藏藥翁布對潰瘍性結腸炎的作用機制研究

李新蕊,陳海娟,2*,高禹涵,徐 麗

1青海師范大學生命科學學院 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室;2高原科學與可持續發展研究院,西寧810008

翁布為傳統藏藥,其來源為檉柳科水柏枝屬(Myricaria)多種植物的嫩葉[1],廣泛分布于西藏、青海、云南等地?，F代研究表明,翁布的主要化學成分為黃酮類和多酚類化合物[1],藥用部位為嫩枝,青綠色,其性平,味澀微苦,治黃水病、內腔毒熱、發散透疹,用于瘟疫、血熱、中毒熱證,麻疹不透及咽喉腫痛等癥[2]?！熬昧　钡幕静C是脾虛濕熱蘊結,氣血不和,而“血熱”是潰瘍結腸炎活動期的重要致病因素[3]?，F代藥理學研究表明翁布還具有抑菌、抗炎鎮痛、抗風濕、抗疲勞和抗氧化等作用[4]。

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因尚未完全清楚的結腸慢性炎癥疾病,病變局限于大腸黏膜及黏膜下層[5],主要癥狀為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等[6],且病情易復發、遷延難愈[7]。免疫抑制劑、皮質類固醇激素和氨基水楊酸鈉制劑是目前治療UC的主要手段,短期治療效果明顯,但存在不良反應大、不能維持等問題[8]。翁布對UC是否有治療作用,尚不明確。本研究擬通過UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術、網絡藥理學、分子對接和動物實驗驗證,探究藏藥翁布治療UC的作用及機制,為翁布的合理開發利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性C57BL-6小鼠,40只,清潔級,體重(20 ± 2)g,購于西安交通大學醫學實驗動物中心(動物生產許可證號:SCXK(陜)-2017003),實驗前適應性飼養7 d,自由攝食、飲水,室內溫度18～24 ℃,相對濕度40%～70%,每日12 h光照維持,晝夜循環。實驗過程中動物的處置均符合實驗動物倫理學規范,實驗程序符合青海師范大學實驗動物倫理委員會的批準(編號20230310)。

1.2 實驗藥物和試劑

翁布采自2022年7月青海省海東市民和縣古鄯鎮,經青海師范大學生命科學學院尚軍副教授鑒定為水柏枝(Myricariagermanica)嫩枝葉。美沙拉嗪膠囊(批號:H20020211,黑龍江天宏藥業有限公司):葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt,DSS)(批號:0216011090,美國MP公司,);多聚甲醛(PFA)固定液(批號:G1101-500ML,武漢塞維爾生物科技有限公司);TNF-α、IL-6試劑盒(批號:J24082、J24111,武漢吉立德生物科技有限公司);羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na)(批號:S851013,上海弘順生物科技有限公司);其他分析純均購自山東禹王化學試劑廠。

1.3 實驗儀器

高通量組織破碎儀(Tissuelyser-48,上海凈信實業發展有限公司);臺式快速離心濃縮干燥器(ZLS-1,湖南赫西儀器裝備有限公司);氮氣吹掃儀(Reacti-thermo)、超高效液相色譜(UHPLC)、質譜儀(Q Exactive)(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.4 動物實驗

1.4.1 DSS模型制備和給藥方法

取干燥的翁布嫩枝葉2 kg,粉碎,用10倍量的75%乙醇加熱冷凝回流提取3次,每次120 min,合并三次提取液,濃縮減壓干燥得翁布乙醇提取物浸膏。給藥時,將浸膏用0.5% CMC-Na配成混懸液[9]。Bao等[10]用乙醇回流提取翁布嫩枝葉,用生理鹽水配成含提取物0.14 g/mL(相當于生藥量0.864 g/kg)的溶液,探究藏藥翁布提取物對SD大鼠FCA誘導性關節炎的試驗研究。參照此給藥劑量換算小鼠給藥高、低翁布提取物混懸液:0.06、0.24 mg/L;陽性藥美沙拉嗪膠囊:0.3 g/kg。

將40只小鼠隨機分為空白對照組(negative control,NC)、DSS模型組(DSS model,Mod)、翁布高(M.germanicahigh dose,MG-H)、低劑量組M.germanicalow dose,MG-L)和陽性藥物美沙拉嗪(5-aminosalicylic acid,5-ASA)組。實驗期間,空白組小鼠給予蒸餾水,其余各組采用自由飲用3% DSS溶液(每天8時定時更換添加新的飼喂蒸餾水及DSS溶液),均連續飼喂7 d,建立UC小鼠模型。實驗期間每天測量小鼠體重、觀察糞便性狀,肛門是否便血,并進行DAI評分。于造模第3 d和7 d各組隨機各取1只小鼠,頸椎脫臼處死,測量小鼠結腸長度和觀察充血程度,并結合體重變化和便血程度確認是否造模成功。從造模第1 d開始,每天定時上午9時對小鼠進行1次灌胃,連續15 d。

1.4.2 血清、結腸樣本的采集和檢測

最后一次給藥后,禁食不禁水24 h,進行眼眶取血,靜置,以3 000 r/min轉速離心10 min,收集上清液,測定小鼠血清中白介素6和腫瘤壞死因子-α的含量,具體方法按照ELISA試劑盒的說明書進行檢測。實驗結束后,各組小鼠脫頸處死,解剖取結腸,測量并記錄結腸長度;肉眼觀察結腸表面有無充血、潰瘍等變化;取出的腸段組織,生理鹽水(預冷)清洗內容物,切取約1 cm變化較為明顯的腸段并用濾紙吸干水分,使用組織固定液固定,再進行石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色,觀察結腸組織的病理變化情況。免疫組織化學檢驗的切片60 ℃烤箱過夜,脫蠟水化,抗原修復,血清封閉,DAB顯色脫水,透明中性樹膠封片,光鏡下觀察結果。

1.4.3 RT-qPCR法檢測UC小鼠結腸組織TNF-α和IL-6mRNA表達

按“1.4.2”項下方法取各組取小鼠結腸黏膜組織研磨勻漿,在小鼠結腸黏膜組織樣本中加入Trizol,經氯仿、異丙醇體系提取組織總mRNA,經逆轉錄合成對應的cDNA,完成RT-PCR的檢測。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR反應引物序列

1.5 網絡藥理學分析

1.5.1 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS獲取翁布化學成分

1.5.1.1 樣品制備

將干燥的翁布嫩枝葉研磨粉碎,過100目篩,得翁布粉末樣品,低溫保存。樣本在4 ℃環境下解凍后,稱取量適量樣本(0.1～200 mg),分別加入0.1 mL水(預冷),渦旋1 min,加入400 μL預冷甲醇乙腈溶液(1∶1,V/V),渦旋1 min,低溫超聲0.5 h,2次,-20 ℃放置1 h沉淀蛋白,12 000 r/min,4 ℃離心20 min,取上清真空干燥復溶于200 μL 30%乙腈,渦旋,14 000 g,4 ℃離心0.25 h,取上清上機檢測。

1.5.1.2 液相色譜參數

色譜柱:Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相:A相為0.1%甲酸-水溶液,B相為0.1%甲酸-乙腈-異丙醇;流速0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μL;洗脫梯度:0.0～2.0 min A/B(90∶10,V/V),6.0～15.0 min A/B(40∶60,V/V),15.1～17.0 min水/乙腈(90∶10,V/V);將樣品置于4 ℃自動進樣器進行自動進樣分析(隨機順序連續分析),為監測和評價系統的穩定性和實驗數據的可靠性,實驗時將QC∶樣品穿插入樣本序列中。

1.5.1.3 QE質譜條件

采用美國Thermo公司Q exactive高分辨質譜檢測系統進行樣本一級、二級譜圖的采集。電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)條件如下:鞘氣40 arb;輔助氣10 arb;離子噴霧電壓3 000 V/-2 800 V;溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為Full-scan MS2模式;掃描方式為正離子/負離子,一級掃描范圍:70～1 050 Da,二級掃描200～2 000,一級分辨率70 000,二級17 500。

1.5.2 翁布主要活性成分靶蛋白的預測

將UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS得到的化學成分在TCMSP(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)平臺進行篩選,篩選口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30,類藥性(drug-likeness,DL)>0.18,利用PubChem數據庫查找活性成分的Canonical SMILES表達式,導入SwissTargetPreddiction數據庫和TargetNet數據庫進行篩選,預測翁布各成分對應靶蛋白,合并23個活性成分在兩個數據庫的篩選結果。

1.5.3 潰瘍性結腸炎相關基因靶點收集

以“ulcerative colitis”為關鍵詞,在GeneCards數據庫中檢索UC的潛在靶點。通過Excel計算,以Score>1.07進行篩選,獲取最終UC相關基因靶點。

1.5.4 翁布治療UC潛在靶點預測

在Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)網站輸入翁布靶點和UC靶點,得到二者相交靶點圖,相交部分即翁布治療UC的潛在靶點。

1.5.5 翁布活性成分-UC靶點網絡圖的構建

運用Cytoscape3.9.0構建“翁布-活性成分-UC”靶點網絡圖,進行有效成分及靶點的拓撲數據分析(TDA)分析,包括度值(degree)、中介中心度(betweenness centeality,BC)和接近中心度(closeness centeality,CC),并根據TDA分析參數判斷翁布治療UC核心靶點及其發揮藥效的主要活性成分。

1.5.6 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡的構建和關鍵靶點的篩選

將1.5.5所得翁布治療UC核心基因靶點導入STRING數據庫構建蛋白互作網絡,并將相互作用信息導入Cytoscape3.9.0軟件中,進行拓撲數據分析(TDA),計算出各節點的度值、BC和CC,選擇TDA分析參數均大于中位數的靶蛋白,獲得關鍵靶點。

1.5.7 關鍵靶蛋白GO富集分析和KEGG通路分析

將上述“1.5.6”所得的14個關鍵靶蛋白導入DAVID數據庫,對其進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,獲得翁布治療UC的潛在通路。通過微生信作圖平臺得到GO富集分析的氣泡圖和KEGG通路分析圖。

1.5.8 翁布核心成分與潰瘍性結腸炎作用核心靶蛋白的分子對接驗證

將“翁布-活性成分-UC”疾病靶點網絡圖中TDA分析參數排名前5的活性成分與PPI網絡TDA分析得到的核心靶蛋白進行分子對接。UniProt數據庫和PDB數據庫下載核心蛋白3D結構的pdb文件;從TCMSP數據庫獲取翁布活性成分2D結構的mol2文件。運用AutoDockTools軟件首先進行核心蛋白去水、加氫,選為受體,然后對活性成分小分子進行加氫處理,將其選為配基。然后準備Autogrid和AutoDock并運行,運行完畢后進行半柔性對接(semi-flexible docking),將對接結果運用OpenBabel和PyMOL軟件進行轉換和繪圖處理,得到翁布主要有效成分治療UC的證據支持。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 翁布治療UC主要活性成分及靶點篩選

翁布供試品溶液按上述色譜和質譜條件進UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS分析,結合正、負離子模式下總離子流圖(見圖1),根據所測精確分子量,將一級質譜數據與數據庫化合物的分子式對比,對化合物進行初步鑒定,從翁布中共鑒定出171種化合物,經TCMSP數據庫進行篩選,獲得翁布有效成分23個(見表2)。通過SwissTarget Prediction數據庫對翁布的23個活性成分的作用靶點進行預測,共獲得285個活性成分靶點。

圖1 翁布藥材總離子流圖

表2 翁布活性成分和靶點數

2.1.2 翁布治療UC的核心靶點篩選及PPI網絡的構建

從GeneCards數據庫篩選出UC靶點2 415個。將以上285個活性成分靶點與2 415個疾病相關靶點取交集,獲得翁布治療UC的潛在作用靶點111個(見圖2)。將上述共有靶點構建“翁布-活性成分-UC”網絡圖,如圖3所示,翁布治療UC的核心成分為蟛蜞菊內酯、去甲蟛蜞菊內酯、大黃酸、鞣花酸和異鼠李素,最主要靶點為TNF、ABCB1、RELA等。將篩選出的潛在靶點輸入到String數據庫,構建PPI蛋白相互作用網絡圖,如圖4所示,TNF、EGFR和CASP3等基因位于PPI網絡圖的核心位置,在PPI網絡中發揮關鍵調控作用。

圖2 潰瘍性結腸炎與翁布交集靶點韋恩圖

圖3 翁布“活性成分-作用靶點”網絡

圖4 蛋白-蛋白互作網絡

2.1.3 翁布治療潰瘍性結腸炎潛在靶點生物功能與通路的富集分析

GO功能富集分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cell component,CC)三個模塊。如圖5所示,BP顯示靶基因主要集中在一氧化氮合酶調控過程、蛋白磷酸化調控、細胞凋亡過程、平滑肌細胞增殖調控和氧化應激反應等;CC主要與核染色質、蛋白質復合物、細胞質等有關;MF主要與相同蛋白質結合、蛋白質復合物、細胞質等有關。KEGG通路富集分析顯示(如圖6所示),翁布治療UC的藥理作用通路包括癌癥通路、TNF信號轉導、MAPK信號轉導通路和雌激素信號通路等。

圖5 GO功能富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.1.4 翁布核心活性成分與潰瘍性結腸炎共同作用靶蛋白的分子對接驗證

為進一步驗證翁布治療潰瘍性結腸炎的分子機制,將翁布治療潰瘍性結腸炎的核心成分與靶點進行分子對接,初步驗證兩者之間的結合活性,結果見表3。配基與蛋白受體之間的結合能越低,兩者之間親和能力越好,構想也更穩定[11,12]。對接結果顯示,大黃酸、去甲蟛蜞菊內酯、蟛蜞菊內酯和鞣花酸等化合物與關鍵作用靶點TNF、CASP3、EGFR、PTGS2和HSP90AA1的結合能均小于-5.10 kcal/mol,說明兩者之間具有較好的結合活性,且大黃酸與TNF,大黃酸、去甲蟛蜞菊內酯和蟛蜞菊內酯與PTGS2之間的結合能均小于-7.23 kcal/mol,顯示出強烈的結合活性,利用PyMOL軟件進行可視化分析(見圖7),觀察可視化圖發現所述配基化合物均能很穩定地包裹在受體蛋白的活性口袋中。Rheic acid通過氨基酸殘基ALA-109、GLY-224、VAL-226與TNF形成5條氫鍵,通過氨基酸殘基CYS-32、TYR-116、CYS-26、HIS-24、LYS-454、GLU-451與PTGS2形成7條氫鍵。去甲蟛蜞菊內酯與PTGS2通過氨基酸殘基ASN-28、GLN-26、ARG-29、CYS-26、LYS-454、CYS-32、HIS-24、GLU-451形成9條氫鍵,并且所述配基化合物均能很穩定地包裹在受體蛋白的活性口袋中。

圖7 分子對接示意圖

表3 翁布核心成分與核心靶蛋白結合能

2.2 體內實驗驗證

2.2.1 翁布提取物對UC小鼠一般狀態的影響

空白對照組小鼠毛發、大便、飲食均正常,精神狀態良好,體重自然增加;與空白對照組相比,模型組小鼠精神狀態倦怠,身體蜷縮,少動,毛發無光澤,出現不同程度的便血、腹瀉或肛門血染,如圖8所示,體重在造模期間逐漸減少,停止造模后緩慢增加;與模型組相比,翁布各給藥組和5-ASA組在造模第1～5 d體重增加緩慢,在停止造模后,隨著治療的推進,體重逐漸回升。模型組小鼠DAI評分較空白組增加;與模型組相比,5-ASA組和翁布各劑量組小鼠DAI評分降低。

圖8 翁布對UC小鼠體重和DAI評分的影響

2.2.2 翁布對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理損傷的影響

空白對照組小鼠腺體排列整齊,黏膜結構完整,未見炎性細胞浸潤;與空白對照組相比,模型組小鼠腺體排列紊亂,間隙增大,上皮脫落,炎性細胞浸潤明顯。與模型組相比,各給藥組小鼠黏膜結構,腺體排列和炎性細胞浸潤程度等均有所改善(見圖9)。

圖9 翁布對UC小鼠結腸組織病理變化的影響

2.2.3 翁布對UC小鼠血清中TNF-α和IL-6水平的影響

與空白對照組相比,模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.001);與模型組相比,翁布高、低劑量組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.01)(見圖10)。

圖10 翁布對UC小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影響

2.2.4 翁布對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織TNF-α和IL-6表達的影響

與空白對照組相比,模型組小鼠結腸組織中TNF-α和IL-6陽性染色表達顯著增加;與模型組相比,翁布高、中、低劑量組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織緊密連接相關蛋白TNF-α和IL-6陽性染色表達顯著增加(見圖11)。

圖11 翁布對UC小鼠結腸組織TNF-α和IL-6表達的影響

2.2.5 翁布對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織TNF-α和IL-6 mRNA表達的影響

與空白對照組相比,模型組小鼠結腸組織TNF-α和IL-6 mRNA表達顯著升高(P<0.001);與模型組相比,翁布高、低劑量組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織TNF-α和IL-6 mRNA表達顯著降低(P<0.05)(見圖12)。

圖12 翁布對UC小鼠結腸組織TNF-α和IL-6 mRNA表達的影響

3 討論與結論

本研究運用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術分析出翁布171個成分,通過TCMSP平臺篩選出翁布活性成分23個。根據“翁布-活性成分-UC”網絡圖可知,匹配靶點最多的前5個成分為蟛蜞菊內酯、去甲蟛蜞菊內酯、大黃酸、異鼠李素、鞣花酸。He等[13]的研究表明鞣花酸具有抗氧化、抗炎等藥理作用。Zheng等[14]研究發現鞣花酸通過抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX等通路,顯著減少TNF-α、IL-1β、NO釋放,進而產生改善UC的作用。大黃酸具有抗腫瘤、抑菌和抗炎等活性[15,16],且研究表明[16]大黃酸可通過抑制JAK2等靶蛋白阻礙炎癥信號傳遞,減少炎癥因子的釋放,緩解UC免疫功能異常引起的炎癥反應[17]。異鼠李素(isorhamnetin,ISO)是一種廣泛存在于多種植物的天然小分子黃酮類化合物,具有抗炎、抗病毒等多種生物學功能[18]。ISO可通過抑制MPO的活性、阻礙促炎介質(TNF-α、IL-2、IL-6)的釋放、下調NF-κB信號通路來發揮抗炎、治療炎癥性腸炎的作用[19]。蟛蜞菊內酯能抑制NLRP3炎癥小體的激活和細胞焦亡,從而在體內發揮抗炎作用[20]。

通過網絡藥理學技術篩選得到翁布作用靶點285個,潰瘍性結腸炎疾病靶點2 415個,交集后得到111個治療潰瘍性結腸炎的潛在靶點,通過構建“翁布-活性成分-UC”網絡,揭示了翁布治療潰瘍性結腸炎的分子機制;通過蛋白互作網絡預測翁布治療潰瘍性結腸炎的關鍵靶點,PPI網絡分析發現翁布可能通過調控TNF、CASP3、EGFR、PTGS2和HSP90AA1等靶蛋白,發揮治療潰瘍性結腸炎的作用,而這些基因直接或間接參與細胞炎癥、凋亡、氧化應激等過程。TNF-α是治療潰瘍性結腸炎的關鍵靶點,有研究表明潰瘍性結腸炎患者的糞便樣本和結腸黏膜活檢標本中發現TNF-α水平升高,抗TNF-α單抗可通過阻斷其生物活性以達到抗炎的目的,抗TNF-α單克隆抗體藥物在治療潰瘍性結腸炎方面具有較好療效[21]。凋亡蛋白酶(caspases)參與細胞凋亡,胱天蛋白酶3(CASP3)細胞凋亡過程中起重要作用[22]。潰瘍性結腸炎的發生與細胞凋亡密切相關,動物研究表明,潰瘍性結腸炎模型組腸黏膜中CASP3含量均顯著升高,且經有效藥物處理后,其表達水平下調,結腸細胞凋亡率明顯下降[23]。前列素內過氧化物合成酶(PTGS2)蛋白參與多條炎癥反應信號通路,抑制該蛋白能夠減少炎癥介質的產生[24]。EGFR信號通路作為人體中的關鍵信號通路,介導細胞的凋亡和增殖,與結腸黏膜損傷的發生有關,因此,干預EGFR信號通路為治療UC提供了可能。有研究顯示潰瘍性結腸炎腸黏膜受損會影響EGFR表達,進而減少對結腸黏膜的保護及修復作用,并發現EGFR水平與UC復發密切相關[25]。HSP90AA1與炎癥密切相關,可調節細胞的增殖和凋亡,抑制HSP90AA1能誘導自噬從而改善潰瘍性結腸炎[26]。

由此推測,翁布可能通過調控上述5個靶蛋白抗炎、抗氧化、減少細胞凋亡,發揮治療UC作用。分子對接結果也顯示,翁布與以上5個核心基因具有良好的結合活性。

KEGG結果顯示,翁布治療潰瘍性結腸炎的主要通路有細胞免疫研究的核心通路T細胞受體信號通路、MAPK信號通路以及TNF-α信號通路等。白介素6、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β是炎癥反應中常見的三種炎癥因子[27]。TNF-α和IL-1β是急性UC早期的重要促炎因子。促炎因子抑制效應T細胞凋亡發揮持續促炎作用等,從而參與UC的發生發展。有研究表明[28]可通過TNF-α/NF-κB信號通路改善肺、腸組織的病理損傷,達到肺、腸同治的作用。絲裂原活化蛋白激酶信號通路包括ERK以及p38 MAPK等信號通路,其能夠參與調控炎癥反應、氧化應激、細胞分化與凋亡等多種生理病理過程[29],MAPK信號轉導與UC的炎癥反應密切相關。

TNF-α是機體受到有害刺激所釋放的第一個細胞因子,IL-1β可由TNF-α誘導產生。IL-1β增加可以與TNF-α協同作用,共同刺激IL-6的產生[30]。因此,本研究采用網絡藥理學和分子對接技術預測翁布對潰瘍性結腸炎的潛在作用治療靶點及信號通路,并通過自由飲用DSS復制潰瘍性結腸炎癥小鼠模型進行藥效學評價,翁布可以改善DSS誘導的UC小鼠的結腸長度和結腸黏膜損傷,降低結腸和血清中TNF-α和IL-6的含量,緩解潰瘍性結腸炎癥反應。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學方法對翁布治療UC的作用機制進行系統性分析,并利用分子對接技術初步驗證其作用靶點,同時通過C57BL-6小鼠體內實驗檢驗翁布治療UC作用的藥效。研究結果初步表明翁布可通過“多靶點、多通路”治療UC,可緩解DSS誘導的炎癥反應,而其機制尚不清晰。后續工作將對其進行研究,以期為翁布治療潰瘍性結腸炎的作用機制提供參考。