HS-SPME-GC-MS鑒定不同采收程度霞暉水蜜桃的風味物質變化

王塔娜，陳小龍，張佳輝，王冬蘭，王亞，宋立曉，馬鳳鳴，余向陽*

(1.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.江蘇省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所，江蘇 南京 210014；3.省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇 南京 210014)

桃(PrunuspersicaL. Batsch)隸屬于薔薇科，作為一種核果類果樹在世界各地均有栽培，是我國主要培育的果樹。水蜜桃因漿汁豐富，柔軟可口，甘甜鮮美而深受人們的喜愛。霞暉8號是江蘇省農業科學院園藝研究所2001年分別以中熟水蜜桃朝暉和中熟油桃瑞光18號為母本與父本進行人工雜交后，由四川省農業科學院園藝研究所2009年引進而成，2012年11月通過江蘇省農作物品種審核評定委員會鑒定并命名的晚熟桃品種[1]。果實內部品質是其評價指標的重要組成部分，果實品質指標包括感觀品質、營養價值、化學組成、機械加工性能和產品缺陷等[2]。其中香氣和滋味是感官品質指標的重要體現，主要取決于構成特征風味的化合物種類。在果實發育成熟與貯藏的過程中，風味物質的形成、釋放與代謝起著特別重要的作用[3]。研究人員通常希望通過對果品中香氣成分的檢測所得到的信息來評價其成熟程度，并結合其他化學計量學手段等[4-7]，以期為水蜜桃精準采摘、智慧化采摘提供科學依據。

風味是指品嘗時嗅覺、味覺和三叉神經這3種感覺特征的復雜結合，具體包括人們能感覺到的香氣、味道、口感以及外部特征[4]。有關桃果實風味物質的研究國內外已有報道[8-17]，迄今為止已有數百種桃果實的香氣成分被鑒定，主要包括醇類、醛類、烴類、酯類、酮類、內酯類和萜類等[2]。Horvat等[18]用毛細管氣液相色譜法和氣液相色譜-質譜法檢測到苯甲醛、芳樟醇、γ-癸內酯和δ-癸內酯等是桃果實的主要風味物質。一般認為，酯具有水果香味和花香味，其中γ-癸內酯具有桃子獨特的強烈果香味，而苯甲醛賦予了桃果實良好的風味品質[19]。近年來隨著水蜜桃的種植面積不斷擴大，人工采摘成本增高，智慧化精準采摘技術需求越來越大。因此，明確水蜜桃不同成熟度特征香氣成分，找出其特征差異物質，并結合人工智能發展，可為水蜜桃省力化栽培發展提供基礎依據。

頂空固相微萃取技術(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)是一種基于固相萃取技術的樣品分析預處理新技術，此技術分析前無需人工預濃縮，具有操作便捷、快速高效、安全環保、低成本等優點，常與色譜儀器聯合進行檢測[20]。本研究利用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)結合氣相色譜—質譜聯用儀(GC-MS)對霞暉水蜜桃果實中的風味物質進行測定，尋找水蜜桃果實內的香氣成分差異物質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用樣品為江蘇省農業科學院溧水基地采摘的霞暉水蜜桃，采摘后24 h內運回實驗室，經專業技術人員確認后，將有病斑、表面損傷等外觀異常的樣品剔除，在進行理化檢測時，同時將內部有病變的果實也從樣品集中剔除。隨后按照人工經驗并結合樣品的顏色、大小和硬度手動分成可采收和不可采收兩個類別(圖1)，每個成熟度共10份樣品，每份樣品30個桃樣品混合，共計600個桃樣品。

圖1 霞暉水蜜桃可采收和不可采收樣品Fig.1 Harvestable and non-harvestable samples of Xiahui

1.2 樣品制備

每份樣品中每個鮮桃采用四分法分成4份，取對角線的2份進行混合切塊，30個樣品混合后再切碎混勻用液氮速凍，然后放入研磨機(德國IKA艾卡)中進行勻漿，研磨機轉速為20 000 r·min-1，時間為50 s。

取3.0 g勻漿后的樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，將頂空瓶放入恒溫水浴鍋中，將已老化的進樣針插入密封的頂空瓶中，在60 ℃水浴中萃取1 h取出，立即插入GC-MS進樣口中，熱解析3 min。每次萃取樣品前將萃取頭于250 ℃下老化5 min，達到降低記憶效應的目的。

1.3 GC-MS分析條件

儀器型號為Thermo Fisher(賽默飛)TSQ8000EVO，色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；載氣為高純氦氣(純度99.999%)；載氣流速為1.2 mL·min-1；采用不分流的進樣方式；程序升溫：初始溫度40 ℃保持2 min，然后以6 ℃·min-1升至280 ℃，保持4 min；進樣口溫度為250 ℃。

質譜的離子源為EI源，電子能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：300 ℃；掃描范圍(m/z)：33～500 amu，采用全掃描的模式進行采集。

1.4 數據處理

定性分析：將Xcalibur工作站與NIST 17質譜庫提供的標準質譜圖進行對照，分析匹配度大于800的成分作為鑒定結果；利用NIST譜圖庫的數據處理系統按峰面積歸一化法進行定量分析，求得各化學成分在水蜜桃果實揮發性成分中的百分含量。

2 結果與分析

2.1 可采收與不可采收水蜜桃風味物質對比

采用HS-SPME結合GC-MC提取可采收與不可采收霞暉水蜜桃中的風味物質，總質子流色譜圖(TIC)如圖2所示。從圖中可以看出，不同采收程度的水蜜桃樣品色譜圖有差別，4.7～24.6 min內均有較大差異。

圖2 不同采收程度的霞暉水蜜桃果實風味物質GC-MS總質子流色譜圖Fig.2 GC-MS total proton flow chromatography of flavor substances in Xiahui fruits with different harvest levels

2.2 霞暉水蜜桃果實的香氣成分

通過統計分析鑒定到的風味物質化學成分見表1。霞暉水蜜桃共分離得到45種物質，主要包括醇類11種，酯類3種，內酯2種，醛類6種，酮類3種，酸類5種，胺類4種，烷烴類4種，其他類別7種(圖3)。鄧翠紅等[21]在大久保桃果實中鑒定出41種風味物質，主要包括揮發性醇類(11%)、醛類(16%)、酮類(24%)、酯類(28%)、酸類(2%)，其他物質占19%。李明等[17]在不同成熟期的3個品種桃果實中分別檢測出60、69和73種香氣成分，主要種類為酯類、醇類、醛類和內酯類化合物。

表1 鑒定得到的霞暉水蜜桃果實風味物質成分Table 1 Identified flavor components of Xiahui fruit

圖3 霞暉水蜜桃果實各風味物質所占比例Fig.3 Proportion of various flavor substances in Xiahui fruit

由表1和圖3可見，霞暉水蜜桃果實的風味物質中醇類(20%)占比最大，主要包括具有花香味的芳樟醇、檸檬香味的1-十一醇、甜花香氣的正癸醇以及紫丁香味的4-萜烯醇等。醛類(14%)主要包括具有櫻桃及堅果香的苯甲醛、強烈脂肪香氣的十二醛和青草味的己醛等。酸類(11%)主要是具有水果特殊香氣的十一烯酸、脂肪香氣的壬酸等。酯類(8%)和內酯類(6%)中具有強烈桃子香氣的γ-癸內酯、γ-十二內酯以及菠蘿和蘋果香氣的辛酸乙酯等。

2.3 不同成熟度主要風味物質的聚類分析

聚類分析結果如圖4所示，不可采收與可采收樣品分別為樣品1～10與樣品11～20，圖4將20份樣品聚為2類，除樣品13與樣品15聚類有誤，其他樣品均與人工分類一致，說明經驗分類具有較高的準確性。從縱向來看，檢出的化合物共聚類為2類，一類主要為有機酸，另一類主要為醇、醛、酯類。

2.4 不同風味物質的差異倍數與差異值分析

如圖5所示，樣品不同風味物質的差異倍數和差異含量值均有較大差別。隨著果實的成熟，秋水仙素、己醇和氧雜環十二烷-2-酮等10個化合物的含量逐漸升高，苯甲醛、1-十一醇、正癸醇、倍氯米松雙丙酸酯、壬酸、肼羧酸苯甲酯和麥角酰胺共7個化合物的含量降低(圖5中a)。在可采收的成熟樣品中鑒定出35種化合物，主要為γ-十二內酯、長春胺、十二(碳)烯、辛酸乙酯、十一醛、芳樟醇和十一烯酸等化合物。在不可采收的未成熟樣品中鑒定出31種化合物，主要為苯甲醛、十一醛、壬醛、辛酸乙酯、芳樟醇、環氧異長葉烯、十六烷和2，6-二叔丁基苯醌等化合物。

己醇、環十五醇、2-乙基己醇、2-丙基戊醇、2-硝基-2-氯丙烷、二乙基甲基硅烷、二十烷、N-乙酰秋水仙醇甲醚、二甘醇己基醚、二硫胺、己醛、十五烷酸共12種化合物僅為可采收的樣品中鑒定出，而1-十四醇、1-十一醇、4-萜烯醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、正十五烷、十六烷、肼羧酸苯甲酯、倍氯米松雙丙酸酯、異環磷酰胺、麥角酰胺、十二醛、2，6-二叔丁基苯醌以及12-羥基，順-9-十八碳一烯酸共13種化合物僅在未成熟桃中檢測出。

共有24種化合物隨著成熟度的增加而降低，主要為環氧異長葉烯、視黃醛、1-十四醇、十二醛、十一醛、9，10-十四碳烯醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、正十五烷、反式-2-己烯基己酸、2-蒈烯、2，6-二叔丁基苯醌、γ-十二內酯、12-羥基，順-9-十八碳一烯酸、4-萜烯醇、十六烷、異環磷酰胺、芳樟醇、麥角酰胺、肼羧酸苯甲酯、壬酸、倍氯米松雙丙酸酯、正癸醇、1-十一醇、苯甲醛，尤其如圖5中b所示，苯甲醛、1-十一醇、正癸醇3種化合物的相對含量值減少最大，分別為-21.15%、-18.5%、-6.04%。因此，苯甲醛、1-十一醇、正癸醇為未成熟水蜜桃中特征風味物質，苯甲醛具有苦杏仁味是桃中苦澀味的主要貢獻者，而1-十一醇與正癸醇分別具有檸檬香味與花香味，是未成熟桃中揮發性酸味貢獻者。

γ-癸內酯、1-十二(碳)烯、氧雜環十二烷-2-酮、秋水仙素、2-硝基環己酮、辛酸乙酯、長春胺、壬醛、2，4-二叔丁基苯酚、4-異丙基環己酮、十一烯酸共11種化合物隨成熟度增加而增加，尤其如圖5中b所示，γ-癸內酯的相對含量增加值最大為11.58%，γ-癸內酯是成熟桃中桃香味的主要貢獻者。

2.5 風味物質的特征香氣分析

風味閾值(threshold value)指人的嗅覺器官能夠感受到的呈香呈味化合物所需的最小濃度值，因此，當物質的風味閾值越小時，人們越能敏銳地感受到。表2總結了現有報道的18種風味物質的閾值與香氣特征，正癸醇的風味閾值最高為100 μg·L-1，因此，雖然檢測出該物質但實際品嘗過程中很難利用嗅覺辨別出正癸醇所帶的花香味，與之相反的苯甲醛的閾值最低僅為0.001 μg·L-1，因此，在桃子未成熟時很容易表現為苯甲醛的特征苦澀味。而己醛、芳樟醇、壬醛、辛酸乙酯、壬酸、2-乙基己醇6種化合物的風味閾值范圍為1～10 μg·L-1，因此，果實的風味并不只是取決于芳香物質的濃度值，每一種揮發性香氣成分對果實香氣的貢獻是由其風味閾值來主導的[22]，不同芳香物質的濃度值與風味閾值共同決定了其特有的感官感受。雖然現階段已經有較多芳香物質的風味閾值被確定，但表征桃香味的γ-癸內酯、γ-十二內酯還有待后續研究。

表2 霞暉水蜜桃果實部分風味物質的香氣特征單位Table 2 Aroma characteristic units of some flavor substances in Xiahui fruit

3 分析與討論

果實的香氣是隨著果實的成熟而形成的。研究表明，針對于部分呼吸躍變型果實而言，絕大多數揮發性成分是在呼吸躍變開始之后產生的[23]。如Song等[24]和Bangerth等[25]研究表明，過早采收的蘋果果實(呼吸高峰前4周)的香氣物質很少，總量遠遠低于采收果實的呼吸高峰期。陳成等[26]的研究認為，金艷獼猴桃在盛花期后160 d時，這個時期具有最多的酯類香氣種類，內在品質最好，也就是適宜采收的時期。梁水連等[27]對香蕉果實的不同后熟時期進行了揮發性物質的分析，結果表明，成熟階段其不同香氣成分的種類和含量有較大差異，綠熟期和過熟期的香氣種類最多，分別以反式-2-壬醛和乙酸異戊醇為主，該時期最適合開發食品香精。但不同水果其香氣種類與特征香氣成分具有較大差別。

韋節華[28]采用SPME-GC-MS對不同采收期的肥城桃香氣成分進行了檢測和分析。研究結果表明，隨著果實逐漸成熟，風味物質中酯類化合物的變化最顯著，其種類和總含量明顯提高，其中反式-己酸-2-己烯酯和乙酸異丙烯酯只在成熟前期檢測到，而辛酸乙酯和丁酸乙酯在成熟后期才被檢測到。Jia等[12]報道了清香型的C6醛類如己醛和醇類如己醇等在未成熟的白肉桃品種中為主要成分。Visai等[29]的研究表明，隨著桃果實的成熟，C6醛類和醇類的含量有所下降，但果香型的γ-十內酯、δ-十內酯以及花香型的苯甲醛含量明顯增加，并在成熟的桃果實中達到最大值。由霞暉水蜜桃未成熟不可采摘與成熟可采摘鑒定到的化合物比較得出，在果實逐漸成熟的過程中，香氣成分的種類與含量有較大的差異。酯類化合物如辛酸乙酯，內酯類化合物如γ-癸內酯，酮類化合物如2-硝基環己酮和4-異丙基環己酮等，相對含量差異倍數均大于0.1；醛類化合物如苯甲醛呈現先升高后降低的趨勢，與前人的研究在化合物種類與變化趨勢上具有一定差異，這可能與樣品的品種和成熟度有關。

4 結論

本研究通過采用HS-SPME-GC-MS對霞暉水蜜桃果實中的風味物質鑒定，發現霞暉水蜜桃果實的主要風味物質包括內酯、醛類、酮類、酸類、胺類、烷烴類和其他類別；其中主要的風味物質為苯甲醛、正癸醇、1-十一醇、壬醛、γ-癸內酯、芳樟醇、長春胺、壬酸、2-硝基環己酮、十一醛、1-十二(碳)烯、反式-2-己烯基己酸和2-乙基己醇等。聚類和差異值分析表明，不可采收的霞暉水蜜桃果實和可采收的霞暉水蜜桃果實中差異特征風味物質分別是苯甲醛(35.84%)降低和γ-癸內酯(17.81%)升高，其中苯甲醛的閾值最低僅為0.001 μg·L-1時，在桃子未成熟時可以感受到其特征苦澀味。隨著果實的成熟，酯類、內酯類和酮類化合物的含量降低，醛類化合物是未成熟桃果實中主要的香氣成分，而內酯類化合物構成了桃香氣的尾韻。由此可見，香氣成分可以作為水蜜桃成熟度的判別和品質評價的重要指標，本研究以期為水蜜桃智慧化采摘、省力化栽培發展提供基礎數據和科學依據。