不同培養條件對小麥根際可培養微生物影響

呂路瓊，歐陽由男，葉淑珍，游雨欣，李斌，王艷麗

(1.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所 省部共建農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室 浙江省國家農作物品種抗性鑒定試驗站，浙江 杭州 310021；2.中國水稻研究所，浙江 杭州 310006；3.浙江大學 生物技術研究所，浙江 杭州 310058)

植物在生長過程中為微生物的生長和增殖提供大量生態位，如植物的內部[1]、根際[2]和葉際[3]，這些微生物群體及其基因組統稱為植物微生物組[4]。其中，與植物根部相關的微生物具有豐富多樣性，大約有數萬種，因而復雜的根際微生物又被稱為植物的第二基因組[2]。伴隨著植物的生命周期，根際微生物群落在植物營養和健康方面具有巨大潛力，如維持土壤功能、產生植物激素、抑制病原菌等多種途徑，促進植物的生長發育、增強植物抗病性，是植物健康和生產力的關鍵因素[5]。由于根際微生物的復雜和重要程度，近年來受到了廣泛關注[6]。

目前分離和培養植物有益微生物具有重要意義。這些分離到的微生物可以作為植物菌劑促進植物生長[7]、抵御生物脅迫[8]與非生物脅迫[9]。然而受培養基類型、培養條件等多種因素影響，在微生物培養過程中可實現不同種類微生物富集。例如在蘆薈根內生細菌群落組成的培養中發現變形菌門在植物混合提取物培養基上為優勢菌門，厚壁菌門在化學合成培養基上為優勢菌門[10]。并且部分有益微生物在群體中比例較低，分離培養時很容易忽略，難以使研究者完整地理解植物微生物組及其整體功能。目前高通量測序技術已被廣泛采用[11]，因為它們可以在一個樣本中鑒定出數千到數百萬個序列，揭示稀有微生物物種的豐度。

為探究不同培養方式對小麥根際微生物群落結構影響，本研究對小麥根際微生物取樣后置于兩種培養基與兩個充氧量進行培養，5 d后進行16S rRNA高通量測序，從而揭示小麥可培養根際微生物群落特征，為小麥根際微生物資源開發與利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取中國水稻研究所試驗田(杭州市富陽區黃田畈)種植的冬小麥揚麥20植株，試驗田面積1 334 m2，按照“五點取樣法”，每個取樣點選取生長健壯一致的小麥植株3株，先用農具將冬小麥植株松土，取出根系，除去根系上附著的泥土顆粒，沿植株基部剪去根系，稱重100 g根系，用1 L蒸餾水清洗麥根，用定性濾紙過濾，即為冬小麥根際微生物菌種，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2 培養基

大米加工的細米糠 (M培養基)：米糠50 g(由浙江國稻高科技種業有限公司稻米加工廠提供)，蒸餾水1 000 mL。

LANDY改良配方培養基(L培養基)：葡萄糖20 g，L-谷氨酸鈉5 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，蒸餾水1 000 mL。

LANDY培養基(D 培養基)：葡萄糖 20 g，L-谷氨酸鈉5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.15 mg，硫酸錳5 mg，硫酸銅0.16 mg，蒸餾水1 000 mL。

1.3 培養方法

將100 mL根際土壤溶液分別接種于M培養基(M處理)、L 培養基(L處理)和D 培養基(D處理)中，在微生物培養基(自主研發，ZL202120770944.2)中進行培養，培養溫度為 28.5 ℃、充氧泵空氣流量為100 L·min-1。將100 mL根際土壤溶液接種于L培養基，置于發酵罐(型號：JBF-100)培養作為對照，培養溫度為28.5 ℃，充氧泵空氣流量為8 L·h-1。培養5 d后收集樣品并盡快測樣。

1.4 DNA提取

根據制造商的說明，使用OMEGA土壤DNA分離試劑盒(OMEGA，Bio-Tek，Norcross，Norcross，GA，USA)從樣品中提取總基因組DNA。使用NanoDrop (ND-1000)分光光度計(賽默飛世爾科學公司，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國)測定提取DNA的質量。采用通用正向引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和通用反向引物806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對可培養根際細菌16S rRNA基因V3～V4區進行PCR擴增。將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，Illumina PE250上機測序。

1.5 數據處理

使用R語言繪制箱線圖，使用GraphPad Prism 8進行顯著性分析，并繪制堆積柱形圖與條形圖。

2 結果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

為分析不同培養基對大麥根際微生物培養的群落差異，本研究分別使用M與L 2種培養基，在微生物培養基中進行培養，以置于發酵罐培養基中的L培養基作為對照，在培養5 d后收集不同處理的微生物樣本(每個處理7個重復)，進行16S rRNA擴增子測序。共獲得有效序列2 675 135條，平均每個樣本127 387條序列，對應 17個門、28個綱、49個目、74個科、124個屬。

Alpha多樣性是指特定生境或者生態系統內的物種的豐富程度與多樣性情況。Chao1指數主要關心樣本的物種豐富度信息，數值越大，多樣性越高。Shannon指數綜合體現物種的豐富度和均勻度，數值越大，多樣性越高。如圖1所示，3種處理的Alpha多樣性存在顯著差異。其中D處理與M處理Chao1指數顯著高于L處理，M處理的Shannon指數顯著高于L處理且與D處理無顯著差異。說明D處理與M處理豐富度與多樣性高于L處理。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。A—Chao1指數；B—Shannon指數。圖1 微生物群落 Alpha多樣性分析Fig.1 Alpha diversity analysis of microbial community

2.2 群落組成分析

如圖2中A所示，在綱水平上，小麥根際可培養微生物群落主要由γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，擬桿菌綱(Bacteroidia)和芽孢桿菌綱(Bacilli)組成。其中D處理中γ-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱分別占比66.40%，17.44%，5.54%；L處理中γ-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱分別占比38.13%，3.61%，24.70%；M處理中γ-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱分別占比81.33%，3.09%，13.56%。如圖2中B所示，在屬水平上，大麥根際可培養微生物群落主要由克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)和氣單胞菌屬(Aeromonas)組成。其中D處理中克雷伯氏菌屬，普雷沃氏菌屬和氣單胞菌屬分別占比43.88%，12.35%，5.86%；L處理中克雷伯氏菌屬，普雷沃氏菌屬和氣單胞菌屬分別占比8.61%，31.36%，12.72%；M處理中克雷伯氏菌屬，普雷沃氏菌屬和氣單胞菌屬分別占比9.41%，16.39%，24.00%。以上研究結果表明，大麥根際可培養微生物具有豐富的多樣性，且不同培養條件對大麥根際微生物富集類群有很大差別。

A—綱水平；B—屬水平。圖2 小麥根際可培養細菌群落組成分析Fig.2 Analysis of the composition of cultivable bacterial communities in the wheat rhizosphere

2.3 FAPROTAX功能預測

FAPROTAX功能預測是利用多個已發表的可培養菌文章及自身的原核功能數據庫，根據輸入運算分類單元(OTU)信息提取功能完成預測。圖3為3個處理間對應細菌群落功能注釋預測的結果，不同處理樣品之間細菌群落功能注釋的預測結果存在很大差別。把細菌群落功能注釋排名前10的表現出來，分為5個大類：化能異養、發酵、碳循環、氮循環、鐵呼吸。D處理中與發酵、有氧化學異養、硝酸鹽還原、固氮作用等功能相關的細菌群落相對豐度最高；L處理中與氮氣呼吸、亞硝酸呼吸及亞硝酸氨化等功能相關的細菌群落相對豐度最高；M處理中與化能異樣、芳香族化合物降解和鐵呼吸作用等功能相關的細菌群落相對豐度最高。以上研究結果表明，大麥根際微生物含有多類植物有益菌，且不同培養方式會通過影響可培養微生物群落組成而影響其功能。

圖3 小麥根際可培養微生物功能預測Fig.3 Function prediction of cultivable microorganisms in wheat rhizosphere

3 結論與討論

在植物生長過程中，土壤微生物對其生長發育有著關鍵作用，因此，研究土壤微生物對促進農作物生長并提高產量具有關鍵作用[12]。然而自然環境中的微生物大多處于“貧營養”但營養元素豐富的狀態，實驗室中很難對自然環境進行模擬。同時在分離培養過程中，富營養細菌大量生長抑制寡營養細菌生長。目前能夠在微生物培養基上形成菌落的細菌數量通常只占土壤中細菌總數的一小部分[13]。研究發現，培養基類型和氧氣含量都會影響根際微生物群落組成[14]。本實驗分別選用天然培養基與化學培養基，在兩種充氧量下培養小麥根際微生物，5 d后采用16S rRNA高通量測序，以研究培養基類型與充氧量對小麥根際微生物影響。

在本實驗中，使用高充氧量(微生物培養基)進行培養時，米糠培養基內細菌群落Alpha多樣性高于LANDY改良配方培養基，表明天然培養基比化學培養基更有助于微生物培養。M處理中變形菌綱相對豐度最高，表明變形菌綱更易受培養基類型影響，該結果與前人[11]結果一致。自然培養基中含有大量未知天然營養成分，更適于微生物生長。在同時使用LANDY改良配方培養基時，低充氧量(發酵罐)的微生物群落Alpha多樣性高于高充氧量環境(微生物培養基)，說明根際微生物存在于土壤內層，在培養過程中并不需要大量氧氣。L處理中擬桿菌綱和芽孢桿菌綱相對豐度最高，表明這兩種菌更易受充氧量影響。氧氣含量在微生物培養過程中起到關鍵作用，這與前人[15]結果一致。

對小麥根際可培養微生物進行功能預測發現其含有很多促生菌，主要與化能異養、發酵、碳循環、氮循環、鐵呼吸等功能相關。由此推測小麥根際富含的優勢菌群對植物生長與健康具有重要作用。γ-變形菌綱在生理、形態和代謝等方面呈現出豐富的多樣性，對環境適應性強，繁殖速度快，在生態系統尤其是土壤系統中占主導地位[16，17]。γ-變形菌綱對碳氮循環具有重要意義[18]，也在適應環境變化和抵御逆境脅迫方面發揮重要作用。擬桿菌綱與變形菌綱也是氮循環的主要貢獻者。研究發現，隨著施氮量的增加，優勢類群中擬桿菌和變形菌相對豐度提高。嗜中性微好氧 FeOB均為變形菌門[19]。

本研究通過測定3種培養條件對小麥根際可培養微生物影響，結果表明，培養基類型和充氧量會顯著影響小麥根際微生物富集。小麥根際微生物含有大量與植物促生相關微生物，對農作物生長具有關鍵作用。