大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能

孫紅葉, 朱夢男, 姚改芳, 張 華, 金日生

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230009)

大豆磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)即磷脂酰膽堿水解酶,是一種高效的生物酶催化劑,催化大豆卵磷脂(PC)水解產生膽堿和磷脂酸(PA)[1-3],但高溫、極端的pH及有機溶劑會破壞酶蛋白的自身結構,導致其催化效率降低[4-5];且反應結束后,游離酶很難回收和再利用,導致生產成本增加[6-7],使得酶促反應發展十分緩慢。研究發現固定化技術可以解決上述游離PLD所存在的問題[8]。固定化酶的方法和載體是影響酶比活和固定化速率的兩個重要因素[9]。研究表明固定化后的PLD對pH的耐受性、熱穩定性、儲藏穩定性和運行穩定性都得到了明顯的提升[10-11]。近幾年納米及帶有多孔材料的載體成為了固定化酶的研究熱點[12]。由于介孔二氧化硅具有易于合成、可調節的孔徑、較大的比表面積、化學和力學特性穩定、生物相容性優異等特點,被廣泛應用到固定化酶中[13-14]。磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)在自然界中的含量極低[15-16],目前,其合成最有效的方法是利用PLD的轉磷脂?；磻谒?有機界面以大豆卵磷脂和L-絲氨酸作為反應底物進行催化合成[17-18]。由于酶轉化法合成PS發生在水-有機體系中,游離磷脂酶D與有機溶劑接觸會造成酶分子的變性,酶活性降低,導致催化合成PS的產率降低[19-20]。此外,游離酶不易回收利用,會使PS的生產成本增加[21]。

因此,本研究首先通過非極性溶劑輔助St?ber法制備納米級介孔二氧化硅作為固定化酶的載體,通過吸附-沉淀-交聯方式將PLD固定到介孔二氧化硅表面,優化固定化條件并對固定化后的PLD進行結構表征和熱穩定性及貯存穩定性研究;然后利用固定化PLD以大豆卵磷脂和L-絲氨酸為底物催化合成PS,并確定最佳合成工藝;最后對固定化PLD的循環使用性能進行研究,旨在通過固定化技術提高PLD的穩定性及催化性能,增加合成PS的產率,并實現磷脂酶D的回收重復使用,降低生產成本。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

STA449F5同步熱分析儀(德國耐馳有限公司);Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀(美國賽默飛世爾有限公司);Masterizer 2000激光粒度分析儀(上海善福電子科技有限公司);JEM-400 La B6透射電子顯微鏡(日本電子公司);高分辨場發射掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司);QuadraSorb SI(美國康塔儀器公司);UV-1600紫外分光光度計(上海菁華儀器有限公司);Agilent-1260高效液相色譜儀(美國安捷倫有限公司)。

1.2 試劑與材料

卵磷脂(純度為84.80%)由實驗室制備;磷脂酶D(蛋白含量為8.12×10-4μmol/g protein)、膽堿標準品(純度為98.00%)、磷脂酰絲氨酸標準品(純度為98.00%)和L-絲氨酸均購于美國sigma公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正硅酸四乙酯、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清蛋白(BSA)和乙酸鈉均購于上海阿拉丁試劑有限公司;甲醇和異丙醇為色譜純,均購于美國sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 介孔二氧化硅的制備 參考非極性溶劑輔助St?ber法制備介孔二氧化硅的方法[22]。稱取1.00 g CTAB置于三角瓶中,加入160.00 mL去離子水完全溶解;加入8.00 mL(25.00%～28.00%)氨水溶液,攪拌到溶液澄清透明;緩慢加入5.00 mL正硅酸四乙酯和20.00 mL正己烷的混合溶液;在35 ℃下200 r/min磁力攪拌器中將上述混合液攪拌成白色乳液狀之后,繼續攪拌12 h。反應結束后,在6 000 r/min下離心10 min,收集固體,將收集的固體分別用無水乙醇和去離子水清洗3次,在真空干燥箱中40 ℃干燥12 h,收集固體;將收集的固體置于550 ℃馬弗爐中高溫煅燒6 h,將模板劑CTAB脫除,即得介孔二氧化硅。

1.3.2 介孔二氧化硅的結構表征 將介孔二氧化硅在180 ℃的真空中至少脫氣6 h后,使用QuadraSorb SI分析儀測定介孔二氧化硅的比表面積、氣孔體積及孔徑。采用KBr壓片法測定介孔二氧化硅的紅外官能團,掃描波長為4 000～400 cm-1,掃描次數為64次。將介孔二氧化硅干燥后,在加速電壓為200 kV的場發射掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察并拍照。將介孔二氧化硅分散在乙醇溶液中,在透射電子顯微鏡(TEM)下觀察并拍照。將介孔二氧化硅均勻分散在去離子水中并采用Masterizer 2000馬爾文粒度分析儀測定介孔二氧化硅的粒徑大小并繪制曲線圖。

1.3.3 PLD的固定 稱取0.25 g介孔二氧化硅,加入7.50 mL 20 mmol/L pH 6.50的乙酸鈉-醋酸緩沖溶液溶解;加入1.00 mL 20 mmol/L pH 5.50的PLD酶液,置于35 ℃下先物理吸附2 h,加入5.00 mL乙醇沉淀劑,冰浴1 h,將物理吸附未吸附的PLD分子固定在介孔二氧化硅的表面上;最后加入0.40 mL 25%戊二醛交聯劑,交聯1.5 h,在6 000 r/min下離心10 min,收集固體,用pH 6.50乙酸鈉-醋酸緩沖溶液洗滌3次,在真空干燥箱中35 ℃干燥12 h,收集固體,得到固定化PLD。

1.3.4 PLD酶活性的測定 PLD酶活性的測定是根據D'Arrigo等[23]報道的方法,通過檢測磷脂酰對硝基苯酚(PpNP)在405 nm水解產生的對硝基苯酚來測定磷脂酶D的活性。取50 μL反應混合液(5 mmol/L SDS, 10 mmol/L PpNP和5% Triton X-100在10 mmol/L Tris/HCl, pH 8.00),加入400 μL(0.10 mol/L, pH 6.00,含2 mmol/L CaCl2)乙酸鈉-醋酸緩沖液和50 μL 2 mg/mL游離PLD溶液;在30 ℃下反應10 min,加入100 μL(pH 8.00, 1.00 mol/L Tris/HCl含0.10 mol/L EDTA)緩沖液終止反應。在405 nm處測定磷脂酶D的酶活性;酶活性的一個單位(U)定義為在合適的檢測條件下,1 min內磷脂酶D釋放1.00 μmol對硝基苯酚的量。固定化磷脂酶D酶活性的終止反應通過將固定化酶從反應中移除來實現。

1.3.5 固定化PLD蛋白固定化率的測定 酶蛋白的固定化率公式如下:蛋白固定化率=(初始酶液總蛋白-固定后殘余酶液總蛋白)÷初始酶液總蛋白。根據Bradford法測定酶液中蛋白質含量[24]。以牛血清蛋白(BSA)的濃度為橫坐標,595 nm測得的吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。取1 mL酶液加入到10 mL考馬斯亮藍溶液中并充分混合均勻,在紫外吸收波長為595 nm處測定吸光度。根據標準曲線即可計算PLD中蛋白質的濃度。每組試驗平行做3次以減少酶液中蛋白質含量測定的試驗誤差。

1.3.6 固定化PLD的單因素試驗 根據預試驗結果,以相對酶活性和固定化速率為指標,以沉淀劑(甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇及PEG6000)、最佳沉淀劑加入量(2、3、4、5、6 mL)、溫度(30、35、40、45、50 ℃)、pH(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、酶液體積(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL)、戊二醛體積(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL)作為單因素對固定化PLD的固定化條件加以研究。

1.3.7 固定化PLD的結構表征 采用KBr壓片法測定介孔二氧化硅及固定化后磷脂酶D的介孔二氧化硅紅外光譜,掃描波長為4 000～400 cm-1,掃描次數為64次。對介孔二氧化硅及固定化PLD的介孔二氧化硅進行熱重分析。樣品量為6～8 mg,Al2O3坩堝,溫度區間為30～800 ℃,升溫速率為10 ℃/min,保護氣為N2,氣體速率為20 mL/min。

1.3.8 磷脂酶D的穩定性 將游離和固定化PLD置于20～70 ℃下,每隔10 ℃保溫20 min后取出一定量的酶液,對其進行酶活性測定。將游離和固定化PLD分別在4 ℃下貯存50 d,每隔5天取出一定量的酶液,對其進行酶活性測定。

1.3.9 PS的制備 稱取20.00 mg磷脂酰膽堿溶解在12 mL乙酸乙酯中;稱取160 mg L-絲氨酸,加入2 mL pH 6.50的乙酸鈉-醋酸緩沖溶液溶解,加入35%的固定化PLD;將水相和有機相混合置于40 ℃的恒溫搖床中反應12 h,并每隔2 h從搖床中取出一定量的反應液用HPLC檢測,并根據標準曲線計算PS的產率。反應結束后,離心收集反應液,回收固定化PLD;將反應液低溫濃縮后冷凍干燥,得到PS產物。

1.3.10 PS產率的測定 稱取適量PS產物用5.00 mL甲醇溶解后倒入棕色容量瓶中,用甲醇定容至25.00 mL,0.22 μm有機膜過濾后HPLC上機檢測。色譜條件:柱溫為35 ℃,紫外吸收波長為205 nm,以異丙醇∶甲醇∶水(64∶26.4∶9.6,V∶V∶V)作為流動相等度洗脫,進樣量為20 μL,流速為0.50 mL/min時,采用Eclipse Plus C18(4.60 mm×250 mm,5 μm)色譜柱分離。以PS的峰面積為縱坐標,PS的濃度為橫坐標繪制標準曲線,根據標準曲線計算PS的產率。

1.3.11 PS產率的單因素試驗 根據預試驗結果,以磷脂酰絲氨酸產率為指標,以有機相(己烷、乙醚、石油醚和乙酸乙酯)、緩沖液(磷酸二氫鈉-磷酸一氫鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、乙酸鈉-醋酸和Tris-鹽酸)、溫度(25、30、35、40、45 ℃)、pH(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、底物質量比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、兩相體積比(1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8)作為單因素對磷脂酰絲氨酸合成條件加以研究。

1.3.12 固定化PLD的循環使用性研究 在相同的反應條件下測定游離PLD與固定化PLD分別在循環使用(1、2、3、4、5、6、7次)后的PS產率。

2 結果與分析

2.1 介孔二氧化硅的結構表征

在相對壓力為0.04～1.00、測定溫度為77 K時,介孔二氧化硅的N2吸附-解吸等溫線如圖1A所示,該等溫線符合IUPAC定義的IV型等溫線[25];根據測定結果計算介孔二氧化硅的總孔隙體積為1.35 cm3/g,表明介孔二氧化硅材料的孔隙率比較大;根據Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法計算介孔二氧化硅的BET比表面積為948 m2/g。根據圖1B吸附分支采用BdB球形模型計算出介孔二氧化硅的孔徑為8.20 nm,孔徑分布比較窄。介孔二氧化硅具有較大的BET比表面積、氣孔體積以及與磷脂酶D(7.60 nm×4.80 nm×5.70 nm)[11]相近的孔徑大小,不僅有利于吸附更多的酶分子,還不容易造成酶分子在載體上的脫落。介孔二氧化硅的粒徑測定結果如圖1C所示,介孔二氧化硅的粒徑分布為100～1 000 nm,其平均粒徑為335.10 nm。介孔二氧化硅的粒徑大小檢測結果趨于正態分布,而且曲線范圍較為集中,說明非極性溶劑輔助St?ber法制備的介孔二氧化硅粒徑比較均一。介孔二氧化硅的紅外光譜如圖1D所示,460 cm-1和800 cm-1附近的波段屬于Si—O—Si的彎曲振動峰和對稱拉伸,950 cm-1處的吸收峰為Si—OH彎曲振動,1 080 cm-1周圍存在強烈的吸收帶,對應Si—O—Si的不對稱拉伸振動。3 429 cm-1處的吸收峰為O—H鍵的振動吸收峰。胡盛[26]研究得知CTAB的2個主要紅外吸收峰分別為2 870 cm-1和2 950 cm-1,而圖1D的紅外光譜中沒有這2個紅外吸收峰,證明CTAB模板劑經馬弗爐高溫煅燒被脫除。介孔二氧化硅的掃描電鏡圖和透射電鏡圖分別如圖1E、1F所示,介孔二氧化硅表面存在氣孔結構,且介孔二氧化硅具有均勻的微球形結構可以為固定化磷脂酶D提供良好的固定化條件。

圖1 介孔二氧化硅的比表面積(A)、氣孔體積及孔徑(B)、粒徑分布(C)、紅外光譜圖(D)、掃描電鏡圖(E)和透射電鏡圖(F)Fig.1 Measurements of specific surface area (A), pore volume and pore size (B), particle size distribution (C), infrared spectrum (D), SEM (E) and TEM (F) of mesoporous silica

2.2 沉淀劑和最佳沉淀劑加入量對PLD酶活性的影響

研究表明,在固定PLD時使用不同的沉淀劑會影響相對酶活性,使用沉淀劑不當時還會造成酶蛋白分子發生不可逆的失活[11]。當溫度為30 ℃、pH為6.00、酶液加入量為0.60 mL、物理吸附時間為2.00 h、戊二醛加入量為0.60 mL、交聯時間為1.50 h時,研究甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇及PEG6000作為沉淀劑對PLD相對酶活性的影響。結果如圖2A所示,當選用乙醇作為沉淀劑時,磷脂酶D的相對酶活性為最大值(85.30%±0.60%);而其它幾種沉淀劑對磷脂酶D的相對酶活性都比乙醇作為沉淀劑時要低。因此,選取乙醇作為固定PLD的最佳沉淀劑。確定了最優沉淀劑之后,還需要對沉淀劑的加入量進行優化。當溫度為30 ℃、pH為6.00、酶液加入體積為0.60 mL、物理吸附時間為2 h、戊二醛加入體積為0.60 mL、交聯時間為1.50 h,乙醇作為沉淀劑時,研究乙醇加入量對固定化PLD相對酶活性的影響。結果如圖2B所示,隨著乙醇沉淀劑加入量的增加,PLD的相對酶活性先上升后降低,在乙醇沉淀劑加入量為5.00 mL時達到最大值86.30%±0.50%。綜上所述,乙醇沉淀劑最佳加入量為5.0 mL。

圖2 不同沉淀劑(A)和最佳沉淀劑乙醇加入量(B)對PLD酶活性的影響Fig.2 Effects of different precipitating agents (A) and optimal precipitating agent ethanol volume (B) on the enzymatic activity of PLD

2.3 溫度和pH對固定化PLD的影響

當pH為6.00、酶液加入體積為0.60 mL、物理吸附時間為2 h、戊二醛加入體積為0.60 mL、交聯時間為1.50 h、乙醇加入量為5.00 mL時,研究溫度對固定化PLD的影響。試驗結果如圖3A所示,固定化PLD的相對酶活和蛋白固定化率均隨著溫度的升高先上升后下降。當溫度為35 ℃時,固定化酶的相對酶活性和蛋白固定化率均達到最大值,分別為86.50%±0.70%和81.80%±0.60%。當固定化溫度為50 ℃時,PLD的固定化速率及相對酶活性還分別為68.22%和72.77%,說明固定化技術提升了PLD對溫度的耐受性。當溫度為35 ℃、酶液加入體積為0.60 mL、物理吸附時間為2 h、戊二醛加入體積為0.60 mL、交聯時間為1.50 h、乙醇加入量為5.00 mL時,研究pH對固定化PLD的影響。結果如圖3B所示,固定化PLD的相對酶活性和蛋白固定化率均隨著pH的增大先升高后降低。當pH為6.50時,固定化PLD的相對酶活性和蛋白固定化率均達到最大值,分別為87.27%±0.80%和82.57%±0.60%。綜上可知,在溫度為35 ℃、pH為6.50時,固定化PLD的蛋白固定化率和相對酶活性都達到最大值。

圖3 溫度(A)和pH(B)對固定化PLD相對酶活性和蛋白固定化率的影響Fig.3 Effects of temperature (A) andpH (B) on the relative enzyme activity and protein immobilization rate of immobilized PLD

2.4 酶液和戊二醛加入量對固定化PLD的影響

在溫度為35 ℃、pH為6.50、物理吸附時間為2 h、戊二醛加入體積為0.60 mL、交聯時間為1.50 h、乙醇加入量為5.00 mL時,研究酶液加入體積對固定化PLD的影響。結果如圖4A所示,當酶液加入體積為0.60 mL時,蛋白固定化率達到最大值(85.37%±1.10%)。當酶液加入體積為1.00 mL時,相對酶活性達到最大值(87.62%±1.20%)。當酶液加入體積過大時,PLD在介孔二氧化硅表面的排布會出現多層聚集、傳質阻力增大的現象,會導致PLD的相對酶活性下降,且由于介孔二氧化硅的比表面積有限,酶液加入體積過多也會使部分游離的PLD不能固定在介孔二氧化硅上,導致蛋白固定化率降低。因此,當酶液的加入體積為1.00 mL時,相對酶活性達到最大;當酶液的加入體積為0.60 mL時,蛋白固定化率達到最大值。在溫度為35 ℃、pH為6.50、物理吸附時間為2 h、酶液加入體積為1.00 mL、交聯時間為1.50 h、乙醇加入體積為5.00 mL時,研究戊二醛交聯劑加入體積對固定化PLD的影響。結果如圖4B所示,當戊二醛加入體積為0.40 mL時相對酶活性達到最大值88.89%±1.00%;當戊二醛加入量為1.00 mL時蛋白固定化速達到最大值86.36%±1.30%。綜上可知,戊二醛加入體積為0.40 mL時,相對酶活性最大;戊二醛加入體積為1.00 mL時,蛋白固定化率最大。

圖4 酶液(A)和戊二醛(B)加入量對固定化PLD相對酶活性和蛋白固定化率的影響Fig.4 Effects of enzyme solution amount (A) and addition volume of glutaraldehyde (B) on the relative enzyme activity and protein immobilization rate of immobilized PLD

2.5 固定化PLD的結構表征

固定化PLD的紅外光譜及熱重分析如圖5所示,圖5A為介孔二氧化硅固定化PLD的紅外光譜圖,460 cm-1和800 cm-1附近的波段屬于Si—O—Si的彎曲振動和對稱拉伸,950 cm-1處的吸收峰為Si—OH彎曲振動,1 080 cm-1周圍存在強烈的吸收帶對應Si—O—Si的不對稱拉伸振動;這4個吸收峰也是介孔二氧化硅和介孔二氧化硅固定化PLD所共有的吸收峰。肽鍵的紅外吸收峰分別為1 580 cm-1和1 620 cm-1[27],而介孔二氧化硅固定化PLD有1 580 cm-1和1 620 cm-1紅外吸收峰,表明PLD被固定在介孔二氧化硅載體上。圖5B為介孔二氧化硅固定化PLD的熱重分析(TGA),在30～100 ℃時,介孔二氧化硅及固定化PLD的介孔二氧化硅均發生了下降,分別下降了4.90%和8.10%,這一部分的損失是因為介孔二氧化硅中水分的蒸發。在100～500 ℃時,介孔二氧化硅的TGA曲線趨于一條直線,說明在該溫度范圍內介孔二氧化硅的質量沒有損失;但介孔二氧化硅固定化的PLD的TGA曲線的質量卻下降了5.30%,這一部分的損失可以歸結為酶蛋白的損失,通過TGA再次驗證PLD被固定在介孔二氧化硅載體上。

圖5 固定化PLD的結構表征Fig.5 Structural characterization of immobilized PLD注:A為FT-IR;B為TGA。

2.6 固定化PLD的穩定性

PLD的熱穩定性和貯存穩定性的測定結果如圖6所示,固定化PLD和游離PLD的初始酶性活均為100%。從20 ℃開始,每隔10 ℃取出一定量的酶液,分別測定游離及固定化磷脂酶D的相對酶活性。其結果如圖6A所示,在70 ℃時,固定化PLD的相對酶活性依然有66.40%;而游離PLD的相對酶活性只剩余15.30%。將游離及固定化PLD分別在4 ℃冰箱下貯存50 d,每隔5天取出一定量的酶液,分別測定游離及固定化磷脂酶D的相對酶活性。其結果如圖6B所示:游離的PLD在貯存50天時相對酶活性只剩余17.30%;而固定化PLD在貯存50 d時相對酶活性依然保留50.10%;固定化后的PLD的半衰期由20 d增加到了50 d。

圖6 固定化PLD的穩定性(A:熱穩定性;B:貯存穩定性)Fig.6 Stability of immobilized PLD (A: thermal stability; B: storage stability)

2.7 有機溶劑和緩沖溶液對PS產率的影響

當選用水-有機體系作為合成磷脂酰絲氨酸的反應體系之后,需要對有機相進行篩選。當卵磷脂與L-絲氨酸的質量比為1∶8、溫度為35 ℃,pH為6.00、有機相與水相的比為4∶1、固定化PLD的加入量為35%時,研究有機相對PS產率的影響。結果如圖7A所示,當選用己烷、石油醚、乙醚和乙酸乙酯作為有機試劑時,PS的產率分別為52.30%±1.40%、47.60%±1.60%、83.40%±1.70%和80.80%±1.50%。因乙醚比乙酸乙酯毒性高,所以選擇乙酸乙酯作為合成磷脂酰絲氨酸的有機相。當卵磷脂與L-絲氨酸的質量比為1∶8、溫度為35 ℃、pH為6.00、有機相與水機的比為4∶1、固定化PLD的加入量為35%時,研究緩沖溶液對PS產率的影響。結果如圖7B所示,當選用乙酸鈉-醋酸作為緩沖溶液時,磷脂酰絲氨酸的產率達到最大值(82.20%±1.50%),因此選取乙酸鈉-醋酸作為合成磷脂酰絲氨酸產率的緩沖溶液。

圖7 有機溶劑(A)和緩沖溶液(B)對PS產率的影響Fig.7 Effects of organic (A) and buffer solution (B) on the yield of PS

2.8 兩相體積比、底物質量比、溫度和pH對PS產率的影響

當卵磷脂與L-絲氨酸的質量為1∶8、反應溫度為35 ℃、pH為6.00、固定化PLD的加入量為35%時,研究兩相體積比對PS產率的影響。結果如圖8A所示,隨著有機相的增加,PS產率逐漸增大,當有機相與水相的比例為8∶1時,PS的產率達到最大值(83.40%±1.60%),而當有機相與水相的比例從6∶1增加到8∶1時,PS產率增加很小。綜合考慮PS轉化率和成本,選取有機相與水相的體積比為6∶1作為該合成體系的最佳體積比。當有機相與水相的比為6∶1、反應溫度為35 ℃、pH為6.00、固定化磷脂酶D的加入量為35%時,研究底物質量比對PS產率的影響。試驗結果如圖8B所示,當磷脂酰膽堿與L-絲氨酸的比例為1∶10時,PS的產率達到最大值(83.70%±1.80%),在卵磷脂與L-絲氨酸的比例為1∶8和1∶10時,PS的產率相接近。綜合考慮生產成本的因素,選取卵磷脂與L-絲氨酸的質量比為1∶8是較為合理的比例。在有機相與水相的比為6∶1、卵磷脂與L-絲氨酸的質量比為1∶8、pH為6.00、固定化PLD的加入量為35%時,研究溫度對PS產率的影響。試驗結果如圖8C所示,在溫度為40 ℃時,PS產率達到最大值(84.10%±1.70%)。在有機相與水相的比為6∶1、卵磷脂與L-絲氨酸的質量比為1∶8、反應溫度為40 ℃、固定化PLD的加入量為35%時,研究pH對PS產率的影響。試驗結果如圖8D所示,在pH為6.50時,PS產率達到最大值(85.10%±1.60%)。綜上可知,合成PS的pH為6.50,溫度為40 ℃比較適宜。

圖8 兩相體積比(A)、底物質量比(B)、溫度(C)和pH(D)對PS產率的影響Fig.8 Effects of two phase volume ratio (A), molar ratio of substrate (B), temperature (C) and pH (D) on PS yield

2.9 固定化PLD的加入量和循環使用次數對PS產率的影響

當有機相與水相的比為6∶1、卵磷脂與L-絲氨酸的質量比為1∶8、反應溫度為40 ℃、pH為6.50時,研究了固定化PLD的加入量對PS產率的影響。結果如圖9A所示:隨著加酶量的增加,PS的產率先快速上升后趨于平緩的狀態。當加酶量為40%時,PS的產率達到最大值(86.60%±1.40%),在最佳條件下測得副產物膽堿的含量為6.30%±1.70%、PS的純度為90.30%。因此,綜合考慮磷脂酰絲氨酸的轉化率,選取固定化PLD的加入量為40%時為最佳。酶的可重復使用性不僅可以影響經濟效益,也是實現工業化的重要前提[28]。對固定化PLD和游離PLD的催化性能進行比較和研究,結果如圖9B所示,介孔二氧化硅固定化PLD重復使用7次,PS的產率依然有61.30%±1.60%,而游離PLD重復使用4次,PS的產率只有21.60%±1.80%。綜上所述,固定化PLD在制備PS時具有純度高、催化性能好,可實現酶的多次重復使用的優點。

圖9 固定化PLD的加入量(A)和循環使用次數(B)對PS產率的影響Fig.9 Effects of addition volume (A) and recycling number (B) of immobilized PLD addition volume on PS yield

3 結論與討論

本研究利用大豆PLD的轉磷脂?；磻谒?有機界面,以大豆卵磷脂和L-絲氨酸作為反應底物合成PS。但游離PLD在高溫、極端的pH及有機溶劑中不穩定,容易發生變性,造成酶活性的降低;此外,游離PLD難以回收再利用,會增加PS的生產成本。

本研究制備的介孔二氧化硅的BET比表面積為948 m2/g、氣孔體積為1.35 cm3/g,孔徑大小與磷脂酶D相接近,為8.20 nm,平均粒徑為335.10 nm,且形貌為近球形結構,因此,選用介孔二氧化硅作為固定化PLD的載體。當溫度為35 ℃、pH為6.50、物理吸附時間為2 h、酶液加入體積為1.00 mL、交聯時間為1.50 h、乙醇加入體積為5.00 mL、戊二醛加入體積為0.40 mL時,固定化PLD的相對酶活性達到最大值(88.89%±1.00%),蛋白固定化率為80.76%±1.30%。使用制得的介孔二氧化硅固定PLD催化合成PS的最佳工藝條件:有機相與水相的比為6∶1、卵磷脂與L-絲氨酸的質量比為1∶8,反應溫度為40 ℃,pH為6.50、加酶量為40.00%,此條件下PS的產率為86.60%±1.40%,HPLC測定PS的純度為90.30%。

70 ℃時游離PLD的相對酶活只剩余15.3%,而固定化PLD的相對酶活性仍然有66.4%;貯存50%時游離PLD的相對酶活性只剩余11.2%,而固定化PLD的相對酶活性依然有50.1%。游離PLD被固定化后酶的半衰期由20 d延長到50 d。固定化PLD循環使用7次,PS的產率依然有61.70%±1.60%;游離PLD循環使用4次,PS的產率只有21.60%±1.80%。綜上可知,介孔二氧化硅作為固定化酶的載體時,PLD分子通過交聯作用可以形成堅固的酶網覆蓋在介孔二氧化硅表面上,使PLD的熱穩定性、貯存穩定性、對pH的耐受性以及催化性能均得到明顯的提升,并實現了PLD的多次回收重復使用。

本研究以高純度的大豆卵磷脂作為反應底物,利用PLD的轉磷脂?；磻铣纱蠖筆S。生物酶法制備的PS的產品純度較高,具有一定的工業化應用前景。李冰麟[1]選用納米二氧化硅作為固定化PLD的載體,通過吸附-沉淀-交聯固定化PLD,酶蛋白的固定化速率可高達80%;而本研究使用制備的介孔二氧化硅固定的PLD蛋白固定化率為80.76%±1.30%,表明本研究制備的介孔二氧化硅是較為理想的固定PLD材料。Zhang等[29]將PLD固定在用十八烷基三甲氧基硅烷修飾的有序介孔硅立方體(OMSC)中,固定后的PLD在40 ℃下相對酶活性為90%以上,固定化后,PLD的半衰期從25 d延長到40 d;本研究中使用制備的介孔二氧化硅固定的PLD在40 ℃下相對酶活性在91%以上,在70 ℃下相對酶活性仍然有66.4%,且游離PLD被固定化后酶的半衰期由20 d延長到50 d,表明使用本研究制備的介孔二氧化硅固定PLD可以顯著提高PLD的熱穩定性、貯存穩定性、對pH的耐受性以及催化性能。但本研究在酶催化制備PS時雖然選用了毒性比乙醚小的乙酸乙酯作為有機相,但是還具有一定的毒性,后續可以考慮其他綠色試劑替代乙酸乙酯有機溶劑。本研究只選用了納米級介孔二氧化硅作為固定化PLD的載體,固定化后的酶活性和固定化速率較為理想,后續還可考慮將介孔二氧化硅用其他官能團修飾作為固定化酶的載體制備固定化印跡PLD,盡可能使固定化的PLD的酶活性大于初始酶活性,加快PLD的催化性能,降低生產成本,提高成品的純度。本研究以卵磷脂和L-絲氨酸作為反應底物,利用PLD的轉磷脂?；磻谝宜嵋阴?水反應體系合成PS只是一個初步的探究,后續可以通過設計流化床式反應器,對該反應連續生產PS進行放大試驗。