一種適用于實驗教學的果蠅DNA提取新方法

魏 遠, 王宏剛, 朱玉山, 李艷君

(南開大學生物國家級實驗教學示范中心, 天津 300071)

果蠅是遺傳學科研和教學中被普遍使用的模式生物,具有染色體少、已定位的基因數多、突變性狀多等優點,是研究基因分離、連鎖交換、基因表達與調節的理想材料[1-2]。提取果蠅DNA并對其特定基因片段擴增是多個實驗項目中的必要步驟,被廣泛應用于各種基礎性或綜合開放性遺傳學實驗課程[3-5]。

提取DNA的質量直接影響后續PCR擴增、限制性酶切及基因測序等實驗效果[6-9]。采用常規昆蟲DNA提取方法提取果蠅DNA,耗時較長、成本較高,提取效果不穩定,不適用于本科實驗教學[10-11]。南開大學遺傳學實驗課程組將科研中常用的動物組織DNA提取方法改造后用于實驗教學,建立了一種高效提取果蠅DNA新方法,取得了良好的教學效果。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中的果蠅攜帶YAP基因,來源于南開大學吳世安教授實驗室。

1.2 方法

1.2.1 常規方法一提取果蠅DNA

將兩只果蠅麻醉后置于1.5 mL EP管中;加入50 μL含proteinase K(質量濃度20 mg/mL)的Squishing Buffer(SB)緩沖液后用研磨棒將果蠅充分研磨,如沾壁可稍離心;置37 ℃金屬浴孵育30 min,轉入95 ℃金屬浴孵育2 min;10 000 r/min離心3 min,取上清液作為DNA模板。

1.2.2 常規方法二提取果蠅DNA

用剪刀將100 μL移液器槍頭的尖部剪去少許后,用移液器吸取50 μL質量分數為5%的Chelex-100溶液(預先搖勻)到EP管中,另加入2 μL的proteinase K(質量濃度20 mg/mL);取兩只麻醉后的果蠅于EP管中,用研磨棒充分研磨,渦旋振蕩30 s,于1 000 r/min離心1 min混勻;將EP管置于56 ℃恒溫水浴鍋中水浴6 h,再轉入95 ℃水浴3 min,14 000 r/min離心3 min,取上清液作為DNA模板。

1.2.3 高效法提取果蠅DNA

取兩只麻醉后的果蠅于1.5 mL EP管中,加入50 μL NaOH堿裂解液(濃度100 mmol/L,pH 12),用研磨棒將果蠅充分研磨60 s,使果蠅蟲體被全部碾碎;將EP管放入干式恒溫器中100 ℃孵育10 min;之后加入50 μL Tris-HCL(濃度40 mmol/L)與原液充分混勻,經10 000 r/min離心2 min,取上清液作為DNA模板。

1.3 DNA質量濃度及純度檢測

3種提取方法各設3次重復實驗即得到9份樣品,分別取1 μL DNA使用DNA NanoDrop 2 000 C超微量分光光度計測定DNA質量濃度、A260/A280和A260/A230,比較3種方法提取DNA的質量濃度和雜質情況。數據采用平均值±標準差表示,并進行單因素方差分析,α=0.05。

1.4 PCR擴增

對提取DNA的YAP序列進行PCR擴增。引物序列上游為TGAAACAGCAAGAACTGCTTC;下游為 CACCACTGCTCCCATTCA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系20 μL,其中,含DNA模板0.4 μL,上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L),ddH2O 8.8 μL,TaqMaster Mix 10 μL。PCR擴增程序:95 ℃預變性 3 min;95 ℃變性15 s, 56 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,30個循環;72 ℃再延伸2 min,最后保持10 ℃。PCR儀為德國 Eppendorf公司。

1.5 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測

取擴增后的9份PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,評價3種方法提取的基因組DNA的PCR擴增效率。樣品量8 μL,DNA Marker 3 μL,核酸染料為GelRed 3 μL,電壓100 V,電泳時間20 min。DNA Marker DL 2000購于TaKaRa公司。通過凝膠成像儀(UVITEC cambridge)成像。

2 實驗結果

2.1 DNA質量濃度及純度檢測

統計DNA質量濃度、A260/A280、A260/A230、提取時長及成本數據(表1)。高效法提取的DNA質量濃度約670 ng/μL,與常規方法一提取量相似,濃度較高,且重復實驗的方差小,提取效果最穩定;常規方法二提取的DNA質量濃度較低且數據方差大,提取效果不穩定,與高效法相比差異顯著(P<0.01,圖1)。

** 表示P<0.01; ns 表示無顯著差異。圖1 3種方法提取DNA濃度顯著性分析Figure 1 Significance analysis diagram of concentrations of three methods of extracting DNA

表1 3種方法提取果蠅基因組DNA的質量濃度及A260/A280和A260/A230Table 1 DNA concentrations and A260/A280 and A260/A230 of three methods of extracting DNA from Drosophila melanogaster

通過測定A260/A280判斷樣品中蛋白質污染情況,純度較高的DNA的A260/A280在1.6～1.8,低于此范圍表明蛋白質含量超標,高于此范圍表明樣品中含有RNA。高效法提取樣品的A260/A280約為1.6,表明DNA純度較高,蛋白污染較小,且方差最小,重復性最好;常規方法一和常規方法二所提取樣品的A260/A280均低于1.3(表1),表明有蛋白質污染,與高效法相比差異顯著(P<0.01,圖2)。

** 表示P< 0.01; ns 表示無顯著差異。圖2 3種方法提取DNA 的A260/A280和A260/A230顯著性分析Figure 2 Significance analysis diagram of A260/A280 and A260/A230 of three methods of extracting DNA

通過A260/A230值判斷樣品中鹽離子干擾情況,若A260/A230小于2.0,表明有小分子和鹽類干擾。實驗表明,3種方法提取的DNA樣品中鹽離子均較多。

2.2 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠檢測

對YAP基因片段進行PCR擴增,3種提取方法獲得的DNA擴增產物的電泳條帶都比較明亮且單一,在1 000～1 500 bp (圖3)。3種提取方法獲得的DNA樣品都滿足實驗需求。

M:DNA Marker;1～3:常規方法一提取DNA擴增產物;4～6:常規方法二提取DNA擴增產物;7～9:高效法提取DNA擴增產物。圖3 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Figure 3 Electrophoresis of PCR products of DNA

3 討論與結論

3.1 提取DNA的質量

通過測定DNA濃度、純度以及檢測PCR擴增效果,判定提取DNA的質量。本文選用的3種方法提取果蠅DNA的質量均滿足實驗需求,且高效法提取DNA的濃度和純度與常規方法相比質量較高,且方差較小,重復性好,滿足實驗需求。常規方法二所使用的Chelex-100溶液的可溶性低,不同學生取液的濃度有誤差,導致DNA提取濃度不同,數據方差大,提取效果不穩定。

3.2 提取方法的選擇

本科實驗教學除了要講透實驗原理,訓練學生實驗技能,還要考慮實驗成本、授課時長、操作難度、安全性和成功率等因素[12-15]。常規方法一是科研實驗室的常用方法,但proteinase K使用量較大,試劑成本較高,人均超過3.5元,且提取時間略長,不適合本科生大班操作;常規方法二多用于法醫對DNA的鑒定,樣品需求量小,具有痕量檢驗的優勢,但提取效果不穩定,且耗時較長,需要6個多小時,超出課程時長(表1),也不適用于本科教學;高效法是課題組改良自科研中使用的提取小鼠指甲DNA的方法[16],研磨后的果蠅組織經pH 12的NaOH溶液裂解,再高溫加熱加快裂解速度,加入Tris-HCl可中和堿性、溶解蛋白質雜質,離心后DNA即在上清液當中。高效法操作步驟少,提取時長在20 min以內,試劑成本極低,提取果蠅DNA效果理想,可重復性高,非常符合本科實驗需求。

3.3 實驗教學效果

YAP蛋白是果蠅經典Hippo信號通路的主要效應因子,具有促進細胞增殖,抑制細胞凋亡的作用,其過表達會造成組織器官增大。YAP基因通常會和GAL4/UAS表達系統聯合使用,用于果蠅基因型與表型對應關系的實驗教學。南開大學遺傳學實驗以含有YAP基因的果蠅為實驗材料,使用高效法提取果蠅DNA擴增YAP基因,已在實驗教學中成功進行3輪,500余名學生操作成功率達90%以上(圖4)。

M:DNA Marker;1～9:學生使用高效法提取DNA擴增產物。圖4 學生PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Figure 4 Electrophoresis of PCR products of DNA by students

運用高效法提取DNA大大縮短了提取DNA的時間,降低耗材成本,提取效率高,為后續實驗設計奠定了基礎,推動課程建設,教學效果良好。