靶點。

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）也是一種常見的神經退行性疾病，其主要的病理特征是α突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）在神經元中的異常積累和聚集形成包涵體（路易小體）。研究發現，異常的神經元可以釋放含有α-syn寡聚物的外泌體［73-74］，導致這些錯誤折疊的蛋白質聚集體在神經元間廣泛傳播擴散，可能在促進PD發生和誘導大面積神經元死亡方面起到了關鍵的作用。之前的研究已經表明，小膠質細胞在PD等神經退行性疾病中起到了復雜的調控作用：一方面通過吞噬死亡的神經元清除錯誤折疊的α-syn聚集體以維持多巴胺能神經元的正常存活，另一方面其過度的激活和慢性增生也可以引發腦部的炎癥應激反應進一步誘導神經元的損傷和死亡［75］。最近一項研究發現，小膠質細胞分泌的外泌體也在促進PD發生過程中起到了重要的作用，即小膠質細胞分泌的CD11b+外泌體中存在著α-syn寡聚物，當這類外泌體被神經元攝取時可以顯著誘導受體神經元內發生α-syn的聚集并導致神經元的變性［76］。

關于外泌體與神經退行性疾病的發生和發展的研究還存在著許多尚未解決的問題，例如神經外泌體是通過何種機制分選富集Aβ、Tau蛋白和α-syn寡聚物分子？含有這些異常成分的神經外泌體在疾病的發生、發展和轉歸方面還通過何種方式發揮了哪些積極或消極的作用？除上述內容物外，外泌體中還有哪些內容物參與到了神經系統退行性疾病的發生和發展？相信這些問題的深入研究和解決將會為神經退行性疾病的預防和治療提供新的思路和作用靶點，也將進一步推動神經外泌體相關領域的研究。

3.3.2 外泌體與抑郁癥發生的相關性

抑郁癥是一種情緒障礙性精神疾病，對人類的身心健康具有嚴重的危害。最近的研究發現外泌體在抑郁癥的發生和發展中發揮了關鍵的作用，這為研究抑郁癥的發生和抑郁癥的臨床治療提供了全新的角度和作用靶點。

研究發現，富含神經酰胺的外泌體可在應激時通過中性鞘磷脂酶2（sphingomyelinase 2）作用大量釋放到血漿中，并通過抑制海馬中磷脂酶D的活性降低海馬中的磷脂酸含量，進而介導應激誘導的抑郁癥的發生［77-78］。此外，外泌體中的miRNA內容物也在抑郁癥的發生和發展中發揮著重要功能，研究表明外泌體來源的miR-139-5p豐度上調可能通過負調節神經元分化抑制了海馬神經元的發生并誘導了應激狀態下抑郁癥的發生［79-80］，該研究還發現來源于重度抑郁患者的外泌體經尾靜脈注射可誘導健康小鼠產生抑郁樣行為［79］，這進一步說明誘導抑郁的相關因子可以借助外泌體進行傳遞和擴散。

最新一項研究指出，腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）可通過突觸釋放誘導下游神經元上調miR-218-5p、miR-132-5p和miR-690在外泌體中的分選富集［81］，這種BDNF誘導的外泌體可以上調受體神經元中有關神經發育、膽固醇合成和軸突引導相關的基因，同時下調突觸發生負調節因子等基因，這對于神經元突觸活性增強和密度增加、樹突形成以及神經環路的建立與維護等過程至關重要。本課題組發現，其中的miR-132和miR-218與抑郁樣行為的發生和調節關系密切：有研究表明慢性的輕度壓力能夠下調甲基化CpG結合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）和BDNF的表達并增加miR-132的表達水平［82］，臨床和相關實驗也表明，miR-132的高水平表達與抑郁癥的發生密切相關［82-84］；而miR-218被發現可以調控個體對壓力的易感程度且與抑郁樣行為呈負相關關系［85-87］，前額葉皮層中miR-218的下調會導致小鼠更容易誘發抑郁樣行為，而miR-218的過表達則可以防止因應激誘導的神經元形態學改變，促進抑郁樣行為的恢復。

綜上所述，我們猜想BDNF誘導的外泌體可能在抑郁癥的易感性調節中發揮了一定的作用。此外，也提出以下問題：慢性的輕度壓力所引起的BDNF表達下調是否會降低受其誘導的外泌體對miR-218-5p、miR-132-5p和miR-690的分選富集？這種機制的削弱或喪失是否在抑郁癥的發生和發展中發揮作用？希望以上這些問題能夠在后續的研究中得到解答。

4 外泌體在中樞神經系統疾病診斷和靶向治療方面的應用

4.1 神經外泌體與中樞神經系統疾病的診斷

神經外泌體參與了多種神經退行性疾病的發生和進展，其中包含的一些標志性蛋白質或miRNA內容物可以靈敏地反映中樞神經系統中外泌體來源的親本細胞的病理狀態。更重要的是，研究表明，外泌體可以通過腦微血管內皮的轉胞吞作用（transcytosis）而跨越血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）［88］分布于外周體液。例如，有研究發現，血漿神經源性外泌體中溶酶體相關膜蛋白1（LAMP-1）和組織蛋白酶D（cathepsin D）的水平升高與AD的發生有著顯著的相關性［89］，也有研究通過檢測血漿中神經元外泌體所含的α-syn寡聚物來進行PD的早期診斷或作為PD進展的預后標志物［90］。上述特點和相關研究表明，外周血中含有的神經源性外泌體能夠與中樞神經系統的組織細胞狀態具有強烈的相關性。因此，通過提取外周血中的外泌體并對其包含的miR-125b-5p、miR-19b、miR-454-3p等標志性miRNA［91-92］使用微陣列（microarrays）或逆轉錄PCR（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）進行檢測［91］，或對其中包含的Aβ、α?syn、L1CAM、TIMP-1等蛋白質標志物通過免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）或ELISA進行檢測［93］，可對PD［94］、AD［95-96］等中樞神經系統的退行性疾病或神經膠質瘤［97］等腫瘤疾病進行早篩和診斷。關于這些神經系統疾病診斷中具體的外泌體檢測指標及其效率的問題已經在相關文獻中做了具體描述，詳細內容可參考上述引用文獻做進一步了解?？偟膩碚f，將外周血中存在的神經外泌體作為樣本進行檢測，其最大優點就在于可以繞開組織活檢或外科干預手段可能存在的困難和風險，能夠在降低成本的同時實現更加快捷而準確的診斷。

4.2 中樞神經系統疾病的外泌體靶向治療

除了臨床診斷外，由于外泌體具有較大的內容物裝載能力和良好的組織相容性以及跨越BBB進入腦部組織的能力，有望利用工程化的外泌體作為一種全新的遞送載體，通過主動或被動、直接或間接的方式向外泌體腔中裝載治療性的核酸、蛋白質或小分子化學藥物，同時通過在外泌體標志膜蛋白的外側修飾具有受體細胞靶向性的配體肽［98-99］，以取代如腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）等病毒載體、納米顆粒（nanoparticle）或脂質體（liposome），可以進行更高效、更安全的藥物腦部靶向遞送。在眾多裝載方法中，間接載藥是最具潛力的方式之一。這種方法是通過對外泌體來源的親本細胞進行工程化改造使分泌的外泌體自然攜帶具備治療目的的藥物分子，通過將外泌體標志性膜蛋白如PTGFRN、BASP1［32］或四跨膜蛋白如CD9［100］、CD63［101-102］與貨物蛋白（這些蛋白質可以是激活免疫的配體分子如IL7、CD40L等［32］，或RNA結合蛋白如HuR［100］、AGO2［103］、L7Ae［102］等）進行融合表達，能夠顯著提高外泌體對貨物蛋白或治療性RNA分子的特異性富集和裝載能力。

目前的研究表明，以外泌體為遞送載體的新型藥物遞送工具及靶向治療方式有望為神經退行性疾病、抑郁癥、腦部腫瘤等多種中樞神經系統疾病提供全新的且更加有效的臨床治療策略。例如：裝載有神經生長因子（nerve growth factor，NGF）并修飾RVG配體肽的工程化外泌體可以特異性靶向發生缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke）的受損大腦皮層，通過NGF的作用減輕腦卒中后的炎癥反應并促進神經元存活［104］；通過超聲波共孵育方法裝載槲皮素（quercetin，Que）的血漿外泌體施用后可以跨越血腦屏障靶向大腦，通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5）介導的Tau磷酸化過程減少神經原纖維纏結的形成而有效緩解AD的臨床癥狀［105］；通過間接載藥方式裝載有過氧化氫酶mRNA的工程化外泌體靶向腦部的遞送能夠有效緩解PD引起的神經炎癥［102］；向腦部遞送裝載有環狀RNA分子circDYM的工程化外泌體可以通過小膠質細胞的攝取釋放其內容物，并與受體細胞中的轉錄因子TAF1的結合導致下游靶基因表達降低，進而抑制小膠質細胞的異?；罨?，有效緩解抑郁樣行為［106］；施用表面修飾有c(RGDyK)環多肽并裝載紫杉醇（paclitaxel，PTX）的胚胎干細胞來源的工程化外泌體能夠顯著提高PTX向腦部的靶向能力并改善其對膠質母細胞瘤的治療效果［107］。

5 總結與展望

外泌體在發現早期被認為是一類細胞排泄代謝廢物的方式。隨著研究的深入，人們逐漸發現，外泌體是只有活細胞才能分泌的功能性亞細胞囊泡結構，它可以通過膜上存在的配體分子與靶細胞膜上受體相互作用，或通過其胞內攜帶的核酸及蛋白質內容物實現細胞間的物質和信息交流，來調節靶細胞的生理狀態。如今，外泌體的發生機制已經基本厘清，但其調控過程仍存在許多未知。例如：細胞分泌釋放外泌體的過程是否存在極性以及這種極性是如何控制的？細胞通過何種方式調節外泌體分泌的強度？細胞如何精確調控不同生理或病理狀態下對于外泌體蛋白或核酸內容物的分選包裝？隨著多組學技術的發展和測序技術的迭代更新，這些問題有望得到進一步研究和解決。

從首次證明神經元具有分泌外泌體的功能到現在的十余年間，神經外泌體的發生、釋放和功能得到了相對全面的研究。目前的研究表明，神經外泌體在發生、釋放和功能方面與SV存在著許多相似和不同，因此將兩者進行比較可以為人們更好地理解和研究神經外泌體的組成和功能提供新的視角和思路。近年來對于神經外泌體功能的研究表明，神經外泌體可以在化學突觸接頭的信號傳導中發揮類似神經遞質的作用，但最主要的還是通過容積傳遞（即突觸外滲漏傳遞）的方式介導神經元與膠質細胞、膠質與膠質細胞間的互相作用。因此，對神經外泌體成分和分泌時空調節的進一步研究將有助于更好地理解神經外泌體在神經環路的建立、維持以及在中樞神經系統微環境調節方面的功能。

諸多證據和跡象表明，神經外泌體在眾多神經系統疾病的發生和發展中發揮著重要的作用。因此，對于病理狀態下神經外泌體特異性成分和功能的進一步研究將有助于人們尋找神經系統疾病治療中的新靶點，同時也將為開發以血漿神經元源性外泌體為檢測對象的更加準確靈敏的新型神經系統疾病診斷工具提供更多的思路。此外，隨著靶向遞送治療方法的不斷開發和應用，對外泌體進行工程化的改造和作為藥物遞送工具的相關研究也將進一步發掘以外泌體為載體的新型靶向遞送工具的臨床治療潛力和應用價值。