QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定大米中16種香豆素和香蘭素及其衍生物

鄧 楠，尹芳平，劉 川，汪 輝，2*，向 芬，陳婭婭

（1.長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410036；2.國家酒類產品質量檢驗檢測中心（湖南），湖南 長沙 410036；3.張家界市高級技工學校，湖南 張家界 427000）

大米是中國人飲食結構中必不可缺的食材，其質量安全關乎人民的身體健康。2023 年“315”曝光的“香精大米”事件備受關注，一些不法企業通過向普通大米中添加香精的方式，使其帶有“香氣”，并包裝成“泰國香米”售賣，以謀取高額利潤。香豆素和香蘭素及其衍生物常作為增香劑被非法添加在大米中，長期食用這種大米會對人體健康產生危害［1］。

香豆素和香蘭素及其衍生物能散發出獨特的香味［2］，因此被廣泛應用于食品［3］、醫藥［4］、化妝品［5］和煙草行業［6］的增香領域?，F有研究表明，香豆素和香蘭素類化合物具有一定的生理毒性，過量攝入會導致飲食失調、頭暈惡心，甚至會對肝腎等器官造成損傷［7-8］。我國現行的食品添加劑使用標準GB 2760-2014［9］規定，香蘭素和乙基香蘭素被允許添加在較大嬰兒及幼兒配方食品中，其中香蘭素的最大使用量為7 mg/100 g，而在香豆素類合成衍生物中，只有二氫香豆素、6-甲基香豆素和八氫香豆素被允許添加在食品中，且大米中不得添加任何食品用香料、香精。

為加強大米質量的監督監管，保障消費者的權益和身體健康，研究大米中香豆素和香蘭素及其衍生物的高通量檢測方法十分必要。目前檢測香豆素和香蘭素及其衍生物主要采用氣相色譜法［10］、高效液相色譜法［11］、紅外光譜法［12］、氣相色譜-質譜聯用法［13］和液相色譜-串聯質譜法［14-15］等，上述檢測方法較為分散，覆蓋不全，檢測組分少，且操作繁瑣。與傳統的檢測方法相比，高效液相色譜-串聯質譜技術可將液相色譜的高效分離能力和質譜的高靈敏度結合，其多反應監測模式可以避免重疊峰引起的干擾［16］，具有定性準確、靈敏度高、分析速度快和準確度高等特點，是目前食品中非法添加香精的主流檢測手段。QuEChERS 法作為一種廣泛應用于食品檢測凈化過程中的前處理技術，利用基質分散萃取機理，將吸附劑填料與干擾物結合并通過相互作用去除雜質干擾，從而達到除雜凈化的目的［17-18］。其操作簡單快捷，可保護儀器免受污染。本研究采用QuEChERS 結合超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術，建立了大米中16 種香豆素和香蘭素及其衍生物的測定方法，同時采用同位素內標對檢測結果進行校準，有效減輕了基質效應對檢測結果的影響［19］。該法簡便高效，能實現大批量樣品的快速檢測，提高檢測效率，可為大米中非法添加香精的監管提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；氨水（HPLC 級，天津市光復科技發展有限公司）；甲酸（HPLC 級，天津市化學試劑研究所有限公司）；甲酸銨（LC-MS 級，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；無水MgSO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；十八烷基硅烷（C18，40~63 μm）和N-丙基乙二胺（PSA，40~63 μm）購于上海安譜科學儀器有限公司。

標準物質：7-甲基香豆素、香豆素、香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、二氫香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素（純度≥99%，北京曼哈格生物科技有限公司）；環香豆素、7-甲氧基香豆素、3，3-羰基雙（7-二乙胺香豆素）（純度≥97%，上海安譜璀世標準技術服務有限公司）；八氫香豆素（純度99.9%，上海畢得醫藥科技股份有限公司）；6-甲基香豆素、雙香豆素、羥甲香豆素（純度≥99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；苯丙香豆素、醋硝香豆素（純度≥96.0%，加拿大TRC公司）；4種香蘭素和香豆素內標混標（100 mg/L，上海安譜璀世標準技術服務有限公司）。

大米樣品：52批次監督抽查樣品，樣品涉及餐飲、流通、委托檢驗和監督檢驗等多個環節。

1.2 儀器與設備

AB Triple Quad 5500+液相色譜-質譜聯用儀（AB SCIEX 公司）；AS3120 超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；氮吹儀-34 位（N-EVAP116 型，Organomation Associates Inc.）；SK-1 型快速混勻器（江蘇金壇醫療儀器廠）；數顯型多管式旋渦混合器（EOFO 型，Talboys 公司），X1R-高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；超純水儀（法國默克密理博公司）；XS205DU 型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多科技（上海）有限公司）；有機針頭式過濾器（0.22 μm）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制稱取適量香豆素及香蘭素標準品10 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈溶解定容（其中雙香豆素先用二氯甲烷溶解），分別配制成質量濃度為1.0 g/L的香豆素和香蘭素及其衍生物的標準儲備溶液，-18 ℃避光保存。

準確吸取4 種香蘭素和香豆素混合內標溶液，用乙腈配制成D4-香豆素、D3-香蘭素、D3-甲基香蘭素、D5-乙基香蘭素質量濃度均為10 mg/L 的混合內標標準溶液。取適量標準儲備溶液用乙腈稀釋，配制成環香豆素、3’3-羰基雙（7-二乙胺香豆素）、7-乙氧基-4-甲基香豆素、苯丙香豆素、醋硝香豆素質量濃度為0.2 mg/L，7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素、雙香豆素質量濃度為0.4 mg/L，羥甲香豆素質量濃度為0.8 mg/L，八氫香豆素、香豆素、香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素質量濃度為2.0 mg/L，二氫香豆素質量濃度為30.0 mg/L的混合標準中間液，-18 ℃避光保存。

取適量標準中間液用空白基質溶液稀釋成環香豆素、3，3’-羰基雙（7-二乙胺香豆素）、7-乙氧基-4-甲基香豆素、苯丙香豆素、醋硝香豆素的質量濃度分別為1、5、10、25、50、75 μg/L，7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素、雙香豆素的質量濃度分別為2、10、20、50、100、150 μg/L，羥甲香豆素的質量濃度分別為4、20、40、100、200、300 μg/L，八氫香豆素、香豆素、香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的質量濃度分別為10、50、100、25、500、750 μg/L，二氫香豆素的質量濃度分別為150、300、750、1 500、3 000、6 000 μg/L的混合標準工作液，其中內標溶液為50 μg/L，現配現用。

1.3.2 樣品前處理稱取大米樣品5.0 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞離心管中，加入100 μL質量濃度為10 mg/L 的4 種香豆素和香蘭素混合內標溶液，再加入20 mL 1%甲酸乙腈，振蕩5 min，超聲20 min，于10 000 r/min 下離心3 min。精確移取2 mL 上清液于10 mL 離心管中，加入吸附劑150 mg C18、450 mg無水MgSO4后渦旋混合提取1 min，10 000 r/min離心3 min，上清液過0.22 μm濾膜后待測定。

1.3.3 色譜條件色譜柱：Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；進樣體積：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A 為0.2%甲酸水溶液（含5 mmol/L 甲酸銨），B 為乙腈；梯度洗脫程序：0~1 min，90% A；1~ 3 min，90%~60% A；3~10 min，60%~10% A；10~12 min，10% A；12~12.1 min，10%~90% A；12.1~16 min，90% A。

1.3.4 質譜條件電噴霧離子源（ESI源），正負離子同時掃描；多反應監測（MRM）模式；電噴霧電壓（IS）：4 500 V；離子源溫度（TEM）：500 ℃；霧化氣壓力（GS1）：379 kPa；氣簾氣壓力（CUR）：207 kPa；碰撞氣壓力（CAD）：62 kPa；輔助氣壓力（GS2）：379 kPa。各目標化合物的保留時間、定量和定性離子、去簇電壓（DP）及碰撞電壓（CE）等質譜參數見表1。

表1 16種待測組分和4種內標的保留時間及質譜參數Table 1 Retention times and MS parameters of 16 target compounds and 4 internal standards

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

根據待測物的電離特性，在ESI+和ESI-離子化模式下向質譜儀中注入各組分的單標溶液（質量濃度為10.0 mg/L）進行掃描，根據分子量和質荷比尋找到母離子，再通過子離子掃描進一步確定子離子信息，優化DP、CE 等質譜參數后獲取最佳定量和定性離子信號。其中，醋硝香豆素、二氫香豆素、羥甲香豆素、雙香豆素在負離子模式下的響應值最大，且雙香豆素在正離子模式下無響應，這是由于上述化合物含有羧酸基（—COOH）、羧酸鹽基（—COO—）、醇酸基（—OH）等強負電性基團，樣品呈酸性，在負離子模式下更易質子化［20］。其余12種化合物均在正離子模式下的響應值較大。最佳質譜條件如“1.3.4”所示。

2.2 色譜條件的優化

本研究的目標物較多，需在保證分離效果和穩定保留時間的前提下，縮短分析時間。小粒徑色譜柱具有更大的比表面積，柱效更好［21］，因此選擇Agilent SB-C18色譜柱（2.1 mm ×50 mm，1.8 μm）對16種待測組分進行分離。因乙腈洗脫能力強，對色譜柱的壓力更低，選擇乙腈為有機相流動相［16］?？疾炝?.2%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸銨水溶液、0.2%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）和水4種水相流動相對待測組分色譜峰分離效果、響應值和峰形的影響。結果表明，水作為流動相時，各待測組分的分離效果不佳，且羥甲香豆素的峰拖尾嚴重，峰形不對稱。當流動相中加入甲酸時，可以有效改善峰形和減弱拖尾［1］，同時可為正離子模式下提供必需的質子來源，提高離子化效率［22］。當流動相中同時加入甲酸銨和甲酸時，可提升正負離子的電離效果，正負離子模式下待測物的峰形較好，分離度和響應也較高。最終選擇0.2%甲酸水溶液（含5 mmol/L 甲酸銨）-乙腈為流動相。在此條件下，待測組分的提取離子流色譜圖（TIC）如圖1所示。

圖1 正離子（A）和負離子（B）模式下的提取離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatograms in positive（A） and negative（B） ion modes

2.3 提取方法的優化

2.3.1 提取溶劑的優化提取溶劑是影響化合物提取效率的主要因素［3］，根據提取溶劑的極性和待測物的溶解度等特征，分別采用乙腈、乙腈∶水（1∶1，體積比）、1%甲酸乙腈、1%鹽酸乙腈、1%氨水乙腈作為提取溶劑提取待測組分，各組分的回收率如圖2 所示。結果表明，乙腈∶水（1∶1）作為提取溶劑時，苯丙香豆素、羥甲香豆素、環香豆素、7-甲基香豆素、羥甲香豆素的回收率較低，這可能是由于香豆素類化合物在水中的溶解度相對較低［23］。乙腈作為提取溶劑時，羥甲香豆素和雙香豆素的回收率較低。1%鹽酸乙腈作為提取溶劑時，環香豆素的峰形分叉且回收率低。1%甲酸乙腈和1%氨水乙腈作為提取溶劑時，各待測組分的回收率均較高，進一步比較發現，1%甲酸乙腈提取時各待測組分的峰高略高于1%氨水乙腈。故選擇1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 凈化方式的優化由于食品基質較為復雜［3］，需進行凈化以降低基質干擾，保護儀器免受污染，同時保證待測物的回收率。PLS 固相萃取柱［24］和QuEChERS 鹽［25］可對樣品基質進行有效凈化。本研究考察了上述兩種凈化方式下目標化合物的提取回收率和凈化效果。結果表明，經PLS 固相萃取柱凈化后，雜質干擾略有降低，但16 種待測組分有一定損失，回收率不理想，特別是3，3'-羰基雙（7-二乙胺香豆素）、香豆素、二氫香豆素、6-甲基香豆素、7-甲基香豆素和八氫香豆素的回收率低于30%。而經QuEChERS 鹽凈化后，樣品的基質干擾降低，且16 種待測組分的回收率均較好，故選擇QuEChERS鹽進行凈化。

2.3.3 吸附劑的優化QuEChERS 法的常用吸附劑主要包括PSA、C18、無水MgSO4、石墨化碳黑（GCB）、氯化鈉等［26］，上述吸附劑可有效吸附樣品基質中的脂肪酸、有機酸、色素、水分等多種干擾物質［27］。根據16 種待測組分的特性和吸附劑特點，考察了PAS+C18+無水MgSO4、PAS+C18、PAS+無水MgSO4、C18+無水MgSO44 種不同種類凈化劑的吸附情況，結果表明，當吸附劑中添加PSA 時，苯丙香豆素、醋硝香豆素、二氫香豆素和羥甲香豆素的回收率較低。故選擇C18+無水MgSO4作為吸附劑，進一步考察了吸附劑中C18和無水MgSO4用量對待測組分回收率的影響。向提取溶液中分別加入C18（質量分別為50、100、150 mg）和無水MgSO4（質量分別為150、300、450 mg）兩兩組合的吸附劑，以回收率作為評價指標（見圖3）。結果表明，C18用量在50~150 mg范圍內各組分的回收率均較好，且C18用量越高，待測組分的峰高越高。無水MgSO4用量為300 mg時，各組分的平均回收率低于用量為150 mg 和450 mg 時。綜合考慮待測組分的回收率和峰高，選用吸附劑為150 mg C18+450 mg無水MgSO4。

圖3 吸附劑組成對16種待測組分回收率的影響Fig.3 Effects of cleaning agent components on recoveries of 16 target compounds

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍、檢出限與定量下限按照“1.3.1”方法配制標準工作液，在“1.3.3”和“1.3.4”儀器條件下進行檢測，內標法定量，其中D3-香蘭素作為香蘭素的內標，D3-甲基香蘭素作為甲基香蘭素的內標，D5-乙基香蘭素作為乙基香蘭素的內標，D4-香豆素作為其余13 種物質的內標。以定量離子峰面積與內標峰面積比值（y）對待測組分的質量濃度（x，μg/L）進行線性回歸分析，相關系數（r）均不低于0.998，表明各待測組分的線性關系良好。取16種標準品溶液，用空白基質溶液稀釋后采用本方法進行分析。以滿足16種待測組分的定量離子對MRM色譜峰信噪比S/N≥3和S/N≥10 分別確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到大米樣品中待測組分的LOD 為0.001~0.400 mg/kg，LOQ為0.004~0.600 mg/kg（見表2）。

表2 16種待測組分的線性范圍、檢出限與定量下限Table 2 Linear ranges，LODs and LOQs of 16 target compounds

2.4.2 回收率與相對標準偏差向陰性大米中加入低、中、高3 個水平的混合標準溶液［5］，每組做6個平行，進行加標回收實驗以評估方法的準確度和精密度，其中環香豆素、3，3’-羰基雙（7-二乙胺香豆素）、7-乙氧基-4-甲基香豆素、苯丙香豆素、醋硝香豆素的加標水平為0.020、0.040、0.200 mg/kg，7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素、雙香豆素的加標水平為0.040、0.080、0.400 mg/kg，羥甲香豆素的加標水平為0.080、0.160、0.800 mg/kg，八氫香豆素、香豆素、香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的加標水平為0.200、0.400、2.00 mg/kg，二氫香豆素的加標水平為1.200、2.400、12.000 mg/kg。在優化的實驗條件下，16 種待測組分的平均回收率為71.3%~120%，相對標準偏差（RSD，n=6）為1.6%~6.5%，表明該法的準確度和精密度較高，可用于大米樣品中16 種香豆素和香蘭素及其衍生物的檢測。

2.5 日內精密度與日間精密度

用大米空白基質溶液配制二氫香豆素質量濃度為150、300、1 500 μg/L，其余15 種物質質量濃度為50、100、300 μg/L的混合標準溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進行測定，考察待測組分的日內精密度；分別在0、24、48 h 進行測定，考察待測組分的日間精密度。結果表明，16 種待測組分的日內RSD（n=6）為1.0%~8.8%，日間RSD（n=3）為0.60%~14%，表明空白基質溶液中16 種待測組分在48 h內基本保持穩定。

2.6 實際樣品測定

將本方法應用于52批次隨機抽取的監督抽查大米樣品中待測組分的檢測，包括11批次餐飲環節樣品、26 批次流通環節樣品、3 批次委托檢驗樣品和12 批次監督檢驗樣品。結果顯示，所測樣品中均檢出香蘭素，這與文獻報道一致［1］。其中29 批次大米樣品中香蘭素的含量在檢出限與定量下限之間；23批次大米樣品中香蘭素的含量為0.040~0.064 mg/kg，表明香蘭素在大米中可能存在天然本底。其余15種待測化合物均未檢出。

3 結 論

本研究建立了一種QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜同時測定大米中16 種香豆素與香蘭素及其衍生物的方法，通過優化色譜、質譜條件和前處理方法，最終確定了合適的流動相、提取溶劑、凈化方式以及QuEChERS 鹽。該方法線性良好，準確度及精密度較高，前處理簡單，適用于大批量的大米樣品檢測，為大米監管、規范大米市場及維護消費者的切身利益提供了有力的技術支持。