黃河口灘涂翼內繭型藻的分離鑒定及鹽度適應性分析*

肖同陽, 陳小凡, 劉 興, 楊春富, 朱葆華, 潘克厚, 李 赟

(海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003)

灘涂是海潮高潮位與低潮位之間的地帶,由于潮汐的作用,灘涂具有海洋和陸地兩個生態系統的特征[1]。咸淡水交匯的灘涂是海岸濕地生態食物鏈的起點,各種貝類、鳥類、魚類、軟體動物、節肢動物等棲息于此[2-3]。微型底棲生物是潮間帶灘涂主要初級生產者,由底棲微藻、光合細菌和藍細菌組成,通常以聚集在沉積物上層1 cm的底棲硅藻為主,生物量可達1 g·cm-2·d-1[4]。灘涂生境的物理及化學因子變化相當頻繁,受降水、潮汐流、蒸發量增加或更多的淡水徑流的影響,河口和近岸灘涂鹽度會出現劇烈的變化,了解分布于灘涂的底棲生物對鹽度變化的適應特點及適應機制是認識灘涂生物生態功能的重要基礎。

翼內繭型藻屬于硅藻門(Bacillariophyta)硅藻綱(Bacillariophyceae)雙菱藻目(Surirellales)內繭藻科(Entomoneidaceae)翼內繭藻屬(Entomoneis)的單細胞海洋硅藻。由于該藻種多不飽和脂肪酸特別是花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)含量豐富,目前常作為ARA生產的候選藻株[5]。有關翼內繭型藻的研究主要集中在營養[6-8]、光照[6,8]和溫度[8]對其生長速率和代謝產物積累的影響,但關于翼內繭型藻對鹽度的適應性研究仍相當有限。

黃河三角洲河口灘涂濕地(37°40′N—38°10′N,118°41′E—119°16′E)位于山東省東營市墾利區黃河入?？?地處渤海與萊州灣的交匯處,是典型的暖溫帶濱海濕地生態系統,景觀類型多樣且生物資源豐富[9-10]。本研究從黃河口灘涂泥樣中分離出11株翼內繭型藻,在比較極端鹽度對11株分離藻生長基礎上,分析了不同鹽度對其中3株藻株生長、光合活性及生理生化的影響,其目的是為了了解分離自灘涂的翼內繭型藻對鹽度的適應性特點以及鹽度對分離藻株生長、光合作用及主要生化組成的影響,為進一步探討灘涂底棲微藻的耐鹽機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 微藻分離鑒定

1.1.1 微藻的分離純化 將從黃河口灘涂采取的泥樣平鋪于直徑90 mm的培養皿中,厚度約0.5 cm,上面覆蓋一層擦鏡紙,擦鏡紙上放置蓋玻片,封口保濕,并將培養皿置于25 ℃恒溫培養箱內,光暗循環為12 h∶12 h,光照強度為60 μmol·m-2·s-1,誘使底棲藻類因趨光而遷移至蓋玻片。夾取放置48 h的蓋玻片,解剖鏡下初步觀察蓋玻片遷移底棲生物數量后,并立即移至盛有30 mL f/2液體培養基的三角瓶中,連續培養2周,培養基逐漸變成黃褐色。吸取80 μL培養液均勻涂布于f/2固體瓊脂培養基上,10 d后平板上開始出現藻落,進一步培養3周后挑出單藻落,在盛有1 mL f/2液體培養基的48孔板中繼續培養。待孔板中的藻液有明顯顏色時,吸取藻液,顯微鏡下觀察藻細胞形態特征及分離藻株純度。純化藻株接種在盛有60 mL f/2液體培養基的三角瓶中,進行擴大培養。培養條件為溫度(23±1) ℃,光照強度60 μmol·m-2·s-1,光暗比12 h∶12 h。

光學顯微鏡下基于細胞形態進行分離藻的初步鑒定。經初步鑒定為與翼內繭型藻形態相似的藻株編號分別為HaB、HaD1、HaE、HaF、HaL、HaI、HsA、HsD1、HsD2、HsA2、HsD3共11株。

1.1.2 分離藻株的分子鑒定 分離藻株的分子鑒定基于18S rDNA和rbcL基因序列特征進行。藻株DNA使用E.Z.N.A.RHP Plant DNA Kit試劑盒提取。提取的DNA-20 ℃保存,用于PCR擴增。

本實驗用于擴增微藻18S rDNA基因序列的通用引物為V8F(5’ATAACAGGTCTGTGATGCCCT3’)[11]和1510R(5’CCTTCYGCAGGTTCACCTAC3’)[12];用于擴增微藻rbcL基因序列的引物為rbcLF(5’ATGTCTCAATCTGTAWCAGAACGGACTC3’)和rbcLR(5’TAARAAWCKYTCTCTCCAACGCA3’)[13]。50 μL的PCR擴增反應體系中模板DNA 2 μL,一對引物各1 μL,2×TransStartRFastPfu PCR SuperMix 25 μL,ddH2O 21 μL。PCR反應在梯度PCR儀上完成,反應條件為94 ℃預變性5 min后,94 ℃變性40 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min共35個循環,隨后72 ℃延伸10 min。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,膠回收純化后送至上海生物工程技術服務有限公司進行測序。

將測序獲得的分離藻株18S rDNA和rbcL基因序列分別在NCBI(美國國家生物技術信息中心,National Center for Biotechnology Information)上進行BLAST同源性比對,下載相似性大于95%的序列信息用于構建系統發育樹。本研究利用MEGA11.0軟件中的Neighbor-Joining方法構建系統發育樹,通過自舉(Bootstrap)數據集1 000次作為置信度檢測。

1.2 鹽度適應性分析

為了解分離藻株的鹽度適應性,本試驗首先比較了在鹽度為5和80條件下11株分離藻株的生長情況,接種藻密度為1.5×105cell·mL-1。

隨后對其中3株藻株進行了鹽度梯度試驗,梯度試驗中鹽度別為5、25、45、65和85。以天然海水(鹽度30)為基礎,用NaCl和無菌去離子水調節鹽度?？紤]到分離藻生長較慢,接種藻密度調整為3.0×105cell·mL。在9 d的鹽度梯度實驗期間,比較不同鹽度條件下3株藻株的生長、光合能力及主要生化組分的變化。其中,生長比較采用每天測定藻細胞密度,計算并比較微藻的比生長速率。光合能力比較采用每天分析培養微藻的葉綠素熒光參數Fv/Fm和ETRm來評估。生化組分的分析則在培養實驗結束時收集藻液,5 000g離心10 min,蒸餾水沖洗藻泥,重復離心3次,放入真空冷凍干燥機(Christ,德國)凍干成藻粉,分析藻粉中總脂和多糖含量。光合色素在培養至第9天時取藻液10 mL采用熱乙醇法提取。具體分析方法如下:

1.2.1 微藻生長速率計算 每天定時取樣,基于血球計數板法測定藻細胞生長密度?；诩毎芏鹊淖兓?計算比生長速率,比生長速率根據公式μ=(lnNt-lnN0)/t計算[14],式中,t為培養天數,Nt為第t天細胞密度值,N0為初始細胞密度值。

1.2.2 光合潛力分析 每天定時取2 mL藻液進行葉綠素熒光參數測量,測量前將微藻樣品暗適應20 min,使用脈沖振幅調制熒光劑(Water-PAM fluorometer,Walz,Effeltrich, Germany)測定不同鹽濃度下藻細胞葉綠素熒光參數Fv/Fm(PSII的最大光化學效率)和ETRm(電子傳遞速率最大值)的變化。

光列表參數設定為5、8、13、19、28、43、63、97、144、205、284、464、679 μmol/(m2·s),共12個梯度。Fv/Fm值可直接在儀器上讀出,ETRm值則基于擬合方程ETRm=Ps×[α/(α+β)]×[β/(α+β)]β/α計算[15],式中:α為初始斜率;β為光抑制系數;Ps為最大潛在電子傳遞速率。

1.2.3 總脂含量分析 采用重量法測定總脂含量[16]。稱取15 mg經真空冷凍干燥后的藻粉(m0),加入2 mL氯仿和1 mL甲醇,渦旋震蕩15 min,搖床震蕩12 h,8 000g離心10 min,收集上層提取液。下層沉淀重復以上操作。合并2次提取液,加入0.9%NaCl溶液,體積比為5∶1。將混合液漩渦5 min后靜置15 min,分層后收集下層氯仿層,使用10 mL一次性注射器和0.22 μm有機濾器將氯仿層抽濾到新的離心管中(m1),55 ℃水浴蒸去溶劑氯仿,60 ℃烘干至恒重。稱量所得油脂(m2),通過下列公式計算總脂含量:總脂=(m2-m1)/m0×100%。

1.2.4 光合色素含量分析 采用熱乙醇法[17]測定色素含量。用GF/C玻璃纖維素膜(直徑47 nm,孔徑0.45 μm)收集10 mL藻液,棄濾液,將濾膜外包一層錫箔紙置冰箱-20 ℃條件下暗處理12 h,加入體積分數為95%、80 ℃預熱的乙醇5 mL,置于80 ℃水浴鍋中2 min,避光靜置6 h進行萃取,以3 300g離心10 min,用分光光度計(UV-8000,Metash,上海,中國)測定上清液在480、510、630、664、710 nm處的光密度值(OD值),通過下列公式計算葉綠素[18]和類胡蘿卜素[19]含量。葉綠素a=13.7×OD664-5.76×OD630;類胡蘿卜素=(1 000×OD480-2.05×Chla)/245。

1.2.5 多糖含量分析 采用苯酚-硫酸法[20]測定可溶性多糖含量。準確稱取5 mg經真空冷凍干燥后的藻粉,加入5 mL 0.05 mol/L硫酸,65 ℃抽提1 h,8 228g離心10 min,收集上清液,下層沉淀重復以上操作。隨后,將1 mL多糖抽提液中加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸并渦旋30 s混勻,室溫放置30 min,以1 mL 6%苯酚溶液與5 mL濃硫酸做參比,使用分光光度計(UV-8000,Metash,上海,中國)在 490 nm 處測量吸光值,通過葡萄糖標準曲線計算總多糖濃度。

1.3 數據處理

利用Origin 2018進行數據作圖,Excel 2010和 SPSS 25.0軟件對數據進行處理,采用Duncan’s法進行多重比較分析,P<0.05表示不同處理間具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 微藻分離與鑒定

光鏡下分離的11株藻細胞均呈黃褐色(見圖1),單個細胞形狀相似,分別呈橢圓形或葫蘆型。每個藻細胞含2個褐棕色色素體,細胞長在21～30 μm之間,中央收縮部位寬在5～10 μm之間,最寬部位寬在7～15 μm之間?；谛螒B特征,初步鑒定分離藻株可能屬于翼內繭型藻屬。

(A:HaB; B:HaF; C:HaI; D:HaD1;E:HaE; F:HaL; G:HsD2; H:HsD1; I:HsA2; J:HsD3; K:HsA。)

使用通用引物擴增11株分離藻細胞的18S rDNA和rbcL的部分序列,結果獲得的18S rDNA和rbcL序列長度分別在700和610 bp左右。BLAST同源性搜索結果顯示,有23株硅藻的18S rDNA基因序列和rbcL基因序列與11株分離藻的擴增序列的相似度達到95%以上?；讷@得的23株硅藻的18S rDNA和rbcL序列與11個藻株的相應擴增序列,以小麥(Triticummonococcum)相應序列為外類群,構建系統進化樹。

基于18S rDNA構建的NJ樹如圖2所示,本研究中11株分離藻與翼內繭型藻(Entomoneissp.)聚為一支?；趓bcL構建的NJ樹如圖3所示,分離藻株HaF、HaL、HaI、HsD1、HaE、HsD2、HsD3、HaB、HsA和HsA2仍然與Entomoneissp.完全聚為一支,獲得了100%的支持率。而分離藻株HaD1與Entomoneisinfula的2個藻株聚為一支,獲得了99%的支持率。結果表明,分離藻株HaD1屬于Entomoneisinfula,而其余10株分離藻株屬于翼內繭型藻屬(Entomoneissp.)。

圖2 基于18S rDNA序列構建11株分離藻株與相似種的系統發育樹

圖3 基于rbcL序列構建11株分離藻株與相似種的系統發育樹

2.2 分離藻株的鹽度適應性分析

2.2.1 分離藻株在極端鹽度下的生長狀況 11株分離藻株在極端鹽度下的生長情況見表1。表1顯示,11株翼內繭型藻在2個極端鹽度條件下均能生長,如11株藻株,在鹽度為5的低鹽條件下,最大的藻細胞密度在1.66×105～13.00×105cell/mL之間,而在鹽度為80的高鹽條件下最大的藻細胞密度在2.80×105～8.00×105cell/mL之間。但同時也看到同一藻株對2個極端鹽度的耐受性存在顯著差別。如在低鹽條件下,HaI、HaB和HaF藻株的比生長速率分別為0.432、0.428和0.305 d-1,但在高鹽條件下,3個分離藻株的比生長速率則分別為0.151、0.335和0.309 d-1。在2個鹽度條件下,HaF藻株的比生長速率基本一致,而HaI藻株的比生長速率則相差1.86倍。

表1 11株翼內繭型藻在低鹽5和高鹽80下比生長速率及最大藻細胞密度

進一步比較不同藻株對同一鹽度的耐受性,結果顯示不同藻株對同一鹽度的耐受性存在顯著差異(p<0.05)。在鹽度5條件下,HaI藻株的比生長速率最大,為0.432 d-1,HaB藻株的比生長速率其次,為0.428 d-1,而HaL藻株的比生長速率最低,為0.021 d-1,HaI、HaB藻株與HaL藻株相比,比生長速率均相差20倍以上。而在鹽度80條件下,HaB藻株的比生長速率最大,為0.335 d-1,HaF藻株的比生長速率其次,為0.309 d-1,HsA2藻株的比生長速率最低,為0.124 d-1,HaB、HaF藻株與HsA2藻株相比,比生長速率分別相差1.70和1.50倍?；?1株分離藻株在2個極端鹽度的比生長速率,并考慮到藻株培養在f/2培養基上細胞密度的增長情況,篩選出低鹽5培養條件下比生長速率最高的藻株HaI、高鹽80培養條件下比生長速率次高的藻株HaF和兩個極端培養條件下比生長速率均高的藻株HaB,這些藻株用于進一步比較鹽度對翼內繭型藻光合能力及生化成分積累能力的影響。

2.2.2 3株篩選藻株生長的最適鹽度比較 圖4為篩選藻株HaF、HaI和HaB在不同鹽度條件下的比生長速率。圖4顯示,當初始接種密度從1.5×105cell/mL增加至3.0×105cell/mL時,3株分離藻在鹽度5時,比生長速率均分別從0.305、0.432和0.428 d-1降至0.121、0.183和0.165 d-1。當鹽度增至25時,3個分離藻株的比生長速率均急劇升高,其中HaF藻株和HaI藻株比生長速率達到最大值,分別為0.411和0.233 d-1。隨著鹽度增加,HaF藻株和HaI藻株比生長速率均逐漸降低,當鹽度為85時,其比生長速率分別只有0.159和0.092 d-1。而HaB藻株的比生長速率則在鹽度為45時達到最大值,為0.322 d-1。說明高鹽和低鹽環境對3個分離藻株的生長均造成了顯著的抑制效應,3株藻生長的最適鹽度分別是25、25和45。

圖4 鹽度對HaF、HaI和HaB比生長速率的影響

進一步比較3個藻株在5個鹽度條件下比生長速率的變化,結果顯示,HaF藻株的比生長速率在0.121～0.411 d-1之間,HaI藻株比生長速率在0.092～0.233 d-1之間,HaB藻株的比生長速率在0.166～0.322 d-1之間。相對而言,在5個試驗鹽度下,HaB藻株比生長速率均比較高,說明該藻株對鹽度的適應能力更強。

2.2.3 鹽度對3株翼內繭型藻光合活性的影響 圖5a—5f顯示鹽度對3株翼內繭型藻光合潛力的影響。單因子方差分析結果表明,整個培養周期中,不同鹽度組對葉綠素熒光參數Fv/Fm和ETRm均有顯著影響(p<0.05)。

圖5 不同鹽度對HaF藻株(a和b)HaI藻株(c和d)和HaB藻株(e和f)的Fv/Fm和ETRm值的影響

不同鹽度下HaF藻株葉綠素熒光參數的變化如圖5a和5b所示。從圖5a中可以看到,培養的第2天,鹽度5、45、65和85實驗組Fv/Fm均達到最大值,分別為0.621、0.664、0.656和0.631,培養的第3天,鹽度25實驗組Fv/Fm達到最大值,為0.649。隨后5個實驗組均呈逐漸下降的趨勢,培養末期Fv/Fm值與各實驗組的峰值相比,分別下降了41.46%、12.47%、25.51%、20.14%和24.95%。從圖5b中可以看到,培養的第2天,鹽度5、65實驗組的ETRm值均達到最大值,培養的第3天,鹽度25、45、85實驗組的ETRm值均達到最大值,隨后5個實驗組均呈逐漸下降的趨勢。至培養末期,鹽度5實驗組的Fv/Fm和ETRm值均顯著低于鹽度25、鹽度45、鹽度65和鹽度85組。

不同鹽度下HaI藻株葉綠素熒光參數的變化如圖5c和5d所示。從圖5c中可以看到,5個實驗組中,Fv/Fm最大值分別為0.678、0.667、0.663、0.628、0.598,低鹽實驗組Fv/Fm值大于高鹽實驗組。從圖5d中可以看到在鹽度5～85培養條件下,HaI藻株的ETRm數值也隨著鹽度升高而呈降低的趨勢。至培養末期,鹽度85實驗組的Fv/Fm和ETRm值均顯著低于鹽度5、鹽度25、鹽度45和鹽度65組。

不同鹽度下HaB藻株葉綠素熒光參數的變化如圖5e和5f所示。從圖5e中可以看到5個實驗組中Fv/Fm最大值分別為0.643、0.656、0.669、0.657和0.651,最高值出現在鹽度45實驗組;而從圖5f中可以看到ETRm最高值出現在鹽度25實驗組,但不同實驗組差別不大,反映出鹽度對HaB藻株光合潛力的影響不大。

2.2.4 不同鹽度對3株藻生化組分的影響 表2顯示鹽度對HaF、HaI和HaB藻株總脂、多糖、葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響。單因子方差分析結果表明,不同鹽度組對3株分離藻生化組分含量均有顯著影響(p<0.05)。

表2 不同鹽度培養下HaF、HaI、HaB生化組分的變化

3個實驗藻株總脂含量的最高值均出現在鹽度5實驗組,分別為68.231%、60.125%和63.324%。HaF和HaI藻株總脂含量的最低值均出現在鹽度25實驗組,分別為37.422%和45.168%,HaB藻株總脂含量的最低值出現在鹽度45實驗組,為36.523%。出現最低總脂含量的實驗組鹽度恰好是各分離藻株比生長速率最高的鹽度。

但與總脂含量的變化相反,3個實驗藻株多糖含量的最低值均出現在鹽度5實驗組,最高值均出現在鹽度85實驗組,3個藻株多糖含量的最高值分別比最低值高92.75%、32.74%和44.24%。

3個分離藻株各鹽度實驗組的光合色素含量最高值及最低值均與藻株比生長速率最高值和最低值的實驗鹽度相一致。如HaF和HaI藻株葉綠素a和類胡蘿卜素含量的最大值均出現在鹽度25實驗組中,HaF藻株分別為3.731和1.472 μg/mL,HaI藻株分別為3.228和0.926 μg/mL,最低值均出現在鹽度5和85極端鹽度的實驗組。2個藻株在2個極端鹽度實驗組的葉綠素a和類胡蘿卜素含量均有顯著差異,如鹽度5實驗組,HaF藻株的葉綠素a和類胡蘿卜素分別為0.433和0.124 μg/mL,而HaI藻株的葉綠素a和類胡蘿卜素分別為1.053和0.354 μg/mL;HaF藻株鹽度25實驗組的葉綠素a和類胡蘿卜素含量分別比鹽度5實驗組高7.62倍和10.87倍。但是HaB藻株2種色素含量的最大值均出現在鹽度45實驗組,分別為3.507和1.372 μg/mL,最低值僅出現在5實驗組,分別為0.878和0.291 μg/mL。鹽度45實驗組藻株的葉綠素a和類胡蘿卜素含量分別比鹽度5實驗組的高2.99倍和3.72倍,比較而言,HaB藻株對高鹽度有更強的耐受性。

3 討論

18S rDNA、28S rDNA、ITS、rbcL、psbA以及COI是常用的用于鑒定硅藻物種的分子標記[21],多標記組合使用已經成為微藻分子生物學鑒定的常見方法,龔少華等[22]推薦使用rbcL-3P、5.8S rDNA和ITS2組合用于硅藻物種的種屬鑒定。郭立亮等[23]以18S rDNA、ITS、UPA、COI和rbcL5個標記作為硅藻物種鑒定的分子生物學標簽進行有效性評估,發現18S rDNA和rbcL對硅藻物種的區分度效果最好。本研究采取18S rDNA和rbcL兩個分子標記相組合,將分離藻株擴增序列與其相似性最高的翼內繭型藻屬的其他微藻種的相應序列進行比對,結果顯示,分離藻株與翼內繭型藻屬存在更近的親緣關系。

已有研究顯示,鹽度影響著硅藻物種的生態位[24-25]。本研究分離的藻株采自黃河口灘涂,受季節性降雨以及上游淡水注入,加之灘涂水分蒸發,灘涂鹽度處于頻繁的變化之中。結合黃河口灘涂鹽度變化范圍[24],本研究初篩實驗鹽度為5和80,研究結果表明,11株分離藻株在2個極端鹽度下生長狀況差異顯著,其中鹽度5培養條件下,有8株分離藻的最大藻細胞密度和比生長速率在7.0×105cell/mL和0.330 d-1以上,但在鹽度80培養條件下,只有2株分離藻的最大藻細胞密度和比生長速率在7.0×105cell/mL和0.330 d-1以上,這說明本研究分離的多數藻株對低鹽的適應能力普遍強于對高鹽的適應能力。

關于翼內繭型藻對鹽度的適應性研究,Yamamoto等[14]發現翼內繭型藻(Entomoneisjaponica)在2～30鹽度范圍內比生長速率從0.151 d-1上升到0.232 d-1,鹽度30時,其比生長速率達到最高值,鹽度50時比生長速率下降至0.074 d-1,幾乎停止生長。本研究將3株翼內繭型藻分別培養在5～85實驗鹽度下,3株藻均可以生長,如在鹽度5～45培養條件下,HaB藻株的比生長速率從0.166 d-1上升到0.323 d-1,而在鹽度45～85培養條件下其比生長速率從0.323 d-1下降至0.219 d-1。相對而言,從黃河口灘涂上分離的翼內繭型藻藻株對鹽度具有比較突出的適應性能力。

光合色素含量的高低與光合能力的強弱正相關,生長狀況越好的藻體光合色素含量越高[26-27]。本研究結果顯示HaF、HaI和HaB藻株光合色素(葉綠素a和類胡蘿卜素)含量最高值時的實驗鹽度均與其生長的最適鹽度完全一致,說明鹽度對實驗微藻光合能力的影響也與其對光合色素合成的影響有關。本研究葉綠素熒光參數ETRm和Fv/Fm的分析結果顯示,HaF藻株在鹽度為5的培養條件下Fv/Fm和ETRm值均顯著降低,說明在低鹽條件下HaF藻株的光合能力受到顯著抑制。HaI藻株Fv/Fm和ETRm值均在鹽度為5的培養條件下達到最大值,這一方面說明HaI藻株對低鹽環境具有較高的耐受性,低鹽脅迫對HaI藻株的光合能力具有一定的刺激作用。HaB藻株在5個不同實驗組Fv/Fm和ETRm差別不大,這表明鹽度變化對HaB藻株光合能力影響不大。 張奇等[28]發現,在鹽度0～50條件下培養小球藻,鹽度為0實驗組中小球藻藻液的溶氧量最低,藻液中溶氧量降低不僅與小球藻光合作用降低有關,也與呼吸耗氧增強有關。Hagemann等[29]發現,低鹽條件下呼吸作用產生的 ATP增多,用于在鹽適應過程中為 P 型 ATP 酶或其他需要能量的過程提供能量。Billini 等[30]發現Na+/H+反轉運蛋白在低鹽培養基中可能是離子穩態所必需的。這些結果表明,鹽度脅迫可增強呼吸作用,從而為相關耗能的生理活動提供必需的能量需求。本研究HaI藻株在鹽度5實驗組光合潛力最高,但藻細胞生長較慢,生物量積累有限,這可能與鹽度為5時,HaI藻株呼吸作用增強,為平衡低鹽脅迫而耗能過高有關。這些結果同時說明3株翼內繭型藻藻株對鹽度脅迫的生理響應機制存在明顯不同。

關于翼內繭型藻培養條件改變對生化組分積累的影響,Thierry等[7]發現翼內繭型藻(E.paludosa)在硅限制培養條件下細胞總脂含量最高,為59%,與對照組相比總脂含量提高了63%。本研究結果顯示,HaF、HaI和HaB藻株3株翼內繭型藻均在鹽度5的培養條件下總脂含量最高,分別為68.231%、60.125%和63.324%,而在優化的鹽度下總脂含量最低,總脂含量最高值與最適鹽度實驗組相比,分別提高了82.33%、33.12%和3.38%。García等[31]也發現在低鹽度時T.weissflogii的脂質含量最高。李嘉穎等[32]發現在鹽度0～30培養范圍內淡水柵藻細胞總脂與多糖含量變化趨勢一致,隨鹽度的升高其含量逐漸降低,而本實驗中3株分離藻株多糖與總脂含量的變化趨勢相反,鹽度為5時,總脂含量最高而多糖含量最低,可見不同藻種的生化合成能力對鹽度變化的反應是不同的。推測低鹽下積累總脂、高鹽下合成多糖可能是黃河口灘涂底棲翼內繭型藻應對鹽度波動的適應方式。

4 結語

本文利用平板涂布方法從黃河口灘涂泥樣中分離出底棲微藻,經18S rDNA和rbcL兩個分子標記組合鑒定其中11株為翼內繭型藻,隨后主要研究了不同鹽度培養條件對分離藻株生長速率、光合潛力和生化組分積累的影響。研究結果表明,河口灘涂上分離的翼內繭型藻藻株對鹽度具有突出的適應性能力,實驗鹽度下都可以生長,但同時也看到不同藻株的最適生長鹽度不同,光合潛力也存在顯著變化,這表明分離藻株鹽度適應性存在差異。不同鹽度培養條件下,多糖含量均表現出隨鹽度增加而上升的現象,最大值出現在高鹽實驗組,而總脂含量最大值出現在低鹽實驗組,3株代表性藻株的色素含量均與比生長速率的變化趨勢一致。這表明光合色素的高低與藻體生長狀態呈正相關,同時低鹽積累總脂,高鹽分泌多糖可能是黃河口灘涂底棲硅藻應對鹽度波動的良好策略。