齊墩果酸對B淋巴細胞損傷的保護作用并基于網絡藥理學探索其作用機制

代雨鑫，梁立春，彭琳茜，孟凡奇，韓獻鋒，張 玥，楊 玉，商 宇，

(1.佳木斯大學基礎醫學院微生態-免疫調節網絡與相關疾病重點實驗室，黑龍江 佳木斯154007；2.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江佳木斯 154003)

齊墩果酸是一種五環三萜類化合物，其化學名稱為3β-羥基齊墩果烷-12-烯-28-酸，在蘋果表皮、番木瓜果實、柿子的果實、李子、枇杷、大豆等多種植物與食物中廣泛存在[1]。齊墩果酸具有抗肝損傷、抗氧化、抗炎癥、抑制血小板聚集、降血糖和抗腫瘤等多方面的藥理作用，目前已經用于臨床治療急性黃疸型肝炎和慢性病毒性肝炎[2]。齊墩果酸具有免疫調節作用。在實驗性自身免疫腦脊髓炎小鼠中，齊墩果酸能夠使促進炎癥與抑制炎癥的免疫反應趨于平衡，并且促進自身免疫性腦脊髓炎相關腸道功能損傷的恢復[3]。本研究團隊之前也發現齊墩果酸能夠促進免疫缺陷小鼠腸道免疫功能的恢復[4]。

網絡藥理學是綜合利用網絡分析、系統生物學和藥理學等方法研究多組分、多靶點、多通路的藥物作用機制的學科，其通過構建藥物-靶點-疾病網絡揭示復雜疾病的發生機制和藥物治療的方式，并為新藥開發提供候選目標或方向[5]。體液免疫力是人體抵抗病原體感染、消除抗原性異物、保障健康的關鍵防線，其減弱將導致機體更容易遭受疾病的侵襲[6]?；诖?，本文從B 淋巴細胞發育的角度探索了齊墩果酸對體液免疫的調節作用。為了闡述其作用機制，我們利用網絡藥理學手段篩選了齊墩果酸的藥物靶點，并對其藥物靶點進行了蛋白質相互作用網絡分析、基因本體(gene ontology，GO)生物過程分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

1.1.1 主要試劑及儀器齊墩果酸(純度≥98%)、環磷酰胺(純度≥98%)、紅細胞裂解液均購于北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640 培養液購于美國思拓凡公司；Anti-CD45R(B220)-APC購于杭州聯科生物技術股份有限公司；Anti-IgD-PE 購于美國賽默飛世爾科技公司；BD FACSAriaTMCell Sorter 流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.1.2 實驗動物SPF 級昆明種雌性小鼠24 只(合格證號230781211100005414)，購于哈爾濱珍寶制藥有限公司，飼養于佳木斯大學實驗動物中心，許可證號為SYXK(黑)2021-018。小鼠飼養于恒溫、恒濕、12 h明暗交替光照循環的SPF 級動物室，允許其自由飲水與飲食。本研究已經通過佳木斯大學基礎醫學院生物與醫學倫理委員會的審查(批文號202311-2)。

1.1.3 動物造模適應性飼養2周后，采用隨機數字法將小鼠分為空白組、模型組和干預組，每組8 只。模型組與干預組小鼠在實驗第1～5 天每天腹腔注射環磷酰胺80 mg/kg(溶于生理鹽水)，空白組注射等體積生理鹽水[7]。干預組小鼠自實驗第6 天開始連續28 d每天灌胃給予齊墩果酸25 mg/kg(用2%的Tween 80配成混懸液)，空白組與模型組小鼠給予相應體積的2%Tween 80。

1.1.4 骨髓B淋巴細胞亞群測定在第35天，通過二氧化碳麻醉處死所有小鼠。分離股骨，用1 mL 無菌注射器吸取RPMI-1640培養液反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞，并通過200 目細胞濾網過濾。細胞懸液經300 g 離心5 min 后重懸于1 mL RPMI-1640 培養液中，再加入3 mL 紅細胞裂解液冰上裂解15 min，300 g離心10 min后將細胞重懸于400 μL染色緩沖液中。計數后，將細胞濃度調整至1×105個/mL。向細胞懸液中加入抗體Anti-CD45R(B220)-APC(稀釋20倍)與Anti-IgD-PE(稀釋20倍)，室溫避光孵育25 min。染色緩沖液清洗細胞，上流式細胞儀檢測，使用FlowJo X 10.0.7r2軟件對實驗數據進行分析。

1.2 網絡藥理學分析

1.2.1 數據庫篩選靶點從PubChem 數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取齊墩果酸的化學結構，用SwissTargetPrediction 數據庫(http://swisstargetprediction.ch/)預測齊墩果酸的藥物靶點。選擇可能性值(probability)＞0.1的靶點作為齊墩果酸的潛在藥物靶點。

1.2.2 蛋白質相互作用網絡分析與富集分析用String平臺(https://www.string-db.org/)對潛在的藥物靶點進行蛋白質相互作用網絡分析、GO 生物過程分析和KEGG 信號通路富集分析，用Cytoscape 3.6.0 軟件對蛋白質相互作用網絡分析結果進行可視化并計算連通性(degree)，用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)對GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析的結果進行可視化。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 齊墩果酸對免疫抑制小鼠骨髓B淋巴細胞亞群的作用

流式細胞術檢測結果顯示，在給藥4 周后，模型組小鼠的成熟B細胞亞群(IgD與B220雙陽性細胞)百分率為(2.585±0.248)%，明顯低于空白組(8.235±0.361)%，差異具有統計學意義(P＜0.01)；干預組小鼠的成熟B細胞亞群百分率為(3.395±0.445)%，明顯高于模型組而低于空白組，差異均具有統計學意義(P＜0.01)，見圖1。

圖1 齊墩果酸對免疫抑制小鼠骨髓B淋巴細胞亞群作用的代表性流式結果散點圖

2.2 齊墩果酸的潛在藥物靶點

通過SwissTargetPrediction 數據庫共檢索到100 個預測的齊墩果酸藥物靶點。以上靶點的可能性的中位數為0.100，因此以0.100 為閾值篩選潛在的藥物靶點。共發現76個藥物靶點大于閾值，其中可能性排位較高的前15個藥物靶點見表1。

表1 齊墩果酸可能性排名前15位的靶點列表

2.3 齊墩果酸藥物靶點相互作用網絡的樞紐觀察

經String 平臺分析，發現輸入的76 個藥物靶點涉及到292種相互作用。Cytoscape 計算繪圖后，得到71個節點。Cytoscape計算蛋白質相互作用網絡發現蛋白間連通性均值為8.225。連通性排名前5的節點蛋白有PPARG、PTGS2、PPARA、MAPK3 和HMGCR，表明它們在蛋白質相互作用網絡中起著重要樞紐作用，見圖2。

2.4 齊墩果酸藥物靶點的富集分析

通過GO 生物過程富集分析，發現齊墩果酸的藥物靶點在多個生物過程中富集，其中包括突觸傳遞的負調控、有絲分裂細胞周期停滯、脂質儲存的負調控、前列腺素的分泌、干擾素-γ信號通路的負調控及正調控B 細胞受體(B cell receptor，BCR)信號通路等。根據富集因子對這些生物過程進行了排序，排名前30 的生物過程見圖3。此外，在KEGG 信號通路分析中，齊墩果酸的藥物靶點被富集于29條不同的信號通路，其中包括PPAR 信號通路、花生四烯酸代謝通路、脂肪消化吸收通路、脂肪細胞中脂質分解的調控以及BCR信號通路等，見圖4。

圖3 齊墩果酸靶點的GO生物過程富集分析結果

圖4 齊墩果酸靶點的KEGG信號通路富集分析結果

3 討 論

齊墩果酸是天然產物有效成分領域的研究熱點，具有廣泛且復雜的生物學效應。齊墩果酸能夠調控Bcl-2 蛋白、HIF-1α、p21、p53 等蛋白質的表達水平，還能干預NF-κB、PI3K/Akt/mTOR 等信號通路，從而對細胞生長、凋亡、代謝等各個方面產生深遠影響[8]。在本研究中我們發現，在第35 天，模型組動物的骨髓成熟B 細胞亞群明顯低于空白組動物，說明免疫抑制動物模型成功建立；干預組動物的成熟B 細胞亞群百分率明顯高于模型組動物，說明齊墩果酸能有效促進免疫抑制動物B 淋巴細胞的發育與分化，顯示出其對B 淋巴細胞損傷的保護作用。為了闡明齊墩果酸的作用機制，本研究通過網絡藥理學方法，發現齊墩果酸的作用包括PTPN1、POLB、AKR1B10 和PTPN2 等諸多靶點。蛋白質相互作用網絡分析發現，在齊墩果酸的藥物靶點中PPARG、PTGS2、PPARA、MAPK3和HMGCR 在相互作用網絡中扮演著重要的樞紐角色。在過去的研究中，齊墩果酸被發現能調節PPARG 與PPARA 的表達，其作用可能與齊墩果酸降血糖效應有關[9]。在其他研究中，齊墩果酸及其衍生物被發現能夠通過抑制PTGS2的蛋白活性及表達水平抑制誘導型一氧化氮合酶的激活，從而誘導腫瘤細胞凋亡[8]。以上的證據表明，本研究中預測的藥物靶點確實與齊墩果酸的藥理作用密切相關。

在進一步的GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路分析中，本研究發現齊墩果酸的藥物靶點富集于肝功能密切相關的生物過程與信號通路，如脂質儲存的負調控以及脂肪細胞中脂質分解的調控等。另外，BCR 信號通路是GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路分析共同富集到的結果。BCR 信號通路在B 淋巴細胞的骨髓發育及離開骨髓后的分化過程中扮演著重要的角色[10]?；谙惹霸趧游飳嶒炛兴@得的結果，我們認為齊墩果酸可能是通過調控BCR信號通路影響了B 淋巴細胞的發育過程。在GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路分析中，藥物靶點MAPK3、CD81等被富集于BCR信號通路。CD81在B細胞的生理功能中扮演著重要的角色。CD81 是將CD19 從細胞內部運輸到細胞表面必不可少的因子，并且和CD19、CD21分子組成B細胞共受體復合物，從而降低了BCR激活的門檻，其純合致殘突變會導致人免疫缺陷綜合征的發生[11]。與其作用相似，MAPK3 能夠通過影響支持B淋巴細胞存活的BCR信號維持成熟B淋巴細胞亞群的數量穩定[12]。值得注意的是，在我們的結果中，MAPK3 是蛋白質相互作用網絡的樞紐節點之一，而CD81 在齊墩果酸的靶點預測中排名靠前。因此，MAPK3 與CD81 可能是齊墩果酸影響BCR 信號通路的直接藥物靶點。

總之，本研究利用網絡藥理學的方法初步分析了齊墩果酸對體液免疫的調節作用和其作用機制。結果提示，齊墩果酸具有提高體液免疫力的藥效學功能，能夠提高骨髓中成熟B 淋巴細胞亞群的比例。齊墩果酸可能是通過作用于MAPK3與CD81來影響BCR信號通路，從而在B 淋巴細胞的發育過程中發揮關鍵作用。在之后的工作中，本研究團隊將繼續對齊墩果酸的免疫調節作用進行深入研究，以期實現從基礎研究向臨床應用的轉化。