小春花木犀草素提取工藝優化及其抗氧化活性研究

何若男，陳 歡，易 超，林啟凰，張豫杰，吳 婷，陳仲巍

（廈門醫學院藥學系，福建 廈門 361023）

小春花為陰地蕨（Sceptridium ternatum(Thunb.)Lyon）植物的帶根全草[1]，廣泛分布于我國大部分省區，其全草均可入藥，為福建民間常用草藥[2]，具有清熱解毒、止咳平喘及化痰之功效。福建省立醫院藥劑科參考民間經驗將小春花結合其他藥物開發為復方藥劑——小伏口服液[3]，臨床主要用于久咳、病后聲啞、支氣管哮喘等疾病的治療[4-5]。前期研究發現，小春花中含有大量黃酮類化合物，主要為木犀草素、槲皮素、山奈酚、陰地蕨素[6]，其毒性較低，小鼠的最大耐受灌胃給藥量為80 g/kg，臨床用藥較安全[7]，但目前對其臨床及藥理相關報道仍較少，未被收錄進2015 版《中華人民共和國藥典》，僅被收錄入同年的《浙江省中藥炮制規范》，也僅有小伏口服液這款單一藥品問世，其潛在價值亟待開發。

木犀草素是小春花的主要成分之一，木犀草素含量高的植物在伊朗、中國和巴西常被用于傳統藥物中治療炎癥相關疾病，因此受到諸多關注。已有研究發現，木犀草素有助于減輕皮膚炎癥[8]和肝臟纖維化[9]，對腫瘤（MA腫瘤細胞）[10]、病毒[11]、腸道沙門氏菌均有抑制作用[12]。近年來還發現其對各種大腦慢性?。òò柎暮Ｄ。┚哂兄委熥饔肹13]，使用前景已由抗菌藥物拓展到神經保護保健品、食品保護劑等多個方向。小春花是目前已知含木犀草素較高且來源豐富的植物資源[14-15]，是制備木犀草素的理想原料[16-19]。

此外，市面上一些合成類抗氧化劑的潛在毒性正逐步凸顯，如二丁基羥基甲苯（BHT）和丁基羥基茴香醚（BHA）。有研究表明，定量攝取BHT 可促進化學物質誘發的小鼠肺癌的發生，合成類化學物質的毒副作用限制了其抗氧化能力的應用范圍，因而篩選安全、天然的抗氧化活性成分備受關注。

當前，一些植物源抗氧化劑已有良好的市場應用前景，如提取自迷迭香和茶葉的抗氧化劑均已通過國家衛生健康委員會的安全檢驗，成為食品安全級抗氧化劑。其中，迷迭香提取劑的抗氧化效果可達合成氧化劑的3～6倍，且耐熱性良好，在持續190 ℃高溫油炸下仍具有抗氧化效果。此外，它還適用于各種復雜的類脂物抗氧化，應用廣泛[20]。市場信心方面，消費者普遍認為天然抗氧化劑更為安全，也成為其一大優勢[21]。小春花富含包括木犀草素的多種具有抗氧化性的黃酮類物質，因此，對其抗氧化性進行評價，將為小春花的開發及應用奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

小春花，采摘自福建省廈門市同安區五顯鎮；木犀草素標準品（純度99.063%），成都瑞芬思生物科技有限公司；VC、蘆丁、總還原力（T-AOC）試劑盒，北京索萊寶公司；乙醇、甲醇、乙酸等試劑均為分析純，西隴化工股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

3K15型離心機，美國Sigma公司；DHG-9140鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；SpectraMax i3X酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；N-1300VWB 旋轉蒸發儀，日本東京理化器械株式會社。

1.2 方法

1.2.1 小春花中木犀草素的提取

用蒸餾水將采摘的新鮮小春花洗凈，太陽光下自然風干，后置于50 ℃鼓風干燥箱干燥，粉碎后過100 目篩備用。取小春花干粉1 g，按照不同的料液比加入不同濃度的乙醇溶劑，混合均勻后分別設定不同的超聲功率、時間和溫度進行超聲提取，再離心（10 000 r/min，4 ℃）10 min，吸出上清液備用。沉淀殘渣重復上述步驟再提取2 次。合并上清液，進行單因素試驗和正交試驗。以上試驗均重復3 次。

1.2.2 單因素試驗設計

固定液料比20∶1（mL/g），乙醇體積分數70%，超聲功率350 W，超聲溫度70 ℃，超聲時間30 min，分別考察不同超聲溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g））及乙醇體積分數（10%、30%、50%、70%、90%）對木犀草素提取量的影響。

1.2.3 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，以超聲溫度、超聲時間、液料比及乙醇體積分數為主要影響因素，以木犀草素提取量為考察指標，進行L9(34)正交試驗，試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.4 木犀草素標準曲線的繪制

參考王春紅等[22]的方法，精確稱取20.000 mg 的70 ℃下烘干至恒重的木犀草素標準品，以適量的50%甲醇溶液（輔以水浴加熱）溶解后，再以無水甲醇定容搖勻，精確制取以0.002 mg/mL 為濃度梯度的0～0.012 mg/mL 的木犀草素標準品溶液，測定其在408 nm處的吸光度值（OD408nm），繪制標準曲線。

1.2.5 木犀草素提取量的測定

將0.5 mL 提取液與1 mL 提前配制的0.1 mol/L AlCl3溶液快速混勻，隨即與1.6 mL 濃度為1 mol/L 的乙酸鉀溶液混勻，于室溫靜置15 min 后測定其OD408nm[23-24]，帶入下式計算樣品（小春花干粉）提取液中木犀草素提取量。計算公式如下：

式中：C為測得的吸光度代入回歸方程式計算得到的木犀草素的質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；K為稀釋倍數；m為小春花干粉質量，g。

1.2.6 小春花體外抗氧化能力的測定

精確稱取小春花提取物經旋蒸所得干樣品，用無水乙醇溶解配制成不同濃度樣品液，以文獻[25-26]中的方法進行1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS+）自由基、羥基自由基（·OH）清除能力及總還原力測定，每個樣品重復測定3 次，并以天然抗氧化物VC和天然黃酮苷蘆丁作為對照。

1.2.6.1 DPPH·清除能力測定

分別將質量濃度為20、40、60、80、100 mg/L的VC溶液、小春花樣液、蘆丁樣液100μL置于不同試管中，取等量當天新鮮配制的DPPH溶液（0.2 mol/L）于避光處混合均勻，避光常溫（25 ℃）反應40 min 后立即測定其在517 nm 處的吸光度值A1，將其中去離子水替換為小春花樣液測得A2，將DPPH溶液替換為無水乙醇測得A0，重復3次。DPPH·清除率計算公式為：

1.2.6.2 ·OH清除能力測定

于96孔板中依次加入精確配制的質量濃度為20、40、60、80、100 mg/L的小春花樣液25μL，之后分別添加1.76 mmol/L水楊酸-乙醇溶液（以50%乙醇作溶劑）25 μL 和1.76 mmol/L FeSO4（當天新鮮配制）25μL，混勻，隨后添加1.76 mmol/L H2O2試液25μL以啟動反應，37 ℃避光水浴30 min后，測定其在510 nm處的吸光度值A′1。以25μL小春花樣液與75μL無水乙醇混合測定其在510 nm 處的吸光度值A′0，以去離子水替代小春花樣液作空白對照A′2，重復3 次，并測定同濃度下VC、蘆丁對·OH 的清除率?！H 清除率計算公式為：

1.2.6.3 ABTS+自由基清除能力測定

將97.5 mg ABTS粉末與16.5 mg K2S2O8溶解于超純水并定容至25 mL，待4 ℃避光16 h 溶液變穩定后得到ABTS 儲備液。將儲備液與無水乙醇以體積比1∶75 比例混合，使OD734nm為0.700±0.015，得ABTS 工作液。將10μL梯度濃度（20、40、60、80、100 mg/L）樣品液與500 μL 新鮮配制的ABTS 工作液避光混勻，6 min 后測定其在734 nm 處的吸光度值A″1，以無水乙醇代替小春花樣液得A″0，以無水乙醇代替ABTS工作液得A″2，重復3 次，并測定同濃度下VC、蘆丁的清除率。ABTS+自由基清除率計算公式為：

1.2.6.4 總還原力測定

參考試劑盒的方法測定小春花提取物總還原力。于96 孔板中依次加入新鮮配制的FRAP 工作液（配制參照T-AOC試劑盒）180μL，梯度濃度（20、40、60、80、100 mg/L）小春花樣品液6μL，蒸餾水18μL，室溫混合10 min后，吸取200μL測定其在593 nm處的吸光度值A3，用蒸餾水替代樣品得A3′，重復3次，并測定同濃度下VC、蘆丁的總還原力，總還原力單位為mmol/L。

1.2.7 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行方差和組間差異顯著性SSR 檢驗分析，P＜0.05 表示具有顯著差異，P＜0.01表示具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 木犀草素標準曲線繪制

以“1.2.4”中的方法擬合回歸方程為：y=125.86x-0.014 3（R2=0.999 8），由圖1可見，木犀草素標準品在質量濃度0～0.012 mg/mL范圍內線性關系良好。

圖1 木犀草素標準曲線Fig.1 Standard curve of luteolin

2.2 單因素試驗結果

由圖2和圖3可知，隨著超聲溫度與時間的增加，小春花木犀草素提取量均表現為先升高后降低的趨勢，最佳超聲溫度和提取時間分別為80 ℃和20 min。早期溫度升高和提取時間延長均會促進細胞內物質的溶出，隨后的降低可能是因為溫度過高會促進其余細胞內容物更多的溶出，溶液黏度增加，對木犀草素的進一步溶出形成阻礙[25]；亦或當超聲時間過長時，超聲波的剪切力破環了木犀草素的化學鍵，導致木犀草素提取量下降。由圖4和圖5可知，最佳液料比和乙醇體積分數分別為20∶1（mL/g）和50%。前期木犀草素提取量增加是因為溶質分子越多越有利于其余溶質分子的溶出，后續降低則是因為雜質過多對木犀草素提取產生不良影響[27]。

圖2 超聲溫度對木犀草素提取量的影響Fig.2 Influence of ultrasonic temperatures on the extraction amounts of luteolin

圖3 超聲時間對木犀草素提取量的影響Fig.3 Influence of ultrasonic time on the extraction amounts of luteolin

圖4 液料比對木犀草素提取量的影響Fig.4 Effects of liquid-solid ratios on the extraction amounts of luteolin

圖5 乙醇體積分數對木犀草素提取量的影響Fig.5 Effects of ethanol concentrations on the extraction amounts of luteolin

2.3 正交試驗結果

如表2 所示，4 個因素對木犀草素提取量影響的主次順序為：C＞A＞D＞B，即液料比＞超聲溫度＞乙醇體積分數＞超聲時間；最佳提取工藝條件為：A3B3C3D3，即超聲溫度85 ℃，超聲時間25 min，液料比25∶1（mL/g），乙醇體積分數60%。方差及顯著性分析結果如表3 所示，4 個因素對提取量均具有極顯著性影響（P＜0.01）。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal results

2.4 組間差異顯著性SSR檢驗

采用SPSS 20.0軟件對正交試驗結果進行組間差異顯著性SSR 檢驗分析[28]。結果如表4 所示，因素A的水平1與水平2、水平3之間均具有顯著性差異（P＜0.05），水平2 和水平3 之間無顯著性差異；因素B的各水平間均無顯著性差異；因素C的水平1與水平2、水平3之間均具有極顯著性差異（P＜0.01），水平2和水平3之間無顯著性差異；因素D的水平1和水平3，水平2 和水平3 之間有顯著性差異（P＜0.05），水平1和水平2 之間無顯著性差異。根據此結果修正最佳工藝條件為：A2B1C2D3，即超聲溫度80 ℃、超聲時間15 min、液料比20∶1（mL/g）、乙醇體積分數60%。

表4 組間差異顯著性SSR檢驗Table 4 SSR test for significance of differences between groups

2.5 驗證試驗結果分析

對試驗所得最佳提取工藝進行驗證，試驗重復3 次，結果表明，正交試驗優化的最佳工藝條件下得到的木犀草素提取量（4.88 mg/g）高于組間差異顯著性SSR檢驗結果（4.63 mg/g），且高于正交試驗各試驗號的提取結果。

2.6 小春花提取物體外抗氧化活性

2.6.1 DPPH·清除能力

如圖6 所示，VC、蘆丁與小春花樣品均具備DPPH·清除能力，且清除力強弱與質量濃度存在量效關系。當小春花提取物質量濃度達到20 mg/L時，其清除率已超出50%，與VC相當；當質量濃度為80 mg/L及100 mg/L 時，清除率分別為90.1%和92.8%，與VC接近（97.6%）。但質量濃度為40 mg/L 時，其清除率顯著低于VC（P＜0.05）。小春花提取物清除DPPH·的IC50為14.9 mg/L，總體而言其DPPH·清除能力高于蘆?。↖C50=16.4 mg/L），且其在一定質量濃度范圍內與VC（IC50=14.8 mg/L）接近，清除能力較強。

圖6 VC、蘆丁及小春花提取物對DPPH·的清除能力Fig.6 Scavenging abilities of VC,rutin and Botrychium ternatum extract against DPPH·

2.6.2 羥基自由基清除能力

還原劑與試液發生Fenton 反應，產生·OH，其與水楊酸反應顯紅色，色澤輕重與·OH 質量濃度呈正相關。如圖7所示，樣品質量濃度在20～100 mg/L時，其對·OH 清除能力隨樣品質量濃度的提高而增強。當小春花提取物質量濃度為20、40、100 mg/L時，·OH清除率分別達31.2%、36.6%和70.5%，與VC（34.5%、38.8%、74.5%）接近，小春花提取物清除·OH的IC50為78.6 mg/L，蘆 丁 與VC 的IC50分別為105.3 mg/L 和61.2 mg/L。

圖7 VC、蘆丁及小春花提取物對·OH的清除能力Fig.7 Scavenging abilities of VC,rutin and Botrychium ternatum extract against·OH

2.6.3 ABTS+自由基清除能力

常態下，ABTS+的離子基團經氧化后形成更為穩定的水溶性離子基團，溶液由淺色變為藍綠色。而還原劑的加入可減弱氧化進程，使溶液顏色變淺，特征峰值降低，因此，反應液褪色越明顯（特征峰值越低）則表明該檢測物（小春花）的抗氧化能力越強[29]。如圖8 所示，樣品質量濃度在20～100 mg/L 時，ABTS+自由基的清除能力與蘆丁、小春花樣品提取物、VC質量濃度呈顯著正相關，相對呈線性關系，且蘆丁對ABTS+自由基的清除率遠低于小春花提取液和VC。當小春花提取物質量濃度達到60 mg/L 時，清除率可達42.5%，與VC（43.4%）接近，遠高于蘆?。?3.6%），小春花提取物清除ABTS+自由基的IC50為80.2 mg/L，蘆丁與VC的IC50分別為248.3 mg/L和76.6 mg/L。

圖8 VC、蘆丁及小春花提取物對ABTS+自由基的清除能力Fig.8 Scavenging abilities of VC,rutin and Botrychium ternatum extract against ABTS+free radical

2.6.4 總還原力測定

該測定中包括了各種還原性大分子、還原性小分子及酶的總體還原力水平，在酸性條件下，測樣中的還原性物質將三價鐵離子Fe3+-TPTZ（赤血鹽K3Fe（CN）6）還原生成普魯士藍色的二價鐵離子Fe2+-TPTZ（黃血鹽K4Fe（CN）6），進而使試樣溶液變色，測定其OD700nm可通過檢測普魯士藍的深淺來評價待測樣的還原力[30]。如圖9 所示，3 個測試品的還原力均與質量濃度呈明顯量效關系。同質量濃度下，小春花提取物的還原力顯著強于蘆?。≒＜0.05），但顯著弱于VC（P＜0.05），表明其具有一定的還原力。

圖9 VC、蘆丁及小春花提取物的總還原力Fig.9 Total reducing power of VC,rutin and Botrychium ternatum extract

3 討論與結論

小春花自古便為福建草藥[31]，福建省立醫院采用小春花為主要成分制作了小伏口服液應用于臨床。最近有研究表明，給予肺動脈高壓SD大鼠（野百合堿所致）模型以小春花總黃酮給藥干預后，各組肺心病的癥狀均出現緩解[32]。但小春花作為地方性傳統中藥，并未載入新版《中華人民共和國藥典》，其藥材質量標準仍需制定，具體活性成分仍需進一步解析。本文對小春花中主要成分木犀草素提取進行了研究，獲得自小春花中提取天然木犀草素的最佳條件為：超聲時間25 min，液料比25∶1（mL/g），乙醇體積分數60%，超聲溫度85 ℃。該條件下的木犀草素提取量達4.88 mg/g，抗氧化試驗結果表明，小春花提取物具有較強的抗氧化性，可為后續相關研究提供參考。

近年來，木犀草素在食物保鮮和功能性食品領域有了新應用。在酚醛離子液體中添加木犀草素用以保鮮紅蘋果片，可保留其感官特性和風味[33]；將從椰子殼中提取所得的木犀草素添加至木瓜切片中，發現其對食源性致病菌——腸道鏈球菌、單核細胞增生乳桿菌和大腸桿菌均表現出顯著的抑制能力[34]。木犀草素通過多光譜進行分子結合形成的復合物可抑制過氧化物酶活性，防止食物褐變與變質[35]。木犀草素也可膠囊化，用于開發功能性食品，以其為主要成分的“Algonot Neuroprotek”品牌產品具有減輕腸道與大腦屏障受損及抑制氧化應激和炎癥等功效，暫無副作用報道[36]。此外，木犀草素還可調節細胞間通訊信號，破壞腫瘤細胞，抑制腫瘤附著的血管生長，還能減輕癌癥患者化療的副作用[37-38]。木犀草素對其靶細胞具有特異性、選擇性。有研究表明，木犀草素對突變細胞具有細胞毒性，但不影響其他健康的身體組織，具有較高研究價值。當前小春花相關開發應用仍較少，其對肺部作用的藥理機制和其中有價值的化合物有待進一步挖掘研究。