不同品種柚子皮精油成分及抗氧化與抑菌能力對比研究

肖新生,宋子龍,謝永燕,袁志輝

湖南科技學院化學與生物工程學院,永州 425199

柚子(Citrusmaxima)屬于蕓香科柑橘屬原生柑橘亞科柚類,我國種植柚類已有4 000多年歷史,主要產地有廣西、廣東、重慶、福建、湖南等,主要品種有沙田柚、文旦柚、琯溪蜜柚等,年產量達500萬噸以上。柚子皮是柚子的副產物,占整個柚子重量的40%～55%,含有精油、果膠、檸檬苦素、膳食纖維等多種活性物質,具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降壓、降血糖等功效,可被用于治療心血管疾病、化痰止咳、補血健脾[1]。對我國每年產生的200萬噸[2]以上柚子皮進行開發利用,不僅可以避免環境污染,還可以制備出柚皮精油、果膠、膳食纖維、黃酮和檸檬苦素等高價值產品。柚子皮精油可通過冷壓榨法[3]、超臨界CO2萃取法[4]、水蒸氣蒸餾法[5]、超聲波輔助提取法[6]等方法制備。柚子皮精油中D-檸檬烯的抑菌性能已有文獻報道,如Zhang等[5]在研究中發現D-檸檬烯含量最高的沙田柚和香柚的抑菌活性高于D-檸檬烯含量較低的文旦柚和梁平柚,Lan-phi等[7]在其研究越南柚子皮精油抑菌活性也與D-檸檬烯含量具有相關性。

盡管柚子皮精油中檸檬烯的抑菌能力已經得到證明,但柚子皮精油中其他一些萜烯類化合物對抗氧化和抑菌能力也具有潛在的貢獻。目前有關柚子皮精油中各個組分對抑菌和抗氧化的貢獻,尚未有系統的研究,因此不能對具有不同組成的柚子皮精油分類利用。本研究的目的在于測定不同品種柚子皮精油成分,比較精油組成的差異,結合抑菌和抗氧化實驗的結果,分析柚子皮精油中抗氧化和抑菌效果顯著的成分,從而為柚子皮精油分類開發提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

實驗所需12種柚子均為產地購買,品種經湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室植物學博士黃光文教授、姜紅宇副教授鑒定為梅州柚(Citrusmaxima(Burm.)Merr.cv.Meizhoushatian Yu)、江永香柚(Citrusmaximacv.Jiangyong Yu)、容縣柚(Citrusmaxima(Burm.)Merr.cv.Rongxianshatian Yu)、白市柚(Citrusmaxima(Burm.)Merr. cv.Baishi Yu)、黃金貢柚(Citrusmaxima(Burm.)Merr.cv.Chunxiang Yu)、衡陽柚(Citrusmaximacv.Hengyang Yu)、長壽柚(Citrusmaximacv.Changshoushatian Yu)、南康柚(Citrusmaximacv.Nankang Yu)、合江柚(Citrusmaximacv.Hejiang Yu)、金蘭柚(Citrusmaximacv.Jinlan Yu)、紅心柚(Citrusmaximacv.Honey Pomelo Yu)、宜昌柚(Citrusmaximacv.Yichang Yu),各柚子品種編號如表1所示。

表1 柚子品種及編號

1.2 主要儀器

UV1800紫外分光光度儀(日本Shimadzu公司);GCMS-QP2010S氣相色譜-質譜儀(日本Shimadzu公司)。

1.3 原材料的預處理

將購買的柚子洗干凈、瀝干、稱重,剝開后去除果肉得到柚子皮,然后將柚子皮用刀剔除白色海綿層,得到厚度2 mm左右黃色的外皮(采用105 ℃烘箱衡重法,測定各品種水分及其揮發物含量在81.4%～85.5%之間),置于-20 ℃冰箱中,作為實驗的柚子皮精油提取原材料。

1.4 柚子皮精油的提取

參考Liu等[3]提出的水蒸氣蒸餾法,將冷凍柚子外黃皮經搖擺式中藥粉碎機趁冷粉碎2 min,取100 g置于1 000 mL蒸餾瓶中,并加入400 mL的蒸餾水,置于電熱套上,裝配好精油提取器。在150 V的條件下加熱至蒸餾瓶中的混合物開始微沸,然后再將電壓調至100 V恒溫加熱3～4 h,直至從精油提取器上觀察精油的量沒有增加為止。將油水混合物從精油提取器中取出,置于小錐形瓶中,放入適量的無水硫酸鈉至錐形瓶底部的無水硫酸鈉呈現塊狀,再通過過濾裝置將精油從油水混合物中分離出來,將其裝入離心管中,放入冰箱-20 ℃冷凍儲存。

1.5 柚子皮精油的組分的GC-MS分析

取柚子皮精油10 mg(精確至0.1 mg),加二氯甲烷定容至10 mL待測。色譜條件:石英毛細管色譜柱HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm);分流比:5∶1;載氣:氦氣(純度為99.999%);流速:1.0 mL/min;進樣量:2 μL;升溫程序:進樣口溫度為250 ℃,初始溫度50 ℃,保持3 min,然后以10 ℃/min升至200 ℃,在200 ℃保持1 min。質譜條件:離子源溫度250 ℃,電離方式:EI,電離能量:70 eV,接口溫度:270 ℃,全掃描方式,掃描范圍29～500m/z。

1.6 柚子精油組分的定性定量分析

利用質譜信息與標準信息庫(NIST2014)進行相似度檢索和特征峰對比分析,采用峰面積歸一法[8]計算各種組成成分的百分含量。

1.7 柚子皮精油的抗氧化能力的檢測

參考Hao等[9]的方法采用DPPH·的清除能力檢測。

1.8 不同柚子皮精油的抑菌能力檢測

采用Zhang等[5]的濾紙片抑菌圈法測定不同柚子皮精油的抑菌效果。

1.9 數據處理

所有的數據均重復測定3次,結果取標準差,采用Excel、Origin軟件對GC-MS數據進行分析處理,并進行聚類分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 柚子皮精油的提取率對比分析

柚子皮精油的提取率如圖1所示,不同品種的柚子皮精油提取率差異較大。長壽柚的精油提取率是最高的,其次是梅州柚,這兩種的精油提取率超過了1%。白市柚(S4)、衡陽柚(S6)、南康柚(S8)、合江柚(S9)的提取率超過了0.8%。江永香柚(S2)、容縣柚(S3)、黃金貢柚(S5)、宜昌柚(S12)的精油提取率在0.4%～0.8%,而提取率低于0.4%的只有金蘭柚(S10)和紅心柚(S11)。柚子皮精油的含量受柚子新鮮程度影響較大,隨著存放時間的延長,柚子皮重部分精油會揮發而導致精油提取率下降。研究發現,未經處理的梅州柚(S1)存放至次年3月,精油提取率下降至0.63%。同時實驗對各柚子品種外黃皮稱重測定,得出外黃皮占柚子總重量的質量數在14.8%～16.3%之間,按照平均外黃皮1%精油提取率計算,推測我國每年的柚子皮精油的產生量接近1萬噸。

圖1 不同品種柚子皮精油提取率對比

2.2 柚子皮精油成分的GC-MS檢測分析

采用GC-MS對12種柚子皮精油的化學成分進行了分析,得到典型總離子流圖如圖2所示。從圖2中可以看出,柚子皮精油組成中,D-檸檬烯含量占據絕對的優勢。由于柚子皮精油組成非常的復雜,有些含量非常低的組分,定性可能會出現誤差,同時含量非常低的組分對精油功能的貢獻度也有限,因此本研究中僅對相對質量百分含量大于0.02%的組分進行了鑒定。12種柚子皮精油中一共鑒定出35種相對質量百分含量大于0.02%的化學物質,具體結果如表2所示。該結果與Song等[4]通過水蒸氣蒸餾法提取柚子皮精油并通過GC-MS檢測出35種化學物質相類似。12種柚子皮精油含有的共同組分有α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、羅勒烯、檜烯、芳樟醇。D-檸檬烯的相對質量百分含量是所有品種柚子皮精油中最高的,在72.1%～94.2%之間。D-檸檬烯在宜昌柚(S12)和金蘭柚皮精油(S10)中含量相對較低,而在南康柚(S8)和梅州柚(S1)皮精油中含量均超過94%。這與Liu等[3]發現的D-檸檬烯的相對含量都成分在82%左右相一致。此外,β-崖柏烯、γ-松油烯、葎草烯、α-依蘭油烯、正癸醛、L-香芹酮是黃金貢柚(S5)所特有的成分;3-羥基-十二酸、異膽酸乙酯則是衡陽柚(S6)所特有的成分;香葉烯醇、葎草烯環氧化合物是江永香柚(S2)所特有的成分;乙酸縮二乙醇是宜昌柚(S12)所特有的組分,且此物質相對質量百分含量達到24.01%;江西南康柚(S8)精油由于D-檸檬烯含量高,導致其他組分的相對百分含量下降,鑒定出的化學成分最少,只有5種;而黃金貢柚(S5)所含的化學成分最多,有22種。研究表明,這些成分的差異除受品種的影響外,種植環境、氣候等生長的條件和采收時的時間也有一定的影響[10]。

圖2 柚子皮精油(S5)GC-MS總離子流圖

表2 不同品種柚子皮精油的化學成分及其相對質量分數

2.3 柚子皮精油的抗氧化能力分析

DPPH·具有單電子,其醇溶液顯紫色,能在517 nm處產生強吸收的特性[11]。當柚子皮精油中有自由基清除劑存在時,會與DPPH·中單電子配對,從而使其吸收減弱,其褪色程度與其接受的電子數呈定量關系。

由圖3可知,不同品種的柚子皮精油對DPPH·的清除效果都呈現的是正相關性,即隨著柚子皮精油濃度的上升,DPPH·的清除率越來越大,并且當柚子皮精油濃度達到60 mg/mL時,所有的柚子皮精油的DPPH·清除率都在50%以上。但是從整體上來看,柚子皮精油的DPPH·的清除率遠小于Vc的清除能力,而對比不同品種的柚子皮精油的DPPH·清除率,白市柚(S4)和衡陽柚(S6)的DPPH·清除率是高于其他10種柚子品種,黃金貢柚(S5)、宜昌柚(S12)的DPPH·清除率則是略低于其他所有柚子品種。12種柚子皮精油對DPPH·的半抑制濃度IC50值從低到高依次為白市柚(S4)(25.12 mg/mL)、衡陽柚(S6)(25.67 mg/mL)、江永香柚(S2)(35.00 mg/mL)、容縣柚(S3)(38.09 mg/mL)、紅心柚(S11)(41.68 mg/mL)、南康柚(S8)(42.71 mg/mL)、合江柚(S9)(45.82 mg/mL)、長壽柚(S7)(44.78 mg/mL)、金蘭柚(S10)(47.80 mg/mL)、梅州柚(S1)(52.41 mg/mL)、宜昌柚(S12)(53.40 mg/mL)、黃金貢柚(S5)(56.36 mg/mL)。Hao等[9]也對柚子精油的抗氧化性做了檢測,得出的其IC50值為23.22 mg/mL,這與本文的衡陽柚(S1)與白市柚(S4)的IC50值相當。最后結論為衡陽柚(S1)與白市柚(S4)的抗氧化能力相對較好,宜昌柚(S12)和黃金貢柚(S5)的抗氧化能力相對較差,但是都具有一定的抗氧化性能。L-抗壞血酸(Vc)對DPPH·的半抑制濃度IC50值則為0.21 mg/mL,所測的12種柚子皮精油的抗氧化能力與Vc對比,都有較大差距。

圖3 不同濃度柚子皮精油對DPPH·清除率的影響

2.4 柚子皮精油的抑菌能力分析

由于部分柚子皮精油的提取率較低,原料數量有限,提取得到的精油量較少,不足開展抑菌能力分析實驗,因此本研究最終選定了7種柚子皮精油,探討柚子皮精油的抑菌能力。本研究選用茄科勞爾氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為抑菌實驗的目標微生物,其中茄科勞爾氏菌、大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌。采用濾紙圓片法測定抑菌圈直徑[12],實驗結果如表3所示。

表3 柚子皮精油對三種菌的抑菌能力對比

從表3可以看出,七種柚子皮精油對大腸桿菌均未顯示出明顯的抑菌活性,僅有少數幾種精油對金黃色葡萄球菌表現出一定的作用,而大多數精油對茄科勞爾氏菌表現出較好的抑制作用。對茄科勞爾氏菌抑制作用最明顯的是長壽柚(S7),其次是黃金貢柚(S5)和白市柚(S4);對金黃色葡萄球菌抑制作用最明顯的是容縣柚(S3)。橫向比較衡陽柚(S6)對三種菌的抑制作用都是最低的,其次是廣東梅州柚(S1),對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用幾乎沒有;而廣西容縣柚(S3)對茄科勞爾氏菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抑制作用,其次是白市柚(S4)和湖南江永柚(S2),而重慶長壽柚(S7)和廣東梅州柚(S1)則都偏重于抑制茄科勞爾氏菌。該結論與Zhang等[12]得出的:梁平柚、香柚、文旦柚、沙田柚的柚子皮精油對酵母菌、霉菌的抑制作用較為明顯,對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用不太明顯的結論有一定的相似度;于He[13]研究的柚子精油對枯草芽孢桿菌無抑菌作用,對沙門氏菌有一定的抑菌作用有一定的補充?？傮w上看柚子皮精油中有著一定的抑菌物質,對特定的菌種有著較好的抑菌效果。

2.5 綜合分析

2.5.1 柚子皮精油的主成分分析(PCA)

通過對上述不同柚子皮精油的抗氧化能力和抑菌能力的效果差異分析,并結合GC-MS的分析結果,將GC-MS的分析結果通過Origin軟件將其繪制成圖4柚子皮精油的主成分分析圖-雙標圖。

圖4 柚子皮精油的主成分分析圖

從Origin軟件對數據處理的PCA分值圖可以看出12種柚子皮精油的成分差異和變異度大小。用Origin軟件對數據進行對數轉換加中心化格式化處理[14],得到柚子皮精油的主成分分析圖-雙標圖。參考A等[15]的主成分分析十個要點問題,從圖4的PCA模型可以看出江永香柚(S2)和容縣柚(S3)具有一定的相似度,梅州柚(S1)、白市柚(S4)以及宜昌柚(S12)具有一定的相似度,長壽柚(S7)和衡陽柚(S6)具有一定的相似度,只有金蘭柚(S10)和其他11種柚子品種具有較大的差異。結合這12種柚子皮精油的抗氧化能力差異分析,可以得出白市柚(S4)和廣東梅州柚(S1)之所以抗氧化能力強,可能是因為其精油的化學成分中檸檬醛、檸檬烯、香葉烯醇、橙花醇、反式-檸檬醛的化學含量較其他柚子皮精油的含量高,而黃金貢柚(S5)之所以抗氧化能力差則是因為相應成分含量低的原因,這與圖4的PCA分值圖相一致,并且這與Wu等[16]探索的D-檸檬烯具有較強的抗氧化能力相一致,和Li等[17]探索的檸檬醛也同樣具有較強的抗氧化能力相一致。

柚子皮精油的抑菌能力的差異從PCA圖中可以得到相照應,從上述抑菌研究中發現最主要有抑菌作用的是容縣柚(S3),其次是江永香柚(S2)、白市柚(S4)、梅州柚(S1),最差的依舊是黃金貢柚(S5),這充分的和主成分分析圖相一致,從而我們可以探索到,具有一定抑菌作用的化學成分可能是D-檸檬烯、檸檬醛、反式-檸檬醛、芳樟醇、α-松油醇、香葉烯醇、橙花醇。這與Xia等[18]研究的檸檬醛的抑菌特性相一致,還有與Guo等[19]研究的芳樟醇對大腸桿菌的抑菌作用機制相一致,這充分體現了其結果和本研究的相似性。

2.5.2 柚子皮精油成分的層次聚類圖分析

柚子皮精油的最主要成分都是D-檸檬烯,而柚子皮精油活性的差異,主要來源于其他成分的種類和含量。研究中將除D-檸檬烯之外的剩余的成分進行層次聚類圖分析,按照相關性聚類成5類,結果如圖5。梅州柚(S1)、南康柚(S8)、白市柚(S4)、長壽柚(S7)、紅心柚(S11)、容縣柚(S3)和江永香柚(S2)距離比較接近,歸為一類,其特點是D-檸檬烯含量較高。從圖5上可以看出,白市柚(S4)和梅州柚(S1)距離很接近,表3中抑菌實驗結果顯示白市柚(S4)和梅州柚(S1)結果相近,與聚類分析結論一致。黃金貢柚(S5)與合江柚(S9)都因較高的γ-松油烯含量,距離相近,而與其他種類柚子皮精油距離較遠,歸為第二類。衡陽柚(S1)、宜昌柚(S12)、金蘭柚(S10)分別因其高的β-蒎烯、乙縮醛二乙醇、β-石竹烯含量,與其他柚子皮精油距離較遠,而各自歸為一類。從抗氧化實驗結果可以看出,宜昌柚(S3)和金蘭柚(S10)的效果相對較差,因此乙縮醛二乙醇、β-石竹烯對柚子皮精油的抗氧化能力貢獻較小。衡陽柚(S6)盡管D檸檬烯含量相對較低,但其β-蒎烯、α-蒎烯含量相對較高,其抗氧化能力較強,因此可以判斷β-蒎烯、α-蒎烯抗氧化效果至少與D-檸檬烯相當。

圖5 柚子皮精油成分的聚類圖

通過聚類圖結合主成分分析圖[20],結合不同品種柚子皮精油的抗氧化能力和抑菌能力差異,判斷D-檸檬烯、檸檬醛、芳樟醇、香葉烯醇等對抗氧化能力和抑菌能力具有重要影響。這與Deng等[21]研究葡萄柚精油對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌抗菌譜結論相一致。并且通過PCA圖和層次聚類圖的分析,推斷柚子皮精油中對抗氧化能力起到正相關作用的化學成分有:D-檸檬烯、β-蒎烯、芳樟醇、石竹烯、香葉烯醇、檸檬醛。與抑菌能力有正相關性的化學成分有:D-檸檬烯、芳樟醇、石竹烯、香葉烯醇、檸檬醛、α-水芹烯。綜上所述,最主要的抗氧化和抑菌成分是D-檸檬烯,其次帶有一定的抗氧化能力和抑菌能力的成分是芳樟醇、石竹烯、香葉烯醇、檸檬醛,另外附有一定抗氧化和抑菌能力的成分是α-水芹烯,這些都有一定相關文獻支持,可能含有一定抗氧化和抑菌能力的成分有羅勒烯、β-桉葉油醇。

3 討論與結論

本文采用水蒸氣蒸餾法提取12種柚子皮精油,并采用GC-MS分析對比了精油成分,一共鑒定出35種化學成分,主要是萜烯類和萜烯類氧化物。萜烯類含量最多的是D-檸檬烯,其次是β-月桂烯、α-蒎烯和β-蒎烯。萜烯類氧化物主要有芳樟醇、香葉烯醇、橙花醇、乙酸橙花酯等。通過抗氧化能力和抑菌能力測試實驗,結合PCA和層次聚類圖分析,判斷出最具有抗氧化效果和抑菌效果的成分依次為D-檸檬烯,檸檬醛,芳樟醇,而石竹烯、香葉烯醇、α-水芹烯具有一定的抗氧化和抑菌能力。

近幾十年來,植物精油因其天然具有抗氧化性、抑菌性、抗腫瘤性以及消炎性等一系列藥理作用,并且因其是天然無污染而備受關注。但是不同來源植物精油的成分差異很大,而成分的差異就會體現到產品活性的差異。橘子皮、柚子皮等蕓香科柑橘屬,其精油的主要成分是D-檸檬烯,檸檬烯的抑菌和抗氧化作用已有較多文獻證明,而不同品種柑橘屬精油的活性的差異,則是受非檸檬烯成分的種類和含量的影響。本研究篩選出了檸檬醛,芳樟醇,而石竹烯、香葉烯醇、α-水芹烯等一系列具有抑菌及抗氧化活性的成分,但是涉及的柑橘屬果皮精油種類有限,抑菌實驗針對的微生物種類有限,活性測試也僅限于抑菌和抗氧化。下一步研究將擴大品種的范圍,形成柑橘屬精油成分小型數據庫,并將活性測試擴展到常見的藥物活性等。