NCA處理對鮮切蘋果貯藏品質的影響

楊尚山，楊 悅，尚鵬鵬，朱樹華,*，張麗麗,*

（1.山東農業大學化學與材料科學學院，山東 泰安 271018；2.農業農村部農膜應用重點實驗室，山東 泰安 271018）

蘋果富含多種人體必需礦物質元素，如鉀、鋅、銅和碘[1]。鮮切蘋果具有清潔、天然、營養、方便等優點，已成為常見且受廣大消費者歡迎的即食生鮮食品[2]，具有廣闊的消費前景[3]。然而，貯藏過程中發生的褐變和失水萎蔫等一系列問題限制了鮮切蘋果的應用[4-5]。因此，科研人員一直在尋找安全和有效的方法來提高鮮切蘋果的貯藏品質。

現有的鮮切蘋果保鮮方法多為薄膜保鮮，這是一種具有商業價值的實用保鮮方法[6-8]?？墒承阅づc抗褐變抑制劑聯合處理后，蘋果的呼吸速率和微生物繁殖率顯著降低，護色效果良好[9]。使用蜂膠提取物涂膜后，果蔬的硬度和表觀品質有所提高[10]。Thivya 等[11]開發了一種含有蔥廢料提取物的海藻酸鈉/羧甲基纖維素膜，該膜可有效控制鮮切蘋果和馬鈴薯的褐變。然而，涂膜材料的毒性、不穩定性、可持續性以及保鮮效果是鮮切果蔬涂膜保鮮中面臨的問題。除涂膜保鮮外，物理保鮮和化學保鮮方法也常應用于鮮切水果保鮮，如基于姜黃素的光動力處理鮮切哈密瓜[12]、低分子量巖藻依聚糖處理鮮切蘋果[13]、馬茶提取物處理鮮切蘋果[14]等。

1-亞硝基環己基乙酸酯（NCA）是一種可以提供硝?；℉NO）的?；鶃喯趸衔颷15]。HNO 是一氧化氮（NO）的單電子還原和質子化同源物，已被證明在制藥領域具有獨特的藥理作用，如治療心力衰竭[16]。HNO 能與金屬蛋白、硫醇和含硫醇的蛋白質等多種物質直接反應，從而改變酶的活性，如對蛋白中特定半胱氨酸殘基的修飾能抑制線粒體的呼吸[17]。此外，HNO 是NO 和硫化氫（H2S）相互作用產生的反應中間體，而NO 和H2S 作為信號分子參與植物的多種生理過程，并在果實采后貯藏中發揮重要作用，因此可以推斷HNO 對植物的生理過程有一定調節作用[18]。然而，關于HNO 在植物中生理作用的研究較少。最近的研究發現，在模式植物擬南芥的活細胞中能檢測到內源性HNO的形成，并且HNO對植物的乙烯信號通路具有一定的調節作用，且氧化還原環境的改變可引發HNO 衰變及·NO/HNO 相互轉化[19]。前期研究發現，適當濃度的HNO 供體處理能有效抑制西紅柿多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，減緩西紅柿亮度值和VC含量的下降，抑制果實中丙二醛含量和失重率的上升，從而延緩西紅柿的衰老[20]?；诖?，本研究以NCA 為HNO 供體，探究HNO 對鮮切蘋果貯藏品質的影響，以期為鮮切果蔬的保鮮提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

‘紅富士’蘋果：購自山東省泰安市水果批發市場，選擇無病蟲害、色澤鮮艷、無機械傷痕、大小均勻、成熟度相近的新鮮、良好的蘋果，立即運回實驗室5 ℃保存。

NCA，本實驗室自制；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、濃硫酸（98.3%）、濃氨水（23%）、過氧化氫（分析純）和乙二胺四乙酸（EDTA，分析純），天津市凱通化學試劑公司；鄰苯二酚（99.5%）和2-脫氧核糖（分析純），上海麥克林生化科技公司；甲硫氨酸（≥99.0%），北京全式金生物技術有限公司；氮藍四唑（≥98.0%），蘇州亞科科技股份有限公司；核黃素（98%），上海如吉生物科技發展公司；冰乙酸、聯苯胺、硫代巴比妥酸（TBA）、鄰苯二酚、丙酮，均為分析純，上海源葉生物科技有限公司；次氯酸鈉（NaClO，分析純），成都華融化工有限公司；2,7-二氯熒光素（分析純），廣東元泰化工有限公司；2-脫氧-D-核糖（98%），南京杜萊生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

D3024R 型高速冷凍離心機，武漢華科達實驗設備有限公司；UV-2700型紫外可見分光光度計，日本島津公司；WY015R型手持折光儀，北京中西泰安技術服務有限公司；CR-10型色差計，美國柯尼卡美能達公司；GY-4型果實硬度計，青島拓科儀器有限公司；食品級拉鏈袋（材質為聚乙烯，長度為70 mm，寬度為50 mm，厚度為70μm），桐城市天之錦包裝有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

試驗前，所需儀器均使用0.02% NaClO 溶液浸泡30 min以消毒滅菌，取出儀器，晾干。用去離子水洗凈5 ℃下預冷的蘋果，之后使用0.02%NaClO 浸泡3 min消毒。將蘋果表面的水分晾干，切成2～3 cm見方的蘋果塊，分別在5、10、15μmol/L NCA 溶液中浸泡5 min（以去離子水浸泡5 min 為對照（CK）），取出蘋果塊，用無菌紗布將蘋果塊表面的溶液吸干。將處理后的蘋果塊分組標記，放入食品級拉鏈袋（每袋140 g）中并置于冰箱中5 ℃冷藏。每48 h 取1 次樣品，分組包裝并在-80 ℃下凍藏。每次測試前，將每組凍藏樣品取出，加入液氮研磨，取1 g 粉末加入試管，用于測樣。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 色差

使用色差計測定。測量前，采用標準白度進行校準測量（L*0=97.06，a*0=0.04，b*0=2.01）。隨機選取3個自封袋，每個自封袋中隨機選取3 塊蘋果，分別記錄L*（亮度）、a*（紅綠度）、b*（黃藍度）值。色差用ΔE表示，其計算公式如下：

1.2.2.2 可溶性固形物含量（SSC）

使用手持式折光計測定[21]。

1.2.2.3 硬度

使用硬度計測定，探頭直徑為11 mm，結果取其平均值。硬度單位為N/cm2。

1.2.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性

在3 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g樣品粉末，提取10 min，在12 000×g條件下離心20 min，得到粗酶液。制備含13 mmol/L 蛋氨酸、63μmol/L 氮藍四唑、1.3μmol/L 核黃素和10 mmol/L EDTA的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液作為反應溶液。取反應液1.5 mL，暗處加酶液10μL，5 ℃陽光下照射約15 min。當顏色發生變化后，立即停止光照，測定560 nm 處的吸光度。以不加酶溶液作為空白對照，以單位時間內抑制氮藍四唑光還原率50%為1 個酶活力單位（U）[22]，超氧化物歧化酶活性單位為U/mg。

3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g 樣品粉末，在12 000×g下離心20 min，得到粗酶液。吸取0.1 mL 酶液，加入2 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液和0.2 mL 0.3%H2O2，立即測定溶液在240 nm 處的吸光度值。其中一根裝有2 mL 磷酸鹽緩沖液、0.1 mL 去離子水和0.2 mL H2O2的管作為對照管，測定OD240nm以指示酶活性的變化[23]。以每秒內改變0.1個單位的吸光度定義為1 個酶活性單位（U），過氧化氫酶活性單位為U/mg。

1.2.2.5 多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性

在3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g 樣品粉末，再于12 000×g條件下離心20 min，得到粗酶液。將0.1 mol/L 兒茶酚和50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 6.8）-0.2 mmol/L EDTA 在30 ℃下預熱30 min。在1 mL粗酶溶液中加入1 mL兒茶酚和1.5 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.8）-0.2 mmol/L EDTA，立即測定420 nm 處的吸光度[24]。以每分鐘吸光度變化0.01 為1 個酶活力單位（U），多酚氧化酶活性單位為U/mg。

在3 mL 0.4 mol/L NaCl 中加入1 g 樣品粉末，浸提10 min，12 000×g下離心15 min，得到粗酶液。在3 mL聯苯胺乙酸-乙酸鈉溶液中加入0.1 mL酶溶液，30 ℃水浴5 min。加入0.5 mL 0.3%H2O2，測定580 nm處吸光度的變化。以每秒內吸光度變化0.001 個單位定義為1個酶活性單位（U）[25]。過氧化物酶活性單位為U/mg。

1.2.2.6 活性氧（ROS）和羥基自由基（·OH）含量

在3 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）中加入1 g樣品粉末，12 000×g離心20 min，得到粗酶液。取0.2 mL 粗酶液加入1.8 mL Tris-HCl 緩沖液中，加入10μL 2.0 mmol/L 2,7-二氯熒光素，靜置30 min，以Tris-HCl緩沖液調零，檢測熒光強度。最大激發波長為485 nm，最大發射波長為530 nm，狹縫為5 nm[26]?；钚匝鹾繂挝粸閍.u/mg。

在2 mL 50 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g 樣品粉末，10 000×g離心10 min。取0.5 mL 上清，加入0.5 mL 50 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和1 mL 含2.5 mol/L 2-脫氧-D-核糖的25 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），35 ℃暗處反應1 h。加入1 mL 1%三丁基錫化合物和1 mL 醋酸，黑暗中煮沸30 min 后立即冰水中冷卻10 min，于532 nm 處測定吸光度。羥基自由基含量單位為mmol/g。

1.2.3 數據處理

每組試驗重復3 次，結果以x±s表示。使用Origin 2019軟件進行數據整理和制圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果色差的影響

鮮切水果和蔬菜因其方便、營養、無污染和外觀新鮮而受到消費者的歡迎[27]，但蘋果在鮮切加工后切面容易受損。L*值和色差是鮮切蘋果保鮮過程中重要的理化參數，是反映果肉在貯藏過程中亮度和褐變程度的重要指標。由圖1A 可見，隨貯藏時間的延長，各組鮮切蘋果L*值呈降低后升高再降低的變化趨勢。NCA 處理鮮切蘋果的亮度整體高于對照，貯藏第8 天，對照L*值為53.97，5、10、15μmol/L NCA 處理組分別為56.03、57.50、58.07，分別是對照的1.03、1.06、1.07 倍。由圖1B 可見，鮮切蘋果的色差值隨貯藏時間的延長整體增大，且與對照相比，NCA處理組保持較低的色差值。第8 天時，對照色差值為6.55，而5、10、15 μmol/L NCA 處理的蘋果色差值分別為4.05、2.87、2.90，分 別 為對 照的61.83%、43.82%、44.27%。ΔE值越大，說明蘋果表面顏色越深，新鮮度越低?？梢?，NCA 處理可有效延緩鮮切蘋果色差值的增大，保鮮效果較好。其中，10、15μmol/L NCA處理2 d后，果實ΔE值變化較小，說明NCA處理能延緩鮮切蘋果褐變。綜上所述，NCA 處理能有效延緩鮮切蘋果的褐變，保持較好的外觀品質。

圖1 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果L*值（A）和ΔE值（B）的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NCA treatment on L*(A)and ΔE(B)of fresh-cut apples

2.2 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果可溶性固形物含量的影響

可溶性固形物含量是影響水果口感的重要因素之一。由圖2可見，5μmol/L NCA處理果實的SSC與對照呈相同變化趨勢，但其SSC 始終高于對照，第2天和第4天有一定差異，6 d后相差不明顯。10μmol/L NCA 處理維持果實SSC 效果較好，處理4～10 d，SSC無顯著變化。15μmol/L NCA 處理4 d 內對果實SSC維持效果不明顯，后期呈先增后減再增的波動變化?？傮w來看，NCA 處理對果實中SSC 的維持有積極作用，且NCA 處理濃度對鮮切蘋果可溶性固形物含量有較大影響，其中10μmol/L處理的效果最好。

圖2 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of NCA treatment on soluble solids content in fresh-cut apples

2.3 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果硬度的影響

果實硬度是影響鮮切蘋果脆感的重要因素之一，也是反映其貯藏品質最直觀的指標之一[28]。果實中的組織軟化是由細胞壁成分的酶解、水分流失、滲透變化以及其他與組織相關的復雜機制引發的[29]。由圖3可以看出，鮮切蘋果的硬度隨貯藏時間的延長而降低。對照初始硬度為56.97 N/cm2，第10 天時降至38.95 N/cm2，下降了31.63%。貯藏第10 天，5、10、15 μmol/L NCA 處理組的果實硬度分別為44.53、45.26、46.31 N/cm2，均顯著高于對照（P＜0.05），其中以15μmol/L NCA處理的果實硬度下降最緩慢，保持了較好的效果。說明NCA處理可以減緩鮮切蘋果硬度的降低，抑制果實軟化。

圖3 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果硬度的影響Fig.3 Effects of different concentrations of NCA treatment on hardness of fresh-cut apples

2.4 不同濃度NCA 處理對鮮切蘋果SOD 和CAT 活性的影響

抗氧化酶參與植物清除活性氧的過程，被認為是保護生物體免受有害物質負面影響的有效防御屏障，其中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是兩種主要的酶促抗氧化劑[30]。由圖4A 可見，不同濃度NCA 處理鮮切蘋果的SOD 活性總體呈下降趨勢，對照組SOD 活性隨著貯藏時間的延長持續降低。5μmol/L NCA 處理組SOD 活性在第2 天達到峰值，是對照的1.3倍。10μmol/L和15μmol/L NCA處理組SOD活性在8 d 內保持較高水平，第8 天時果實的SOD 活性分別是對照的1.6 倍和2.0 倍。由圖4B 可以看出，不同濃度NCA 處理后，鮮切蘋果的CAT 活性整體呈下降趨勢，除5μmol/L NCA 處理第4 天外，其余均高于對照。不同濃度NCA處理4 d后，CAT活性整體呈緩慢下降，第10天時，5、10、15μmol/L NCA處理組CAT活性分別為20、29、30 U/mg，分別為對照的1.43、2.07、2.14倍。CAT是一種能從蘋果中去除過氧化氫的酶。當過氧化氫含量減少時，蘋果的老化變質過程就會被延緩。因此，高活性的CAT 有利于鮮切蘋果的貯藏。綜上所述，NCA 處理有利于減緩鮮切蘋果SOD和CAT 活性的下降，且以NCA 濃度為10 μmol/L 和15μmol/L時效果較好。

圖4 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果SOD（A）和CAT（B）活性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NCA treatment on activities of SOD(A)and CAT(B)in fresh-cut apples

2.5 不同濃度NCA 處理對鮮切蘋果PPO 和POD 活性的影響

研究證實，鮮切果蔬食品褐變的主要原因是酶促褐變，而參與酶促褐變的關鍵酶是多酚氧化酶和過氧化物酶[31-32]，鮮切果蔬的褐變敏感性是褐變相關酶和酚類化合物之間發生復雜的相互作用的結果[33-34]。在氧氣存在下，多酚氧化酶會催化單酚羥基化為鄰二酚（甲酚酶活性），鄰二酚氧化為鄰醌（兒茶酚酶活性）[35]，鄰醌既能相互作用形成高分子聚合物，也能與氨基酸或蛋白質作用生成高分子絡合物，從而生成棕色、紅色或黑色物質。一般來說，PPO 活性的增強會導致蘋果軟化，不利于鮮切蘋果的保存和貯藏，甚至會導致鮮切蘋果變質。由圖5A 可見，在5 ℃貯藏條件下，鮮切蘋果的PPO 活性先升高后降低，均在第2天達到峰值。各濃度NCA處理組PPO活性均低于對照，且15μmol/L NCA處理組PPO活性最低，處理效果最佳。

圖5 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果PPO（A）和POD（B）活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NCA treatment on activities of PPO(A)and POD(B)in fresh-cut apples

過氧化物酶（POD）是一種廣泛存在于生物體內的酶類，具有氧化還原作用。許多研究表明POD 與褐變有關[36]。盡管POD 受到超氧自由基、過氧化氫、脂質過氧化等電子受體化合物可用性的限制，但它可以將組織中的一些碳水化合物轉化為木質素，提高木質化程度。因此，POD可以作為組織老化的生理指標。由圖5B可見，在貯藏期間，鮮切蘋果的POD活性先升高后降低。不同濃度NCA處理組POD活性均低于對照，貯藏第4天，對照組POD活性為16.45 U/mg，而5、10、15 μmol/L NCA 處理組分別為15.75、15.20、13.34 U/mg，分別比對照降低4.26%、7.50%和18.91%。10μmol/L NCA 處理組貯藏第4 天POD 活性出現峰值，且較其他處理組的峰值低。15μmol/L NCA 處理組貯藏第2 天出現POD 活性峰值，貯藏2～10 d，POD 活性下降趨勢明顯。一般來說，POD 是一種氧化還原酶，會催化蘋果的氧化，誘發一系列氧化反應，導致蘋果老化。因此，POD活性過高不利于鮮切蘋果的貯藏。比較發現，10 μmol/L 和15 μmol/L NCA處理可顯著降低鮮切蘋果POD活性。

2.6 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果活性氧和羥基自由基含量的影響

蘋果細胞中的活性氧包括超氧陰離子、過氧化物和羥基，其可誘導膜脂氧化和細胞凋亡，是蘋果變質的重要影響因素[37]。如果ROS含量超過閾值，則會直接觸發或加劇膜脂過氧化，破壞細胞微環境和正常代謝。由圖6A可見，貯藏過程中，鮮切蘋果的ROS含量呈上升趨勢，且不同濃度NCA處理組活性氧含量低于對照。貯藏6～10 d，對照鮮切蘋果ROS含量的增加趨勢顯著高于NCA處理組，且15μmol/L NCA處理組增長趨勢最慢，延緩鮮切蘋果ROS含量升高的效果最好。

圖6 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果ROS（A）和·OH（B）含量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NCA treatment on contents of ROS(A)and·OH(B)in fresh-cut apples

脂質過氧化是植物組織膜降解的主要機制，并導致許多副產物，如羥基自由基的形成。羥基自由基是一種活性氧，它可以破壞細胞中的大分子，如脂質、蛋白質或脫氧核糖核酸[38]。羥基自由基具有很強的氧化能力，會加速蘋果的衰老、萎蔫等生理過程。因此，為了延長蘋果的保存時間，應該降低蘋果中羥基自由基的含量[39]。由圖6B可見，隨著貯藏時間的延長，鮮切蘋果的羥基自由基含量整體呈先降低后升高的趨勢。對照組羥基自由基含量在第6天達到最低水平，隨后急劇上升，之后盡管有下降，但仍保持在較高水平。10 μmol/L 和15 μmol/L NCA 處理組變化趨勢相同，0～4 d，羥基自由基含量急劇下降，6～10 d，羥基自由基含量增加。除第6天外，15μmol/L NCA處理組羥基自由基含量明顯低于對照?？梢?，NCA處理可以減緩鮮切蘋果活性氧含量的增加，延緩細胞壁的水解，從而提高鮮切蘋果的硬度，保持較好的品質和外觀。

3 結論

上述試驗結果表明：不同濃度的NCA 處理可有效減緩鮮切蘋果亮度、可溶性固形物含量和硬度的下降，保持色澤的穩定，較好地保持了鮮切蘋果的外觀和風味，抑制了PPO和POD活性的增加，減緩了鮮切蘋果的褐變，提高了SOD 和CAT 活性，降低了活性氧和羥基自由基的含量，減輕了活性氧對鮮切蘋果的傷害。推測可能是由于NCA 產生的HNO 能有效抑制鮮切蘋果褐變，保持良好的貯藏品質，其中15μmol/L NCA處理效果最佳。