第三代EGFR-TKI耐藥性機制及聯合用藥治療的策略

周建宇, 秦曉紅, 米立志

(天津大學生命科學學院結構與分子生物學系, 天津 300072)

目前,癌癥的發病率和死亡率居高不下,嚴重威脅著人類的健康。其中,肺癌的發病率和死亡率均居前列,是導致死亡的主要癌癥類型之一[1]。如何有效治療肺癌是近些年備受關注的熱點問題。肺癌主要可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)。其中,非小細胞肺癌患者比例占八成以上[2]。而表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是非小細胞肺癌中最常見的致癌驅動基因之一,其下游信號在癌細胞增殖、分化和遷移等生理過程中發揮重要作用[3]。因此,靶向EGFR酪氨酸激酶小分子抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)成為治療晚期非小細胞肺癌的最有效的靶向藥物之一。目前,有三代EGFR- TKI被批準用于治療攜帶EGFR突變的非小細胞肺癌患者,在使用EGFR-TKI治療非小細胞肺癌的早期,均會取得較好的療效。吉非替尼(Gefitinib)和阿法替尼(Afatinib)等第一代、第二代EGFR-TKI在治療攜帶EGFR激活突變的晚期非小細胞肺癌患者中均取得了較好的療效,客觀應答率(objective response rate,ORR)和無進展生存期(progression-free survival,PFS)分別達到60%～70%和9～15個月,但最終仍會出現耐藥現象[4]。其主要的耐藥機制是由EGFR T790M突變引起,這一突變并未阻礙TKI與EGFR的結合,但卻增加了對ATP的親和力[5],從而產生耐藥性,降低了第一代、第二代EGFR-TKI的治療效果。以奧希替尼(Osimertinib)為代表的第三代EGFR-TKI為解決EGFR T790M介導的耐藥問題,通過和EGFR激酶上的C797殘基形成共價鍵,不可逆地抑制EGFR激酶活性,克服了T790M突變造成的耐藥問題[6]。但服用第三代EGFR-TKI治療的患者,在治療數月后仍會產生耐藥性。針對這一耐藥性問題,本文總結與回顧了EGFR的結構、第三代EGFR-TKI藥物的作用機制、已知的耐藥機制、以及耐藥后的治療策略,進而我們提出若干克服EGFR-TKI靶向耐藥性的可能思路。

1 表皮生長因子受體與非小細胞肺癌

EGFR是一種酪氨酸激酶,參與細胞增殖、分化以及癌癥的發展[7],其突變在EGFR-TKI靶向藥物的敏感性及耐藥性中發揮著關鍵作用[8]。EGFR也稱HER1或erbB1,與人類表皮生長因子受體-2(Human epidermal growth factor receptor-2,HER2)、人類表皮生長因子受體-3(Human epidermal growth factor receptor-3,HER3)及人類表皮生長因子受體-4(Human epidermal growth factor receptor-4,HER4)同屬表皮生長因子受體家族[9]。如Fig.1A所示,EGFR由胞外配體結合域、跨膜域、膜旁區、胞內受體激酶區和柔性C-末端組成。當受體的胞外域結合配體后,胞外亞結構域Ⅱ、Ⅳ之間的分子內相互作用被破壞,引起受體二聚化,進而激活胞內域的酪氨酸激酶?；罨募っ竿ㄟ^自我/相互磷酸化C-末端,進而招募細胞內的適配分子,從而將胞外信號傳遞到胞內的Ras/MAPK, PI3K/Akt 或JAK/ STAT3等信號通路(Fig.1B),促進細胞的生長與繁殖[10]。正常細胞內存在一系列負反饋機制, 例如受體的去磷酸化、近膜區絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化、受體的內吞、循環與降解等途徑, 最終將生長信號衰減和抑制[11]。

Fig.1 EGFR primary structure and receptor activation model (A) EGFR is mainly composed of extracellular domain, transmembrane domain, proximal domain, kinase domain, and C-terminal region; (B) Under the action of EGF ligands, EGFR monomers disrupt intramolecular interactions to form dimers that activate downstream signals

EGFR的過表達或異常激活是導致人類癌癥發生的重要因素之一[12]。EGFR在大多數實體腫瘤中過表達,例如乳腺癌、結腸癌、頭頸部、腎癌、卵巢癌和非小細胞肺癌[13],從而導致了腫瘤細胞的轉移、侵襲等現象的發生。而EGFR-TKI能夠選擇性結合攜帶激活突變的EGFR激酶區,競爭性抑制EGFR與ATP的結合,阻斷該信號通路,最終抑制癌細胞生長和轉移,并誘導癌細胞凋亡。但由于繼發突變等原因,接受靶向治療的患者會對EGFR-TKI產生耐藥性。

2 第三代EGFR-TKI的研發歷程

為了解決第一代、第二代EGFR-TKI治療中患者因攜帶EGFR T790M突變產生靶向耐藥的問題,第三代EGFR-TKI被相繼開發并應用于臨床。目前,Osimertinib已成為攜帶EGFR突變的非小細胞肺癌患者一線治療的標準治療藥物[14],其他在國內上市的第三代EGFR-TKI主要包括阿美替尼( aumolertinib) 和伏美替尼( furmonertinib)。這些第三代藥物不可逆地結合EGFR C797,對于EGFR T790M突變具有耐受性[15]。

第三代EGFR-TKI具有相同的母核結構(Fig.2),其中Osimertinib是一種單苯胺基嘧啶化合物,具有 Michael 受體結構,能夠通過不飽和丙烯酰鏈與EGFR ATP 結合位點的 Cys797 殘基形成共價鍵,不可逆地結合在EGFR激酶的活性中心,抑制激酶活性,阻斷其下游信號[16]。Osimertinib 對攜帶 EGFR激活突變和 T790M 耐藥突變的腫瘤細胞具有選擇性抑制功能。Aumolertinib和 Furmonertinib是在Osimertinib的結構基礎上進行優化的。Aumolertinib采用環丙基替換Osimertinib吲哚環上的甲基,這樣能夠和 Met790 側鏈形成疏水相互作用,從而提高對EGFR T790M突變型腫瘤細胞的抑制作用和選擇特異性。同時環丙基脂溶性高,使藥物對血腦屏障的穿透能力強。而Furmonertinib則是在母核結構上引入N原子,同時用三氟乙基和吡啶環分別取代Osimertinib上的甲基和苯環,以防止非選擇性代謝產物的產生[17],提高藥物活性和激酶選擇特異性,降低了脫靶效應,顯著地提高了藥物的療效?？偟膩碚f,第三代EGFR-TKI具有更高的選擇特異性和更低的毒性[18],在臨床上應用效果更佳。

3 表皮生長因子受體依賴的第三代EGFR-TKI耐藥

目前,已知的第三代EGFR-TKI耐藥機制可分為EGFR依賴型和非EGFR依賴型(Fig.3)。

Fig.3 Classification of main drug resistance mechanisms of the third generation EGFR-TKI amp: amplification; mut: mutation. Mainly including EGFR mutation, abnormal activation of bypass and downstream signals and histological phenotypic transformation[19]

3.1 EGFR C797S突變

EGFRC797S突變直接導致了Osimertinib無法與EGFR激酶共價結合,致使其因喪失對EGFR激酶的高親和力而失效。Osimertinib用于一線治療時,出現耐藥性的患者中有約7%的患者具有C797S突變[20],而在Osimertinib用于二線治療時,耐藥患者中出現C797S突變的頻率達到14%,居二線治療中所有耐藥機制發生頻率的首位,可見Osimertinib在一線和二線治療非小細胞肺癌中的耐藥機制存在差異[21]。有數據表明,二線治療時,攜帶C797S突變的患者通常也會保留T790M突變,而C797S突變和保留的T790M突變又可根據二者是否位于同一條DNA鏈上分為順式結構和反式結構(Fig.4)[22]。當EGFR C797S和T790M的突變為反式結構時(位于不同等位基因),腫瘤細胞依舊保留對第一代、第二代EGFR TKI敏感性,聯合第三代EGFR-TKI可有效抑制腫瘤細胞的生長;但是對于順式結構的突變目前仍無有效的用藥策略[23]。

Fig.4 Diagram of the cis and trans structures of the EGFR T790M and C797S mutation at the allele The T790M and C797S mutations are cis structures located on the same DNA strands; The T790M and C797S mutations are trans structures located on different DNA strands

3.2 其他EGFR罕見突變

在NCLSC晚期,患者體內還能夠檢測到耐藥相關的罕見EGFR突變,例如G796D、G796R[24]、G796S[25]、L792X、L718Q[26]、L718V[27]、G724S[28]和L747S[29]等。與C797相鄰的G796發生G796S、G796R、G796D等突變均為溶劑前沿突變,對于Osimertinib與EGFR的結合具有空間位阻效應,其中G796R突變的影響最大[30, 31]。EGFR L792X突變位于EGFR蛋白激酶結構域中N-lobe與C-lobe連接的鉸鏈區口袋,能在空間上干擾Osimertinib苯環上的甲氧基,破壞其與激酶結構域的結合[31]。EGFR L718殘基位于EGFR激酶結構域的ATP結合部位,其發生L718Q和L718V突變均能夠通過空間位阻來阻止EGFR-TKI與EGFR結合,在2%的Osimertinib一線治療患者中檢測到L718Q突變[32]。

4 表皮生長因子受體非依賴的第三代EGFR-TKI耐藥

非EGFR依賴性耐藥是指與EGFR自身突變無關的耐藥機制,通常是由于出現一種或多種旁路信號激活、上調下游信號或發生組織表型轉換所導致。因此,一般無法通過測序檢測出這一類型的耐藥。

4.1 EGFR旁路信號激活

4.1.1 HGF過表達與C-Met擴增 C肝細胞生長因子受體(cellular-Mesenchymal-epithelial transition factor,C-Met)的高表達在肺癌對EGFR‐TKIs產生耐藥性的過程中發揮重要作用[33]。攜帶EGFR激活突變的非小細胞肺癌患者常伴有C-Met擴增[34]。而肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)是C‐Met的配體,可通過激活C-Met通路,誘導癌細胞對EGFR‐TKI產生抵抗[35, 36]。攜帶野生型EGFR腫瘤患者血漿中HGF水平顯著升高。但無論EGFR突變狀態如何,低HGF水平與EGFR-TKI較高的應答率、較長的無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)顯著相關。在對FLAURA的研究數據進行多變量分析時發現,EGFR突變(P=0.002)和低HGF水平(P=0.031)均可獨立預測PFS的延長,而活動狀態(performance status,PS)為0(P=0.001)和 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)低水平(P=0.002)則可獨立預測OS的延長[36]。

4.1.2 HER2擴增 HER2與EGFR同屬EGFR受體酪氨酸激酶家族。它會激活PI3K/Akt等下游通路,其擴增在眾多EGFR-TKI耐藥性機制中占有相當大的比例[37]。在Osimertinib用于一線治療所產生耐藥的患者中,發現大約2%的患者有HER2的擴增,在二線治療和臨床篩查中也發現有HER2擴增[20]。體外實驗表明,EGFR T790M突變細胞系中過表達HER2能夠降低該細胞系對Osimertinib和羅西替尼(Rociletinib)的敏感性,使其對2種TKI藥物產生耐藥性[38]。

4.1.3 IGF1R異常 1型IGF受體(Insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)是一種跨膜酪氨酸激酶受體,可以被胰島素樣生長因子(IGF1或IGF2)激活,引起自身酪氨酸激酶結構域的磷酸化并引發胞內信號傳導,調控細胞的生長和分化,參與高等生物的生長、發育、衰老等各種生命活動[39]。IGF1R的異常激活也是造成EGFR-TKI耐藥的重要原因之一[40]。在攜帶EGFR T790M 突變的非小細胞肺癌中,IGF1R介導的信號傳導在EGFR-TKI發生耐藥的早期階段發揮作用。由于IGF1R的競爭蛋白質-胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP3)表達缺失,IGF1R信號得以激活,導致腫瘤細胞對EGFR-TKI耐藥;而引入IGF1R抑制劑BMS 536924能使腫瘤細胞恢復對EGFR-TKI的敏感性[41]。

4.1.4 成纖維細胞生長因子受體信號傳導 成纖維細胞生長因子受體(FGFR)是一種酪氨酸激酶受體,調節細胞增殖和分化等生物過程,同時也是癌癥治療的一個重要靶點[42]。在Osimertinib耐藥的患者中發現,有FGFR1擴增及其配體FGF2的表達上調,這表明FGF2-FGFR1信號通路可能是導致Osimertinib耐藥的一個潛在因素[43]。

4.2 EGFR下游信號激活

4.2.1 K-RAS突變 RAS是由原癌基因編碼的一種小型GTP結合蛋白,介導膜表面生長因子受體、細胞內信號通路和轉錄因子活性的偶聯,是EGFR重要的下游信號通路。RAS /RAF /MEK/ERK信號通路異常激活會導致對EGFR-TKI耐藥[44],并與腫瘤發生、侵襲和不良預后相關[45]。在經Afatinib治療后再使用Osimertinib治療,一段時間后在產生耐藥的患者中檢測到 K-RAS突變和 EGFR 高表達[46]。由于K-RAS和GTP的高親和力以及其獨特的結構,使得開發靶向K-RAS的競爭性抑制劑充滿挑戰,因此,臨床上急需探索全新的治療方法來解決K-RAS突變帶來的耐藥問題[47, 48]。

4.2.2 PTEN缺失PTEN(Phosphatase and tensin homolog)是目前為止發現的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因,編碼具有蛋白質磷酸酶和磷脂磷酸酶活性的雙磷酸酶,在PI3K/Akt信號通路中發揮重要作用[49]。PTEN作為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)脫磷的脂質磷酸酶,能降低PIP3的水平,負調控PI3K/AKT信號通路,從而達到抑癌目的[50]。對2名Osimertinib二線治療中出現原發性耐藥的非小細胞肺癌患者進行檢測,發現了與PTEN缺失有關的K-RAS G12D突變的情況,該突變在Osimertinib一線治療和后續治療出現的耐藥中都有報道[51]。

4.2.3 BRAF突變BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)編碼的BRAF蛋白,在RAF信號通路中發揮重要作用,是MAPK信號通路中一個非常重要的信號轉導分子[52]。BRAF突變可以導致MAPK信號通路活性增強、細胞周期調控紊亂、細胞生長及遷移失控等,進而導致腫瘤的發生與發展,以及肺癌和結直腸癌等對EGFR-TKI治療的耐藥抵抗[53, 54]。在約1%的非小細胞肺癌獲得性耐藥患者樣本中發現有BRAF突變(G469A和V600E),而BRAF突變與預后不良等密切相關[55]。研究者發現,靶向BRAF V600E 突變的抑制劑Enorafenib 與Osimertinib聯合使用可有效抑制耐藥細胞的生長[56]。

4.2.4 PIK3CA突變PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha)是一種常見的致癌基因,編碼PI3K的催化亞基,PIK3CA基因突變通過PIK3/Akt的途徑引發AKT持續活化,抑制細胞凋亡,造成對 EGFK-TKI的耐藥[57]。在接受一線Osimertinib治療的患者中,在6例病例中發現了PIK3CA E453K、E545K和H1047R突變,其中E545K最具代表性(4% ),并且 PIK3CA E545K突變在介導Osimertinib耐藥性中的作用已在體外得到證實[32, 58, 59]。對在Osimertinib二線治療耐藥的患者進行檢測,發現有約10%的患者有PIK3CA的擴增和突變,例如E545K、E542K、R88Q、N345K和E418K等突變[21, 51, 60-62]。

4.3 組織學表型轉變

4.3.1 上皮-間充質轉化 上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞轉化為間充質細胞的生物學過程,主要表現為E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)表達的喪失和纖連蛋白(fibronectin)及波形蛋白(vimentin)表達的增加,是獨立于T790M突變肺腺癌患者產生EGFR-TKI耐藥的機制[63]。對Osimertinib獲得性耐藥的非小細胞癌患者的細胞表現出了上皮細胞連接蛋白質(例如E-cadherin)減少、間質細胞標記(例如vimentin、fibronectin)增加等EMT典型特征[64]。在使用抑制劑逆轉EMT過程后,獲得性耐藥的腫瘤重新恢復了對Osimertinib的敏感性[65]。

4.3.2 細胞類型轉化 這里的細胞類型轉化特指非小細胞肺癌發生靶向耐藥后轉化為小細胞肺癌的過程,但轉化后的腫瘤細胞仍攜帶EGFR致癌驅動突變,即小細胞肺癌系由EGFR突變進化而來。2006年,一名45歲的女性非小細胞肺癌患者在接受Erlotinib治療后,在2次活檢中首次發現小細胞肺癌的組織類型轉化[66]。在Osimertinib一線及二線治療后出現耐藥情況的患者中,分別有14% 及4～15%發生了由EGFR突變的非小細胞肺癌向小細胞肺癌的組織學轉變[60, 67]。值得注意的是,非小細胞肺癌轉化為小細胞肺癌的風險與視網膜母細胞瘤1(Retinoblastoma1, Rb1)和p53腫瘤蛋白 (Tumor protein 53, TP53)的突變顯著相關,在攜帶野生型RB1和TP53的患者中暫時未發現小細胞肺癌轉化病例[68],因此,RB1和TP53的突變可能是這種細胞類型轉化的生物標志之一。

除上述耐藥機制外,ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC)介導的小分子藥物外排同樣在EGFR-TKI耐藥中發揮重要作用。ABC轉運蛋白是一種以ATP(三磷酸腺苷)為驅動能源的跨膜運輸蛋白質,能夠將小分子藥物從細胞中轉運出來,降低癌細胞中的藥物積累濃度[69]。

5 克服第三代EGFR-TKI獲得性耐藥的治療策略

5.1 開發第四代EGFR-TKI

2016年,報道了第1個靶向EGFR酪氨酸激酶的變構抑制劑EAI045[70],它通過與激酶變構位置結合,以改變其構象的方式抑制酶促反應速率。在小鼠模型中,它與 EGFR 單抗藥物西妥昔聯合使用能顯著抑制攜帶EGFR L858R/T790M/C797S 突變的腫瘤生長,但遺憾的是該化合物單獨使用未能展現應有的療效,進入臨床使用的前景堪憂[58, 70, 71]。2017年,報道的EGFR別構抑制劑布加替尼(Brigatinib)是由一組以 U 型構象圍繞雙苯胺嘧啶支架構建的二甲氧基[72]。Brigatinib和 EGFR 單抗藥物(例如帕尼單抗或西妥昔單抗)聯用,能夠克服 C797S突變導致的第三代EGFR-TKI耐藥,在小鼠模型中顯示出良好的抗腫瘤效果。在2020年,公布了一款名為CH723316的第四代EGFR-TKI抑制劑,體外小鼠實驗結果顯示,CH7233163對EGFR三基因突變和EGFR單、雙活化突變也取得很好的療效。在CH7233163應用到Del19/L858R/T790M、L858R/T790M突變和Del19的小鼠體內,均可明顯觀察到腫瘤體積的縮小,CH7233163彰顯了良好的臨床應用前景[73]。目前,仍然未見第四代EGFR-TKI批準用于臨床,其開發與應用仍然任重而道遠。

5.2 聯合治療策略

5.2.1 與其他靶向的小分子抑制劑聯合使用 目前,因第三代EGFR-TKI耐藥機制多樣,聯合使用不同的小分子抑制劑是克服靶向耐藥的策略之一。針對EGFR C797S突變所造成的三代EGFR-TKI不同的耐藥性問題,可以通過測序確定其與T790M是否為反式結構,如是,則可將第一代和第三代EGFR-TKI聯合使用抑制耐藥腫瘤細胞的生長[22]。針對C-Met高表達引發的對Osimertinib、Rociletinib等EGFR-TKI耐藥的問題,聯合使用C-Met抑制劑能增強腫瘤細胞對Osimertinib的敏感性[74]。Osimertinib和ALX抑制劑cabozantinib聯合使用能夠顯著抑制ALX高表達,并攜帶EGFR T790M突變的耐藥腫瘤細胞在體內外的生長[75]。Osimertinib聯合MEK抑制劑司美替尼(Selumetinib)能夠抑制由KRAS過表達引起的耐藥細胞系的生長和增殖,而Osimertinib聯合另一種MEK抑制劑曲美替尼(Trametinib)可以克服KRAS突變引起的耐藥[46]。此外,三代EGFR-TKI聯合使用氧化磷酸化(OxPhos)抑制劑、HER2抑制劑等在治療特定類型腫瘤耐藥均有很好的療效[76, 77]。

5.2.2 與單克隆抗體聯合使用 目前,臨床上使用的EGFR抗體藥物有西妥昔單抗、panitumumab、耐昔妥珠單抗(necitumumab)以及尼妥珠單抗(nimotuzumab),它們皆通過與EGFR胞外域結合來阻斷EGFR與其配體的識別或受體二聚化。第四代EGFR抑制劑布甲替尼和西妥昔單抗的聯合靶向治療,能夠改善獲得EGFR T790M-cis-C797S突變引起的Osimertinib耐藥,延長患者的生存期,這也證明了EGFR-TKI聯合單克隆抗體治療可能是一種有效克服EGFR-TKI耐藥的治療策略[78]。西妥昔單抗和曲妥珠單抗的三聯體(3×mAb)可抑制攜帶C797S突變的腫瘤,誘導腫瘤細胞衰老,并且在與Osimertinib聯合治療中展現出協同效應,可持續抑制腫瘤[79]。

5.2.3 與化療聯合使用 化療是治療各類癌癥的一種普遍采用且非常重要的手段,也是EGFR-TKI靶向耐藥后經常采用的治療策略。例如,在治療小細胞肺癌轉化引起的EGFR-TKI耐藥中,在患者產生對Osimertinib耐藥后使用鉑類雙聯化療仍取得了一定療效,但最終未能阻止癌癥的轉移[80]。

5.2.4 與免疫檢查點抑制劑聯合使用 以免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)為代表的免疫療法在腫瘤治療中取得重大突破。這些免疫檢查點抑制劑,包括PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA-4抑制劑等,通過調節腫瘤患者自身的免疫反應達到殺傷腫瘤的目的[81]。但多項臨床試驗顯示,針對攜帶EGFR激活突變的肺癌患者既不適合單獨使用免疫檢查點抑制劑,也不適合與EGFR-TKI聯用,兩者均無法取得明顯治療效果[82]。但針對攜帶鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)與TP53共突變的患者,靶向治療與免疫檢查點抑制劑聯用效果較好,可能與攜帶KRAS突變的患者腫瘤突變負荷(tumor mutational burden, TMB)較高有關。但對于攜帶其他主要致癌驅動基因突變(例如EGFR、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase , ALK)等)的患者,其TMB相對較低[82-83]。免疫檢查點抑制劑聯合TKI療效不明確,且存在安全性隱患,尚需進一步探索適用人群與適應癥。

目前,多種藥物聯合應用對第三代EGFR-TKI治療后耐藥問題的解決展現了良好的希望[84]。然而,組合多種EGFR-TKI進行聯合應用治療時,如何管理這些分子之間的直接相互作用以及患者聯合治療引起的毒性是目前的最大問題。

6 問題與展望

EGFR的功能異常在非小細胞肺癌發生、發展中發揮至關重要的作用,EGFR-TKI靶向治療成為當下治療晚期非小細胞肺癌的一線療法之一。相對于化療,EGFR-TKI在治療藥物敏感人群時展現出良好安全性,并能夠顯著延長晚期非小細胞肺癌患者的生存期。但是由于EGFR突變腫瘤中第三代EGFR-TKI耐藥性的機制在患者之間是不同的,并且在不同的腫瘤部位之間存在異質性問題,第三代EGFR-TKI的長期使用仍然受限于耐藥性的產生。相較于前兩代藥物,由于EGFR T790M突變產生的耐藥機制,第三代EGFR-TKI的耐藥機制更加復雜多變,因此,對其血液進行液體活檢或組織樣本進行高通量測序,以闡明耐藥性機制,對指導下一步治療具有重要意義,這將有助于克服耐藥性的新型聯合療法的臨床研究。雖然目前已經發現多種不同的耐藥機制,但是仍有大量病例存在未知的耐藥機制。目前,開發第四代EGFR-TKI及探索不同的聯合治療策略,以期克服第三代EGFR-TKI的耐藥問題,也是基礎研究和臨床醫學所面臨的重大挑戰。闡明新的三代EGFR-TKI耐藥機制,及時監測、發現治療中產生的獲得性耐藥,開發新的聯合治療策略,可能是未來克服EGFR-TKI靶向耐藥,提高患者生存期的有效手段。