缺血性腦卒中后促進轉錄因子EB核轉位改善神經元自噬流障礙的分子機制

李尚丹, 鄧儀昊, 何紅云

(1)昆明理工大學基礎醫學院人體解剖學教研室, 昆明 650500;2)昆明理工大學附屬安寧市第一人民醫院醫院辦公室, 昆明 650399)

缺血性腦卒中 (ischemic stroke,IS)是一種因大腦局部血流中斷造成中樞神經系統 (central nervous system,CNS)損傷的腦功能障礙疾病[1],誘發興奮性毒性、氧化應激、神經炎癥、細胞凋亡等一系列級聯反應,進一步加重缺血區神經元損傷甚至死亡[2]。在缺血性腦卒中缺血、缺氧和營養缺乏等應激條件的刺激下,自噬被不同程度激活以減輕神經元損傷[3]。自噬是一種由溶酶體介導的細胞內分解代謝機制,蛋白質、受損線粒體和內質網等自噬底物被膜包裹成自噬體,隨后與溶酶體融合,利用溶酶體中的酶將自噬底物降解后再利用,以維持細胞正常的結構和功能[4],這一動態的連續變化過程稱為“自噬流”[5]。

自噬流中任何一個步驟的中斷都會導致自噬流障礙[6]。自噬流障礙會導致自噬底物無法被及時降解進行再利用,進而加重大腦缺血區神經元損傷[7]。其中,溶酶體功能障礙和自噬體-溶酶體融合障礙是導致自噬流障礙的主要因素(Fig.1)[6]。溶酶體功能和自噬體-溶酶體融合嚴格受到轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)的調控[8]。TFEB的活性與其磷酸化狀態有關[9]。當TFEB的2個特殊的絲氨酸殘基Ser142和Ser211均被磷酸化時,TFEB留存在細胞質中為無活性狀態[10]。而去磷酸化的TFEB具有活性,會轉位進入細胞核激活自噬相關基因的表達,增強溶酶體功能并促進自噬體-溶酶體融合,進而改善自噬流障礙,減輕缺血性腦卒中后的神經元損傷[11]。

Fig.1 Neuronal autophagic flux dysfunction in ischemic stroke (Created with MedPeer (www.medpeer.cn)) The substrates to be degraded are engulfed by a flat membrane called an isolated membrane. When it is wrapped into a closed double-membrane organelle, autophagosomes are formed. Mature autophagosomes fuse with lysosomes to form autolysosomes. The components to be degraded are finally hydrolyzed by various acidic hydrolases in lysosomes, and the degraded components are recycled by cells. This continuous process is called autophagic flux. The interruption of any step in the autophagic flux of ischemic stroke will lead to autophagic flux dysfunction. The proteins and cellular components in the cells cannot be cleared in time and accumulate in large quantities, which in turn aggravates neuronal damage in the cerebral ischemic area

本文將詳細闡述缺血性腦卒中后TFEB核轉位的分子機制,進一步分析TFEB核轉位可增強溶酶體功能并促進自噬體-溶酶體融合,以期為未來臨床研究靶向TFEB改善自噬流障礙治療缺血性腦卒中提供理論依據。

1 自噬流障礙是腦缺血后神經元損傷的重要病理機制

溶酶體功能受損、過度自噬或自噬不足、自噬體-溶酶體融合障礙等都會導致自噬流障礙,使細胞中蛋白質和細胞成分無法被及時清除而大量聚集,誘發多種人類疾病,包括神經系統疾病、心血管疾病和癌癥等[12]。溶酶體發揮降解作用是依靠其內部的酸性水解酶實現的,包括組織蛋白酶D (cathepsin D,CTSD)、組織蛋白酶B (cathepsin B,CTSB)、組織蛋白酶L (cathepsin L,CTSL)等[13]。其中,CTSD是參與自噬-溶酶體降解底物的主要水解酶,改變CTSD活性或表達水平都可能會導致溶酶體功能受損[14]。Hossain[15]等研究發現,在原代神經元細胞中敲除CTSD會導致溶酶體功能障礙,進一步加重大腦缺血性神經元損傷。因此,溶酶體功能受損會引發自噬流障礙,加快缺血性腦卒中的病理進程。

在腦缺血時,過度自噬或自噬不足也會誘發細胞死亡并加重缺血性腦損傷[4]。過度自噬使細胞成分被溶酶體過度降解,造成降解產物大量堆積,引發自噬流障礙,導致細胞死亡[16]。在缺血性中風小鼠中,白細胞介素 (interleukin,IL)-17A水平顯著升高,IL-17A介導的過度自噬會加快神經元凋亡和壞死,從而加重缺血性腦損傷[17]。而自噬水平不足使得自噬底物不能被溶酶體有效降解,引發底物堆積,也會導致自噬流障礙[16]。此外,小鼠腦缺血會誘導miR-497表達,miR-497過表達會降低自噬水平,使自噬水平不足,誘導缺血后神經元的死亡[18]。由此可見,過度自噬或自噬不足都會引起自噬流障礙,繼而加重缺血性腦損傷。

自噬體與溶酶體的融合是自噬完成的關鍵,自噬體-溶酶體融合障礙會導致自噬-溶酶體不能形成,阻斷自噬流[19]。既往研究表明,突觸融合蛋白17(syntaxin 17,STX17)是參與自噬體和溶酶體融合的重要可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNARE)蛋白,使用腺相關病毒9 (adeno-associated virus 9,AAV9)敲低小鼠大腦中STX17會抑制自噬體和溶酶體的融合,加重腦缺血再灌注損傷 (ischemia-reperfusion injury,IR)程度[20]。因此,自噬體與溶酶體融合障礙會導致神經元自噬流障礙,加劇腦缺血誘導的神經元損傷。

綜上所述,自噬流障礙是腦缺血后神經元損傷的重要病理機制。新近研究表明,TFEB核轉位會通過及時清除自噬底物以促進細胞更新,改善自噬流障礙,對神經元細胞發揮保護作用[21]。

2 轉錄因子EB核轉位可改善卒中后的自噬流障礙

TFEB是進化上保守的小眼畸形轉錄因子 (microphthalmia associated transcription factor,MITF)家族成員之一,具有典型的堿性螺旋-環-螺旋-亮氨酸-拉鏈 (basic helix-loop-helix leucine zipper,bHLH-Zip)結構[22]。TFEB活化會激活自噬,進而調控凋亡、炎癥和氧化應激等信號過程[23]。更具體地說,TFEB的激活會促進自噬流,刺激線粒體自噬,限制活性氧 (reactive oxygen species,ROS)的產生,抑制炎癥小體的激活,并抑制白介素的分泌,最終抑制細胞焦亡和炎癥等反應[24, 25]。

TFEB是自噬流信號通路的關鍵中樞調節因子。TFEB與位于自噬和溶酶體基因啟動子區域的“協同溶酶體表達與調控 (coordinated lysosomal expression and regulation, CLEAR)”元件結合,進而驅動自噬過程和溶酶體生物發生相關基因的表達,包括自噬啟動相關基因 (BECN1、WIPI1、ATG9B和NRBF2)以及自噬體與溶酶體融合相關基因 (UVRAG,RAB7)等基因[26]。TFEB核轉位通過促進自噬體形成和自噬體-溶酶體融合,進而加快清除自噬底物,利于神經元存活[27]。根據研究顯示,在大鼠大腦皮質內源性神經干細胞中敲除TFEB會導致自噬流信號通路受損,使胞內蛋白質聚集體和受損細胞器無法被及時清除而積累,對神經系統造成損傷[28]。此外,擬人參皂苷F11 (pseudoginsenoside F11,PF11)在永久性腦缺血期間通過上調鈣調磷酸酶(calcineurin,CaN)活性進而促TFEB核轉位,減少自噬體及底物的異常堆積,以減輕自噬流障礙和缺血誘導的神經元損傷[29]。

綜上,TFEB是自噬流信號通路的關鍵調節因子,TFEB核轉位可改善卒中后自噬流障礙。而TFEB的表達、定位和活性受到翻譯后修飾的嚴格調控[30]。

3 轉錄因子EB核轉位的調控機制

TFEB的細胞定位和活性主要由其磷酸化調控[31]。生理條件下,磷酸化的TFEB與14-3-3黏附蛋白結合形成非活性形式的復合物錨定在細胞質中[32]。當細胞受到饑餓、溶酶體功能異常等外界刺激時,去磷酸化的TFEB與14-3-3黏附蛋白解離后活化,隨后從細胞質轉移到細胞核(Fig.2)[10]。

Fig.2 TFEB nuclear translocation enhances autophagic flux (Created with MedPeer (www.medpeer.cn)) The cellular localization and activity of TFEB are closely related to its phosphorylation. The activation of mTORC1 can inhibit its nuclear translocation by phosphorylating TFEB. Calcineurin mediates the dephosphorylation of TFEB.Dephosphorylated TFEB enters the nucleus and binds to the CLEAR sequence in the nucleus, promotes the expression of downstream lysosomal genes, and enhances the biosynthesis and physiological function of lysosomes

TFEB磷酸化由多種激酶催化,使其保留在細胞質中,包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1 (mammalian/mechanistic targets of rapamycin complex 1,mTORC1)、蛋白激酶C-β (protein kinase C-beta,PKC-β)、細胞外信號調節激酶 (extracellular signal regulated kinase,ERK)、蛋白激酶B (protein kinase B,Akt)、糖原合酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)等[10]。其中,mTORC1介導的TFEB磷酸化是最廣泛研究的信號轉導途徑[31]。TFEB是mTORC1的直接下游靶標[33]。在營養豐富、無溶酶體應激和液泡型三磷酸腺苷酶 (vacuolar-type adenosinetriphosphatases,V-ATPases)不被抑制的條件下,V-ATPases、Ragulator復合體和Rag GTP酶形成活性復合物,在溶酶體表面與mTORC1結合并激活mTCOR1[34]。mTORC1介導TFEB的2個絲氨酸殘基Ser142和S211磷酸化,磷酸化的TFEB與細胞質中的14-3-3黏附蛋白結合,掩蓋位于Ser241和Ser252之間的核定位信號 (nuclear localization signal,NLS),將TFEB保留在細胞質中[35, 36]。而在饑餓、溶酶體應激或V-ATPases抑制的條件下,Rag GTP酶被關閉,其從溶酶體表面釋放mTORC1并將其滅活[22]。由于mTORC1不能再磷酸化TFEB,去磷酸化的TFEB轉位到細胞核中并與其靶基因的CLEAR序列結合,上調自噬和溶酶體基因的表達[37]。

鈣調磷酸酶使TFEB去磷酸化,誘導TFEB由細胞質轉位到細胞核,激活其轉錄活性,以誘導激活自噬和溶酶體相關靶基因的轉錄[38]。在饑餓或高能耗的情況下,溶酶體通過粘脂蛋白1 (mucolipin 1,MCOLN1)釋放鈣離子,引起局部鈣信號轉導,激活鈣調磷酸酶,鈣調磷酸酶結合TFEB并使其去磷酸化,從而促進TFEB核轉位和靶基因轉錄[39]。

由此可見,TFEB通過磷酸化、去磷酸化在細胞質和細胞核之間不斷穿梭來快速響應環境變化,從而維持細胞穩態。

4 轉錄因子EB核轉位改善自噬流障礙減輕缺血性腦損傷的機制

4.1 TFEB核轉位增強溶酶體功能高效代謝底物

溶酶體在調節自噬流信號通路中發揮關鍵作用,是參與細胞內底物降解過程的細胞器,維持其功能的正常是維持細胞穩態所必需的[40]。TFEB磷酸化會抑制其核轉位,使溶酶體生物合成減少,最終導致溶酶體功能障礙[41]。而TFEB去磷酸化激活核轉位時,粘脂蛋白1(mucolipin 1,MCOLN1)介導溶酶體釋放鈣離子,調節溶酶體胞吐作用及溶酶體酶的分解代謝活性,以增加溶酶體的數量并增強溶酶體功能,加快病理條件下的細胞降解清除底物的速率[42]。我們以往的研究發現,腦缺血發生時,GSK-3β會增加TFEB磷酸化,抑制TFEB核轉位,使溶酶體生物合成減少,引起溶酶體功能障礙,加重神經元損傷。而抑制GSK-3β能促進神經元中TFEB核表達,增強神經元溶酶體功能,以達到神經保護的目的[43]。因此,TFEB核轉位增強溶酶體的功能后會高效降解代謝底物,進而改善自噬流障礙,從而發揮對腦缺血損傷的神經保護作用。

4.2 TFEB核轉位介導自噬體與溶酶體融合上調自噬流

自噬體和溶酶體的融合是溶酶體降解自噬底物的基礎[44]。TFEB核轉位不僅增強溶酶體功能,而且促進自噬體-溶酶體融合[45]。新近研究表明,運動促進皮層中TFEB的核轉位,促進自噬體與溶酶體融合,形成自噬-溶酶體,上調自噬流活性,有助于提高突變蛋白的清除效率[46]。并且,海藻糖通過上調腺苷5′-單磷酸激活蛋白激酶和輔激活蛋白關聯精氨酸甲基轉移酶1活性,進而誘導TFEB激活,促進自噬體與溶酶體融合,改善自噬流障礙,有效降低高鹽喂養的卒中型自發性高血壓大鼠的卒中發病率[47]。此外,蜜二糖通過促進神經元中的TFEB核轉位促自噬-溶酶體形成,改善自噬流障礙,從而賦予對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用[48]。上述結果表明,TFEB核轉位調節自噬相關基因的表達,促進自噬體與溶酶體融合,改善缺血性腦卒中后自噬流障礙。

5 問題與展望

自噬流障礙與缺血性腦卒中的發病機制密切相關,而TFEB在自噬流信號通路中發揮關鍵調節作用。目前,通過靶向TFEB以調節自噬流信號通路是減輕缺血后腦損傷程度的有效方法,但由于TFEB下游機制、靶基因以及TFEB激活的潛在機制尚未完全確定,促進TFEB核轉位的方法和分子機制仍有待進一步研究探索。此外,靶向TFEB調控自噬途徑的生物活性物質尚處于起步階段,未來具有巨大潛力。加大對TFEB的分子機制和藥物的研究力度有望成為開發治療缺血性腦卒中的新策略。