基于代謝組學方法的混合香精香料差異性物質鑒定與品質分析

冷 月，胡 蕓，張 進，李博巖*，謝 鋒，3*

（1.貴州醫科大學 公共衛生與健康學院，環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州中煙工業有限責任公司技術中心，貴州 貴陽 550009；3.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550000）

天然香精香料通常是多種結構相似的化學物質的混合物，具有獨特的物理化學和感官反應性質，是食品、精油、化妝品、煙草等制造領域廣為使用的添加劑［1-2］，其因在豐富產品種類、改善風味以及提升品質等方面均占據著重要的地位［3］而被稱為 “液體黃金”。尤其是煙草領域，天然香精香料及其提取物因具有芳香濃郁、口感醇厚、危害性低的特點而成為煙用香精香料的主要來源［4-5］，對于增強卷煙香韻特征、改善卷煙吸味、突出品牌風格意義非凡。

目前已知的天然香精香料成分有四千多種，其生產已從自然植物資源中分離化學物質逐漸發展為以化學合成或生物過程為重要手段進行制備。香精香料物質組成復雜、風味各異，且基質多變，使其易受原料種類、地域來源、種植環境、貯存條件以及加工方法等諸多因素影響［6］，導致香精香料產品的多樣性、易變性、調配摻假、批次間一致性欠缺等質量問題［7］。天然或混配的香精香料主要含有酯類、酮類、醇類、酸類、酚類等揮發性以及半揮發性物質。關于香精香料的研究較多，也開發有智能輔助調香系統，可以一定程度上調整配方、突出特定香氣特點，但因研發成本高，調香技術不成熟，尚未普及。通常，單體香原料可以通過氣相色譜-質譜（GC-MS）方法檢測，但對于復雜的香精香料混合物，僅通過儀器難以準確定性其混合物。采用標準品與香料數據庫相結合的指紋圖譜方法可提高混合物的定性可靠性和定量準確性［8］，但仍存在不同香原料的全組分構成和香氣特征信息缺乏的問題，使得香精香料配方研究、還原及復配、不同批次間的有效質量控制相當困難。

隨著儀器技術的發展，新的分析策略被用于香精香料的解析。GC-MS 具有方法穩定、使用可靠、定量準確等特點，已成為多類風味物質分析的首選［9-11］；代謝組學方法具有高通量、廣覆蓋、數據整合、模式識別等優點，是眾多復雜體系研究的強有力工具［12］。兩者結合已成功用于揮發性及半揮發性復雜體系的感官預測、過程加工以及質量控制［13］。本文利用GC-MS 與代謝組學分析方法，對4種不同批次的混合香精香料樣品進行組分鑒定和品質分析，明確樣本的物質組成差異性、香氣特征性以及品質一致性問題，助力混合香精香料的風味判斷，為其復配、調香及安全生產提供了參考。

1 實驗部分

1.1 試劑、儀器與材料

無水乙醇（≥99.5%，天津富宇精細化工有限公司）。Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司），Mill-Q超純水凈化系統（美國 Millipore公司），AE100梅特勒分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。某公司生產線上使用的不同批次，且具有不同風味特征的4種混合香精香料樣品共93個，即A樣品26個、B樣品22個、C樣品25個、D樣品20個。

1.2 實驗方法

1.2.1 GC-MS 檢測稱取1.000 g 香精香料樣品，無水乙醇稀釋至2.500 g，搖勻后取溶液用0.45 μm 微孔膜過濾，采用GC-MS 技術檢測其揮發性成分［8］。色譜條件：色譜柱DB-5MS（60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）；載氣 He；載氣流速1.00 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣口溫度250 °C；分流比15∶1；分流流速15 mL/min。程序升溫：50 °C 保持2 min 后，以8 °C/min 的速度升溫至280 °C，保持25 min。質譜條件：全掃描，掃描范圍為33~400 amu；離子源（EI）溫度230 °C；電離電壓70 eV；溶劑延遲4.80 min。

1.2.2 風味成分分析對各樣本的GC-MS 數據進行譜峰識別、漂移校正、背景去除等處理，提取各色譜組分的質荷比、保留時間以及峰面積等特征信息。通過美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）質譜數據庫檢索，鑒定質譜相似度大于0.95 的化學物質［9］。去除不是風味添加劑的1，2-丙二醇、甘油和尼古?。?1］，計算各類香氣組分的相對含量（即各組分的峰面積除以所有物質組分峰面積的總和）。利用《食用香料手冊》［14］、http：//www.flavornet.org、https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov、http：//www. thegoodscentscompany. com 等數據庫信息確定香精香料樣本中風味成分的化學結構、名稱和芳香性。

1.2.3 統計分析采用主成分分析（PCA）方法對校正色譜漂移后的樣本特征圖譜和由峰面積構成的峰表數據進行可視化分析，考察樣本類型及批次之間的關聯性及差異性；利用單位方差標度對數據進行標準化處理；通過偏最小二乘判別分析（PLS-DA）進一步識別具有類別差異的揮發性物質。通過設置SIMCA14.1軟件中7倍交叉驗證方法和95%置信度建立PCA和PLS-DA評估模型，采用交叉驗證方差分析（CV-ANOVA，p <0.01）和200 次置換檢驗進行模型驗證。借助變量投影重要性分析值（VIP）及p<0.05 顯著性水平篩選關鍵差異風味成分，使用SPSS 27.0 進行統計描述及單因素差異分析，基于https：//bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn平臺繪制韋恩圖。

2 結果與討論

2.1 樣品特征組分峰表

圖1 給出了A、B、C、D 4 種香精香料樣品原始GC-MS 特征圖譜的總離子流圖?？梢钥闯?，樣品的化學組成復雜，含有幾十種香氣物質，除A類與C 類樣本圖譜在整體上具有較高的相似性及一致性外，不同類別樣品間的圖譜差異較大。

圖1 4種樣品的GC-MS特征圖譜的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms（TICs） of GC-MS fingerprints of four samples

基于代謝組學數據分析方法［15-17］，對所有樣本二維GC-MS 數據中的組分進行色譜峰校正和質譜信息特征提取，生成樣品特征組分峰表，并通過NIST 質譜數據庫檢索，結果鑒定出93 種化合物。該峰表包含了每個樣本所鑒定的各組成物質的名稱、色譜保留時間、色譜峰面積、以及相對含量等，由于表格過大、內容過多，所以未在文中列出。其中，A 類樣本主要包含49 種物質，B類樣本中32 種物質，C 類樣本中48 種物質，D 類樣本中39 種物質。4 類樣本的共有香氣成分可分為8 種。根據官能團的結構不同，這些化合物分為：酯類、酮類、醇類、酸類、醛類、酚類、胺類及其他類物質。4 種香精香料樣本的風味物質組成及比例不同，致香物質的種類和含量均存在一定的差異性，其中酯類化合物的數量最多（35 種），其次是酮類（16種）、醇類（12種）、酸類（12種）、醛類（9種）、酚類（3種）、胺類（2種）及其他類物質（4種），具體信息見表1。C 類和A 類樣品中酯類風味物質的含量最豐富，分別為64.609%、38.568%。B類樣品中酸類風味成分的相對含量最高（即42.812%）。D 類樣品中含量最多的風味成分為酮類（44.763%）。乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、異戊酸異戊酯、麥芽酚、二丙二醇、乙酸、4-氧代戊酸及5-羥甲基-2-呋喃甲醛8種化合物為4種樣本的共有香氣成分（表2）。

表1 4種樣本中揮發性風味物質的種類及相對含量（RC）Table 1 Types and relative contents（RC） of volatile flavor compounds in flavor and fragrance samples

表2 4種香精香料樣品中共有成分的相對含量（RC）及風味特征Table 2 Relative content（RC） and flavor characteristics of compositions in common in samples（%）

2.2 風味成分分析

香氣物質是評價香精香料樣本品質的重要指標之一，因此對各樣品中的風味成分進行分析鑒定。結果如表3所示。

表3 FEMA收錄的天然香精香料風味特征的成分組群Table 3 Composition groups of flavor profile of natural flavors and fragrances included in FEMA

2.2.1 酯類化合物酯類致香物質具有柔和煙氣、改善產品內在品質的作用以及來源廣、香型多、價格適宜的特點，是應用最多的煙用香料，在總體香料中的占比≥20%。大部分酯類成分具有果香、花香及酒香等芳香性氣味［18］。不同的酯類香精添加到卷煙中，使其具有不同的香型特征，導致了卷煙氣溶膠中的風味差異。在A 類與B 類樣本中共鑒定出14 種酯類物質，分別占總含量的38.568%和36.736%。二乙酸甘油酯是A類樣本酯類物質中相對含量最多的物質，主要由1，2和1，3-二乙酸酯以及少量的單酯和三酯組成。乙酸乙酯在4 類樣本中均有檢出，在B 類樣品中的含量尤為豐富，該物質主要提供白蘭地酒香及葡萄果香。C類與D類樣本中化合物的數量及相對含量差異較大。C類樣本中22種酯類致香物質占了總體風味成分的64.609%，主要是菠蘿果味的己酸烯丙酯、白蘭地酒香的乙酸乙酯以及青草香的異戊酸異戊酯。D 類樣本中13 種酯類化合物僅占總體風味物質19.067%，主要為具有奶酪香、花香、水果香的乳酸乙酯。

2.2.2 酮類化合物具有不飽和結構的羰基是致香基團，羰基化合物具有優美的香氣，是煙氣中的主要致香成分。該類香料物質主要用于強化香氣風格特性，增加煙草甜香，使煙氣和順細膩。酮類化合物是樣本中的第二大類風味物質，其種類及相對含量差異較大。A 類樣品中10種酮類化合物占比為21.940%，C 類樣品中7 種酮類物質占比約為17.050%，主要為2-羥基-3，5，5-三甲基環己-2-烯酮。B類樣品中有5 種酮類化合物，僅占總含量的3.770%。D 類樣本中酮類香料物質的相對含量最為豐富，占總含量的44.763%，主要來自致香物質3-甲基環戊烷-1，2-二酮及乙基麥芽酚。乙基麥芽酚是γ-吡喃酮的衍生物，具有果香風味，是較理想的香料物質，而且用量少、功效多、安全性高，可用于提升卷煙煙氣回甜感、凸顯卷煙“甜”與“潤”的口感特征，是我國常用的香味增效劑，在4 類樣品中均檢出麥芽酚。

2.2.3 醇類及酸類化合物類似于酮類，醇類增香物質在卷煙中的作用是去除辛辣雜味、減少卷煙的刺激性。A 類樣本中的反式-橙花叔醇具有木質香韻。D 類樣品中的苯甲醇較為豐富，可為卷煙提供果香、烤面包香及玫瑰花香。然而，研究指出苯甲醇具有潛在吸入毒性風險［19］，會引起嚴重的眼睛刺激或皮膚刺激。甘油、丙二醇等低沸點多元醇在卷煙中既有保潤作用，又能促進煙氣及香氣物質的釋放，該類物質具有煙草毒性、成癮性、致癌性等危害或風險。酸類致香物質可改善煙氣酸堿度，使煙氣吸味醇和，揮發性酸性致香物質在卷煙吸食過程中能夠直接沁入煙氣，對香味影響顯著。B 類香精香料中酸類致香物質占總體風味成分的42.812%，主要來自乙酸及4-氧代戊酸，具有酸香及果香風味。該物質在A、C及D類樣品中均有檢出。

2.2.4 醛類、酚類及胺類化合物醛類物質一般具有青草味，可以改善口腔舒適度。A類和D類香料樣本中含有少量苯甲醛，該物質提供苦杏仁、焦糖風味，可以減弱煙霧刺激，增加吸入量［9］。A類和C類樣本中含有合成香料乙基香蘭素，因其具有濃烈香子蘭氣息，并且香氣清爽、純正、用量少而被廣泛應用于煙草調香，但會導致主流煙氣中苯系物及酚類物質含量增加，危害人體健康。各類樣本中的5-羥甲基-2-呋喃甲醛含量較為豐富，具有洋甘菊花香，該物質也存在于蜂蜜的揮發性成分中。酚類香精香料通常被用于增加煙草的芳香度和深度，提高香味格調。胺類物質可以增加煙草的甜味、果香味以及辛辣味。在B 類樣本中未檢出胺類致香物質，酚類物質只有2，4-二叔丁基苯酚。A 類、C 類及D類樣本中酚類及胺類物質較少，主要是對甲氧基肉桂酚及2，2，3，3，3-五氟-N-（2-苯基乙基）丙酰胺?？傮w來說，樣品中鑒定出的酚類及胺類的種類及相對含量均較少，其中大多對皮膚和眼睛有強烈刺激性，甚至存在神經毒素、肝毒素類物質，是影響卷煙安全性的重要因素。

作為必要輔料的香精香料，添加到煙絲中直接參與煙支燃燒，其化學成分的穩定性及生物安全性直接關系到卷煙的感官評價和消費者的健康安全。美國食品香料與萃取物制造者協會（Flavor and Extract Manufacturers Association，FEMA）基于食品用香料攝入量評估、代謝及遺傳毒理學等數據研究，明確不同致香物質組群的風味特征和安全性用途，制作名錄并賦予FEMA 編號。從卷煙調香的實際應用樣本中共鑒定的93 種風味物質，37 種化合物具有FEMA 編號，表3 概括了這些物質的風味信息。未在名錄上的56 種化合物，其生物安全性仍不確定，應是毒理學研究以及風味安全監管機構的關注重點，需對其進行加香卷煙煙氣體外與吸入毒理學評價研究等。

2.3 差異物鑒定

2.3.1 基于峰面積的差異物分析應用PCA 方法可視化分析不同類型香精香料樣本的風味化合物。3個主成分解釋了峰表數據的95.90%的總方差，所得模型中代表擬合優度及預測能力的R2X和Q2的值分別為0.970和0.962，因此模型較為合理可靠。圖2a給出了該PCA模型的得分圖。從圖中可以看出4類樣本的風味物質存在顯著差異，對應的得分分布明顯不同，而同類型不同批次樣本分布較為接近。該結果反映了樣本數據特征組分的分布共性和差異性。借助PLS-DA 模型進一步挖掘樣本組間的特征組分差異。模型中交叉驗證參數R2X 為0.969，R2Y 為0.996，Q2為0.996，CV-ANOVA 和置換檢驗結果均較好，說明了PLS-DA模型的可靠性。圖2b所示的香精香料樣品的PLS-DA得分圖與PCA的分析結果（圖2a）一致。利用PLS-DA模型中衡量每個變量對各組樣本分類判別的影響強度及解釋能力的變異權重參數值（VIP）輔助篩選標志變量，判別依據一般認為VIP > 1.0表示該變量具有重要作用，VIP值越大說明該化合物在樣本間的差異越顯著。根據VIP > 1.0且p< 0.05的標準，從4類樣本中共篩選出苯乙酮、苯甲酸乙酯、肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、糠醇、3-去氧-D-甘露醛酸、3-呋喃甲酸甲酯、苯乙酸、叔丁基酚、蘋果酸二乙酯、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-羥基丙酸等40種差異性化合物。

圖2 基于峰面積數據的香精香料樣品的PCA（a）和PLS-DA（b）分析得分圖Fig.2 PCA（a） and PLS-DA（b） score plots of flavor and fragrance samples based on the peak area data

2.3.2 基于總離子流圖的差異特征分析運用多尺度譜峰匹配（MSPA）方法［20］對各樣本GC-MS數據中的漂移色譜峰進行保留時間校準和譜峰匹配。以A 類和C 類中50 個樣本（剔除1 個奇異樣本）為例，圖3L是其在8.867~9.405 min范圍內的原始數據的總離子流（TIC）圖?？梢钥闯?，不同樣本的色譜峰存在明顯的漂移現象。因此，有必要進行譜峰漂移校準和峰匹配。圖3R 展示了經過MSPA 峰匹配處理的總離子流圖，可見峰匹配處理后不同樣本的各譜峰的保留時間基本一致，有利于更合理準確地進行數據分析。

在此基礎上，對4 類樣本的TIC 數據分別進行PCA 和PLS-DA 分析，結果如圖4 所示。其與基于特征組分峰面積數據的分析結果（圖2）一致：在95%的置信區間內不同類樣本區別明顯，同類型不同批次樣本的得分分布相近。圖5給出了PLS-DA 模型從4 類樣本的TIC 圖譜中篩選出的VIP > 1.0 且p< 0.05的特征變量（標記）與使用峰表數據建立的PLS-DA 判別模型發現的差異化合物（標記）相比較的結果?；赥IC 圖譜選擇的特征變量較多且有連續性，即這些變量對應特定組分的整體色譜流出輪廓，可以區別樣本的風味成分或香味物質（表4）。例如，保留時間（RT）分別為13.162 min 的3-甲基環戊烷-1，2-二酮、14.042 min的苯乙酮、16.613 min的乙基麥芽酚、17.238 min的苯乙酸和22.733 min的反式-橙花叔醇等。根據所標識的差異物質的譜峰分布、強度變化，可看出VIP 變量與峰表特征成分基本一致，但峰表數據更直觀地解釋了樣本差異成分。

表4 4種香精香料樣本的TIC數據經多尺度譜峰匹配后得到的差異性物質Table 4 Differential compounds in the MSPA-aligned TIC data of the flavor and fragrance samples

圖4 香精香料樣本峰匹配后TIC數據的PCA（a） 和PLS-DA（b） 分析得分圖Fig.4 PCA（a） and PLS-DA（b） score plots of the aligned TIC data of all the flavor and fragrance samples

圖5 4種香精香料樣本中差異成分與特征變量Fig.5 Differential components and feature variables in flavor and fragrance samples blue curve represented the average TIC profile of GC-MS data of samples，red open circle labelled the feature variables with VIP>1.0 & p<0.05 in the PLS-DA model on the MSPA-aligned TIC chromatograms，and dark green star indicated the differential components given in peak table（藍色曲線為樣本的GC-MS數據的平均TIC圖譜，表示PLS-DA模型中的VIP>1.0且p<0.05的變量，表示峰表數據中的特征成分）

2.3.3 韋恩圖分析疊加或交叉4 類樣本的差異物質數據集繪制韋恩圖（圖6），可直觀地展示不同樣本之間的共有組分與獨有特征物質，是代謝組學分析中的常用可視化工具。韋恩圖將篩選出的40種差異物質按照樣本類型分為A、B、C、D 4 個區域，每個區域內部包含該類樣本集合的元素，重疊部分表示共同元素的集合。圖6 顯示A、B 和D 類樣本分別具有10 種、9 種及8 種特征成分，然而C 類樣本不具有不同于這三類樣本的特征物質。結合表4，得到4 類樣本共有3 種風味成分：4-氧代戊酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛、乙酸。各類樣本特有的物質可作為樣本識別的潛在標記物，即A 類樣本中2-糠醛二乙縮醛、2-芐氧基-3-甲基-1，4-丁二醇、苯乙酮、苯甲酸乙酯、肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、7-羥基八碳二烯酸等可被認為是其標記化合物；B 類樣本中2-｛3-甲基丁烯基｝環己酮、2，4-二叔丁基苯酚、糠醇、3-去氧-D-甘露醛酸、5-氧代四氫呋喃-2-甲酸甲酯、二氫-5-甲基-5-（2-甲基丙基）-2（3H）呋喃、5-乙酰氧基-4-氧代己-2-烯酸甲酯、3-呋喃甲酸甲酯等是區別該類香精香料的關鍵；苯乙酸、甲基偶氮氧乙酸甲酯、叔丁基酚、蘋果酸二乙酯、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-羥基丙酸、5-異丙基-2-甲基環己酸乙酯等化合物有助于D類樣本的鑒定。

圖6 4種混合香精香料樣本中差異物質的韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential substances among four classes of flavor and fragrance samples

2.4 品質一致性分析

樣本生產的時序性等客觀因素使得不同批次間存在一定的質量差異。為更好地表征樣本批次間的質量波動情況，對鑒定出的各類樣本差異物質的相對含量均值（Mean）、標準偏差（SD）以及變異系數（CV）等進行比較分析。通常變異系數小意味著樣本批次相對穩定、品質一致性好，變異系數大則表示樣本批次間質量波動大、質量控制不足。以A 類樣本為例，統計結果如表5 所示?？煽闯龈髋伍g質量較為穩定的特征物質是變異系數為3.987%的7-氧代雙環［4.2.1］壬-2，4-二烯-8-酮、4.030%的苯乙酮以及4.054%的苯甲酸乙酯；變異系數為8.522%的肉桂酸、7.560%的3-脫氧-D-甘露醇內酯以及7.222%的乙酸等物質的批次間質量波動性略大。各物質的變異系數基本保持在10%以下，說明A 類樣本各批次的特征物質的質量較為穩定，批次效應小，品質一致性好。此外，通過該分析可得到各差異物質95%置信區間的相對含量范圍，如在95%的置信區間內反式-橙花叔醇的相對含量為0.251%～0.264%，肉桂酸的相對含量為0.554%～0.597%。這有助于鑒別風味類型的同時監控工業生產質量。

表5 A類樣本中特征差異物質相對含量的統計參數Table 5 Statistical parameters of the relative content（RC） of characteristic differential substances in flavor and fragrance samples of class A

3 結 論

本文運用GC-MS技術、代謝組學方法與風味學手段，評估不同風格特征、不同批次的香精香料樣品的組成成分、品質及差異情況。結果鑒定出93種風味化合物，其中酯類物質的數量最多，其次是酮類、醇類及酸類；各致香物質在樣本配方組成上差異較大，A 類49 種、B 類32 種、C 類48 種以及D 類39 種；共有揮發性化合物乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、異戊酸異戊酯、麥芽酚、二丙二醇、乙酸、4-氧代戊酸及5-羥甲基-2-呋喃甲醛可能是香精香料的重要物質組成；不同類樣本的風味特征不同，A 型和C型樣品中酯類含量最為豐富，通常用以柔和香氣，提供果香、花香及酒香氣味，B型中相對含量最高的是提供醇厚酸香特征的酸類物質，D 型香料中最多的為加強焦香、鮮果香風味的酮類致香物質。確定了肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、乙基麥芽酚、糠醇、苯乙酸、叔丁基酚、蘋果酸二乙酯、乳酸乙酯、2-羥基丙酸等40種關鍵差異風味物質以及各類樣本特有的潛在標識成分。該研究有益于促進混合香料的風味區分、復配調香、品質判斷以及質量控制。