基于殼聚糖的抗菌可注射自愈性水凝膠的制備及其生物相容性研究*

曹亞嬋, 劉曉坤, 黨奇峰, 劉成圣**

(1. 中國海洋大學海洋生命學院, 山東 青島 266003; 2. 青島海洋生物醫藥研究院, 山東 青島 266075)

近年來,各種各樣的水凝膠材料作為藥物載體、組織支架或傷口敷料被廣泛應用于生物體,為醫學領域的研究提供新的思路和方向[1]。其中水凝膠敷料因具有可以保持濕潤的傷口環境、吸收組織滲出物、允許氧氣通透和促進傷口愈合等優點[2-3]而備受關注。但是目前研究的傳統水凝膠敷料在受到外力刺激后,其網絡結構的完整性會受到損害,影響水凝膠的使用和壽命[4],若水凝膠本身具有自愈能力便可以解決這一問題。同時,傳統水凝膠的抑菌活性低,因此往往會引起作用部位的微生物感染,而且盡管不少研究者額外裝載了抗菌成份,如抗生素[5]或金屬銀顆粒[6],但隨著多種耐藥菌株的出現,細菌的耐藥性問題日益突出[7]。此外在抗菌成分被完全釋出后,水凝膠就會失去抗菌活性。因此,研發具有抗菌可注射的自愈性水凝膠備受期待。換句話說,在生物醫學材料領域中,設計能夠解決當前水凝膠使用完整性和抑菌性問題的新型抗菌性自愈合水凝膠迫在眉睫。

海洋生物醫用材料是生物醫用材料中的重要分支,因其具有資源豐富、功能獨特、生物安全、成本低廉的優點而備受生物材料界的廣泛關注[8]。其中,殼聚糖(Chitosan, CS)作為地球上第二大可再生資源,主要通過廣泛存在于昆蟲、甲殼類硬殼和真菌細胞壁的甲殼質脫乙酰而獲得。CS具有抑菌、止血、愈創、減少疤痕增生、吸附等生物學功能并可被降解,經過物理化學修飾的CS衍生物,已被廣泛應用于生物醫學領域。CS只可溶于部分稀酸溶液(乙酸、鹽酸、硝酸和甲酸等),而不溶于堿液、強酸和水,致使其應用受到很大限制[9]。CS分子鏈上存在大量游離氨基、羧基和羥基等活潑基團,可作為反應位點對其進行化學改性,從而獲得溶解性和生物性能更好的CS衍生物。根據先前的研究,對CS的改性主要有羧基化反應[10]、季氨化反應[11]、烷基化反應[12]、?；磻猍13]、硫醇化反應[14]以及其他化學修飾[15]。

本研究通過取代反應和酰胺反應,首次分別對甘油三甲基氯化銨(GTMAC)和N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine, NAC)進行CS的氨基接枝,以制備溶解性和生物性能更好的N-乙酰半胱氨酸季銨鹽殼聚糖(NAC-QCS)。具有無毒性和良好生物相容性的普魯蘭多糖(Pullulan)經過高碘酸鈉氧化后,生成含醛基的氧化普魯蘭多糖(OP)。以OP作為交聯劑:與NAC-QCS上的氨基發生席夫堿反應生成亞胺鍵;與己二酸二酰肼上的酰肼基團發生縮合反應生成酰腙鍵。NAC-QCS上的巰基經氧化作用生成二硫鍵。在上述3種動態共價鍵的作用下,成功制備出NQC-OP-ADH水凝膠。隨后,研究了NQC-OP-ADH水凝膠的化學結構、形態、溶脹率、膠凝時間、可注射性、自愈性、抑菌性和生物相容性。

1 試劑、材料和儀器

試劑:CS(分子量為410 kDa, 脫乙酰度(DD) 為 95.88%)產自青島百成海洋生物資源有限公司;甘油三甲基氯化銨(GTMAC)產自國藥集團;N-乙酰半胱胺酸(NAC)產自國藥集團;OP產自國藥集團;己二酸二酰肼(ADH)產自國藥集團;其他試劑均為分析純。

材料:L929細胞由中國海洋大學海洋生命學院生物化學實驗室捐贈;大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由青島大學附屬醫院饋贈;動物實驗程序是根據1986年英國動物(科學程序)法案和相關指南進行的,并獲得海洋生命學院倫理委員會批準(SMXY No. 20190909S0208)。

儀器:傅里葉紅外掃描儀(AVATAR-360,美國,Nicolet);冷凍干燥機(FD-1D-50,北京博醫康實驗儀器有限公司);掃描電子顯微鏡(S-3400N,日本日立有限公司);熒光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R,日本尼康公司)。

2 實驗方法

2.1 NQC-OP-ADH水凝膠的制備

根據先前的制備方法[16],經純化得到季銨鹽殼聚糖(QCS)。取1 g QCS溶于80 mL蒸餾水中備用。將4 g N-Cys 溶于20 mL蒸餾水中,并依次加入4.73 g EDC和2.84 g NHS,用1 mol/L HCl溶液調pH = 5.0,活化1 h,結束后將其慢慢滴加到QCS溶液內,調節最終反應液pH = 5.0。室溫下避光攪拌反應6 h,再在4 ℃下避光透析5 d,冷凍干燥后獲得NAC-QCS樣品。

將1 g普魯蘭多糖溶于100 mL蒸餾水中,加入0.53 g NaIO4,在室溫下避光攪拌反應16 h后,再加入0.67 g甘露醇反應2 h,使未參加反應的NaIO4失活。反應結束后,用透析袋透析5 d,冷凍干燥后得到氧化普魯蘭多糖(OP)[17]。

將一定量的NAC-QCS、OP和ADH分別溶于pH = 7.4的磷酸緩沖鹽溶液(Ahosphate buffer saline, PBS)中,將OP溶液加入NAC-QCS與ADH混合的溶液中并立即攪拌均勻,一定時間后形成透明的NQC-OP-ADH水凝膠。

2.2 NQC-OP-ADH水凝膠的性質表征

2.2.1 FT-IR和SEM表征 本文利用FT-IR(傅立葉變換紅外光譜)對CS、NAC-QCS、OP和NQC-OP-ADH水凝膠進行表征,通過官能團的改變,證明產物的成功制備。然后利用SEM(掃描電子顯微鏡)觀察NQC-OP-ADH水凝膠的微結構和形態。

2.2.2 成膠時間、可注射性和宏觀自愈性研究 本文通過管倒置法檢測水凝膠的膠凝時間[18]。將NAC-QCS、ADH和OP溶液迅速混合均勻,在室溫下,每隔10 s將試管倒置,若混合物在倒置后60 s內不再流動則判定溶液已成膠,記錄此時的時間為成膠時間。

將NAC-QCS溶于混有甲基藍(0.002%, wt/vol)的PBS中,隨后加入ADH和OP溶液混合均勻,迅速將溶液轉移至注射器,待其完全成膠后,推動注射器,觀察水凝膠是否可以通過針頭擠出而不堵塞,并在室溫下放置4 h,觀察其通過注射器后能否再愈合為完整水凝膠[1]。

這里選用宏觀自愈實驗來評價NQC-OP-ADH水凝膠的自愈性能。制備3個水凝膠圓盤(直徑20 mm, 厚度3 mm),其中一個為未染色的透明水凝膠,另2個分別用中性紅和甲基藍染色,每個水凝膠圓盤等分成3片,3種顏色的水凝膠各取一片,組合成含有不同顏色的水凝膠圓盤。在室溫下放置4 h,觀察此組合水凝膠圓盤是否會自愈合為一個整體,然后將其用鑷子提起并保持在空中,觀察其是否有損壞,以檢驗其自愈合能力。

2.2.3 溶脹動力學研究 本文研究NQC-OP-ADH水凝膠在0.01 mol/L PBS (pH=7.4)溶液中的溶脹行為,評估其吸收滲出液的能力。將冷凍干燥后的水凝膠進行稱量后,完全浸入盛有5 mL PBS的燒杯內,并置于37 ℃培養箱中,每隔一定時間t將膠取出,用吸水紙除去其表面多余水分,并記錄其質量。待水凝膠質量達到最大且不再變化時,記錄此時的質量。干態下水凝膠在t時刻的溶脹率(Swelling ratio, SR)RS和平衡溶脹率(Equilibrium swelling ratio, ESR)RES的結算式分別為

(1)

(2)

式中:Mt表示t時刻水凝膠的質量;M0表示初始干燥時水凝膠的質量;Ms表示水凝膠的最大穩定質量。

2.3 水凝膠的抑菌活性

將E.coli和S.aureus用無菌PBS稀釋為單位體積(單位:mL)的細菌群落總數(CFU)為1 × 105的細菌懸浮液。在48孔板的每個孔中依次加200 μL NQC-OP-ADH的前體溶液,待其成膠后,在每個水凝膠上滴加10 μL細菌懸浮液,37 ℃培養2 h后,每孔中加入1 mL無菌PBS,然后懸浮剩余存活細菌,再從中取15 μL細菌懸浮液涂布在瓊脂平板上,37 ℃培養24 h,對瓊脂平板上的菌落進行計數。將直接懸浮在1 mL PBS中的10 μL細菌懸浮液用作陰性對照。抑菌率R的計算式為

(3)

式中:Qh表示用水凝膠培養的細菌數量;Qc表示用PBS培養的對照組細菌數量。

2.4 水凝膠的生物相容性

2.4.1 溶血實驗 取預先凍干的NQC-OP-ADH水凝膠研磨成粉末并懸浮于1 mL生理鹽水中,37 ℃溫浴1 h。將新鮮抽取的4 mL小鼠血液在含有0.2 mL肝素鈉抗凝血劑的抗凝管內混勻,并加入5 mL生理鹽水稀釋血液。然后在含有樣品的離心管內加入60 μL稀釋血液,輕輕混勻,置于37 ℃孵育1 h。用離心機1 200 r/min離心5 min后取上清液,并將上清液加入96孔板中,用酶標儀測波長在545 nm處的吸光度值。實驗以蒸餾水作為陽性對照,生理鹽水作為陰性對照。溶血率(Hemolysis rate, HR)RH的計算式為

(4)

式中:VOD,s為實驗組樣品的吸光度值;VOD,nc為陰性對照組(生理鹽水)的吸光度值;VOD,pc為陽性對照組(蒸餾水)的吸光度值。

2.4.2細胞毒性實驗 用噻唑藍(MTT)比色法檢驗NQC-OP-ADH水凝膠的細胞毒性。NQC-OP-ADH水凝膠在細胞培養液中分別浸提1、6、12和24 h,浸提液用孔徑0.22 μm的濾膜過濾除菌備用。向96孔板依次加入200 μL L929細胞懸浮液(8×103個/mL),37 ℃孵育12 h,吸出每孔內的細胞培養液,并向每兩行孔內分別加入一種浸提時間的浸提液(200 μL),四個時間點的浸提液依次加入96孔板內。該實驗中,共培養了3板96孔板的細胞,這三板細胞需在37 ℃下分別培養24、48和72。結束后,向每孔加入各20 μL MTT培養4 h。取出96孔板,去除每孔內的溶液,加入200 μL 二甲基亞砜(DMSO),放入37 ℃恒溫搖床繼續培養15 min,用酶標儀測波長在490 nm處的吸光度值。細胞存活率(Cell viability)Rcv的計算式為

(5)

式中:VOD,s為實驗組樣品的吸光度值;VOD,c為空白對照組的吸光度值。

2.4.3 水凝膠的細胞表面培養 在24孔板的每孔中加入500 μL NQC-OP-ADH前體溶液,待成膠后,在每個水凝膠上加入500 μL L929細胞懸液,在37 ℃下分別培養1、3和5 d(每隔1 d換一次培養液)。相應培養時間結束后,吸出孔內的細胞培養液,并用PBS輕輕蕩洗3次,加入4 μmoL/mL 鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)200 μL,37 ℃培養15 min,吸出Calcein-AM溶液,用PBS小心清洗3次,確保水凝膠上的Calcein-AM清洗干凈。最后將24孔板避光放置在激光共聚焦顯微鏡下觀察,將激發波長調節為490 nm,將發射波長調節為515 nm。在490 nm波長激發下,活細胞為黃綠色,然后進行表面拍攝和3 D拍攝,并收集圖像。

2.4.4 水凝膠的細胞包埋培養 將離心得到的L929細胞懸浮在OP溶液中,加入NAC-QCS和ADH溶液迅速混勻,以制備包埋有細胞的NQC-OP-ADH水凝膠,在每份水凝膠上加入500 μL細胞培養液,然后在37 ℃下分別培養1、3和5 d(每隔1 d換一次培養液)。用Calcein-AM溶液對活細胞進行染色,以評估細胞活力,然后在激光共聚焦顯微鏡下進行3 D拍攝,并收集圖像。

3 結果與討論

3.1 NQC-OP-ADH水凝膠的制備和性質表征

3.1.1 NQC-OP-ADH水凝膠的合成路線、FT-IR和SEM表征 NQC-OP-ADH水凝膠的合成路線如圖1所示,紅外光譜如圖2所示。同CS相比,NAC-QCS光譜中在1 481 cm-1處出現一個新的強峰,此峰對應于GTMAC的甲基帶特征峰[19]。由于NAC上的—COOH與CS主鏈上—NH2發生酰胺化反應,生成新的酰胺基團,所以在NAC-QCS光譜中1 649 cm-1處的酰胺Ⅰ譜帶和1 303 cm-1處的酰胺Ⅲ譜帶強度增強,而1 610 cm-1處的酰胺Ⅱ譜帶減弱。NAC-QCS在2 516 和524 cm-1處出現微弱的新峰分別是NAC中—SH和—S—S—特征峰[20-21]。以上發現說明GTMAC和NAC均成功接枝在CS的—NH2上,生成新的產物NAC-QCS。

圖1 NAC-QCS (a)、OP (b) 和NQC-OP-ADH水凝膠 (c) 的合成路線

圖2 CS、NAC-QCS、OP和NQC-OP-ADH水凝膠的紅外光譜

圖3是液氮快速凍干的NQC-OP-ADH水凝膠的掃描電鏡圖。水凝膠內部有清晰的多孔狀結構,孔徑大多為40 μm左右,使水凝膠具有同外界交換氣體和液體的能力,孔的大小也適合細胞遷移到水凝膠中,并在基質內均勻分布,進行營養物和代謝產物的交換[26]。

((a)500 ×; (b)1 000 ×.)

3.1.2 水凝膠成膠時間、可注射性和宏觀自愈性研究 NQC-OP-ADH水凝膠的成膠時間約為(82±8) s, 適宜的成膠時間可滿足水凝膠作為注射性水凝膠應用于醫學領域。

同傳統水凝膠相比,自愈合水凝膠能夠在受到損傷后恢復其結構和功能,從而擁有更長的使用時間。具有可注射性的自愈合水凝膠可以通過微創方式進行體內藥物遞送,從而減輕患者疼痛,并能使微小創面得到更快恢復[27]。在本研究中,觀察到NQC-OP-ADH水凝膠從注射器的針頭內擠出,沒有堵塞針孔(見圖4(a)),為給水凝膠向生物體的注射提供可能性,并且在4 h后又自愈合為完整的水凝膠形態(見圖4(b)),這主要歸因于水凝膠的黏度會隨著剪切應力的增加而降低,即剪切稀化特性[28]。

圖4 NQC-OP-ADH水凝膠的注射過程(a)和4 h后自愈的水凝膠(b)

NQC-OP-ADH水凝膠的自愈過程照片如圖5所示。水凝膠在室溫下放置4 h,不施加任何外力的情況下,愈合為一個完整的水凝膠圓盤(見圖5(c)),2種顏色水凝膠之間的界限變得模糊,當用鑷子將其夾住并在空中保持靜止時,水凝膠圓盤也能在自身重力作用下完好無損(見圖5(d)),這表明愈合水凝膠的交界處并不是簡單的粘合而是動態共價鍵的動態反應,在中性條件下實現了良好愈合,主要歸功于水凝膠中—NH2和—CHO之間形成的動態亞胺鍵。動態共價鍵既有共價鍵的穩定性又有非共價鍵的可逆性,它可以在水凝膠網絡中建立鍵生成和解離的內在動態平衡,從而賦予水凝膠自我修復的能力[29]。

((a)水凝膠圓盤;(b)剛組合的水凝膠圓盤;(c)愈合4 h的自愈合水凝膠;(d)基于自身重力下的愈合水凝膠。(a)Hydrogel disks; (b)Hydrogel disks just combined;(c)Self-healed hydrogel disks after healing for 4 h;(d)Self-healed hydrogel disks based on its own gravity.)

3.1.3 溶脹動力學和平衡溶脹率 NQC-OP-ADH水凝膠的溶脹動力學曲線如圖6所示。

圖6 NQC-OP-ADH水凝膠在PBS(pH=7.4)的溶脹動力學

在開始的60 min內,水凝膠表現出快速吸水的能力,溶脹率達到了(14.84±0.71) g/g,這主要是由于NQC-OP-ADH水凝膠為多孔網狀結構,這些孔之間相互連通,形成通道,水分子或溶劑分子通過對流方式快速進入到水凝膠內部,使水凝膠的體積隨溶劑分子的進入而不斷膨大,產生溶脹現象[30]。60 min時,水凝膠內部已含有大量的溶劑分子,隨著時間的延長,溶劑分子進入水凝膠的速度減慢,致使水凝膠的溶脹率緩慢增加,最后達到溶脹平衡,最終的平衡溶脹率為(16.86 ± 0.25) g/g。NQC-OP-ADH水凝膠具有良好的溶脹性能,因此有助于吸收大量的滲出液,減少傷口浸潤,為其在組織工程中的應用提供支持。

3.2 水凝膠的抑菌實驗

NQC-OP-ADH水凝膠對Escherichiacoli和Staphlococcuaureus的抑制率如圖7所示。由式(3)計算出NQC-OP-ADH水凝膠對E.coli的抑制率為84%,對S.aureus的抑制率為99%?？梢钥闯?NQC-OP-ADH水凝膠對2種菌都顯示出良好的抗菌能力,但是對S.aureus(革蘭氏陽性菌)的抑制作用優于對E.coli(革蘭氏陰性菌)的抑制作用,可能是由于細菌細胞壁成分和結構的不同而導致的。革蘭氏陽性菌的細胞壁由一層厚而致密的肽聚糖和磷壁酸組成,帶負電荷的磷壁酸與NQC-OP-ADH水凝膠中帶正電荷的季銨基團發生靜電相互作用,破壞細菌細胞膜,致使細菌死亡。而革蘭氏陰性菌的細胞壁由薄的肽聚糖層、外部脂多糖層和脂蛋白層等多層潛在屏障組成,不含有磷壁酸,依靠帶有少量負電荷的脂多糖、蛋白質或磷脂同帶正電荷的季銨基團發生靜電相互作用,因此其作用強度較弱[31]。故NQC-OP-ADH水凝膠對革蘭氏陽性菌的表面接觸抑制率更高。

((a)和(b)分別展示當用pH=7.4的PBS作為對照培養時E. coli和 S. aureus的生長情況;(c)和(d)分別展示水凝膠接觸培養后E. coli和 S. aureus的生長情況;(e)水凝膠對細菌的抑制率。(a) and (b) show the growth of E. coli and S. aureus when pH = 7.4 PBS was used as control, respectively; (c) and (d) show the growth of E. coli and S. aureus after hydrogel contact culture, respectively;(e)Inhibition rate of bacteria by hydrogel.)

3.3 水凝膠的生物相容性

3.3.1水凝膠的溶血性實驗 NQC-OP-ADH水凝膠的溶血率如表1所示。實驗結果表明,稀釋的血液經過NQC-OP-ADH水凝膠作用后,其溶血率為(1.168±0.055)%(小于2%),說明水凝膠不溶血,暗示著NQC-OP-ADH水凝膠有良好的血液相容性,可作為生物材料應用于組織工程。

表1 NQC-OP-ADH水凝膠的溶血率

3.3.2 水凝膠的細胞毒性實驗 不同浸提時間的NQC-OP-ADH水凝膠浸提液的細胞毒性如圖8所示。實驗結果顯示,在培養L929達24 h時,4個時間段的NQC-OP-ADH水凝膠浸提液均表現出促進細胞生長的趨勢,細胞存活率均大于100%,這可能歸因于水凝膠在細胞培養液中被浸提出的成分利于細胞生長,此成分被細胞作為營養物所利用,從而促進細胞生長;也有可能是在早期的培養過程中,NQC-OP-ADH水凝膠中帶正電荷的季銨基團與細胞膜上帶負電荷的磷酸基團發生相互作用,更好地促進細胞黏附。通過對24、48和72 h的細胞培養結果進行統計學分析發現,相同浸提時間的數據間并無顯著性差異。隨著培養時間延長至48和72 h,細胞存活率沒有明顯的增長,除了同細胞培養液的營養成分不足和代謝物的積累有關之外,還可能由于培養一段時間后細胞鋪滿底部而導致生長空間有限,細胞間發生接觸抑制,不利于細胞的生長。另一方面,NQC-OP-ADH水凝膠中含有季銨基團,在與細胞的長時間接觸過程中,可能會對細胞膜產生作用,影響細胞的生長。但在整個培養過程中細胞存活率始終大于80%,符合一級細胞毒性評級,表明NQC-OP-ADH水凝膠具有良好的細胞相容性,故具有作為生物醫學材料的應用潛力。

(p<0.05; p<0.01.)

3.3.3 水凝膠的細胞表面培養 應用于生物醫學領域的材料必須具有良好的細胞相容性[27],故對NQC-OP-ADH進行細胞培養并檢測細胞相容性是必不可少的。圖9為NQC-OP-ADH水凝膠對L929細胞表面培養1、3和5 d的熒光拍攝圖片。實驗結果顯示,從第1 天到第5天,水凝膠中綠色熒光強度逐漸變強,有大量的活細胞生長,且細胞增殖有明顯增長的趨勢(見圖9(a))。從3D圖片(見圖9(b))可明顯觀察出,水凝膠內部也有大量細胞生長,且隨時間的推移,細胞有向水凝膠深處遷移的趨勢。主要歸因于細胞接種在水凝膠表面后,由于水凝膠內部的孔狀網絡結構為細胞提供了遷移黏附空間,使細胞從表面遷移到水凝膠內部。實驗結果初步表明NQC-OP-ADH水凝膠有良好的細胞相容性。

圖9 NQC-OP-ADH水凝膠表面培養L929細胞熒光照片的平面圖(a)和3D圖(b)

3.3.4 水凝膠的細胞包埋培養 將L929細胞包埋在NQC-OP-ADH水凝膠內部,觀察細胞生長情況,如圖10所示。觀察到包埋在水凝膠內部的細胞有良好的生長狀態,且隨著培養時間的增加,細胞數量增多,表明細胞在水凝膠內部有增殖行為。通過細胞表面培養和包埋培養,都顯示出NQC-OP-ADH水凝膠有良好的細胞相容性,能為細胞提供良好的生長環境,為進一步應用于生物醫學領域提供支持。

圖10 NQC-OP-ADH水凝膠包埋培養L929細胞的3 D熒光照片

4 結論

(1)以海洋生物材料CS為基礎材料,通過3種動態共價鍵的作用制備出新型NQC-OP-ADH水凝膠,該水凝膠具有孔徑約為40 μm的三維網絡孔狀結構,且具有快速吸水的能力和良好的溶脹性能,有助于吸收傷口部位大量的滲出液,減少傷口浸潤,為其在組織工程中的應用提供支持。NQC-OP-ADH能快速成膠,且成膠后仍有可注射性;被分割的水凝膠圓盤重新靠近組合時,可通過動態共價鍵自我愈合。

(2)NQC-OP-ADH水凝膠對E.coli和S.aureus的抑菌率分別為84%和99%,表現出良好的抑菌活性。

(3)NQC-OP-ADH水凝膠其溶血率小于2%,可判定為不溶血材料;其在培養L929細胞24、48和72 h過程中,細胞存活率始終大于80%,且L929細胞在水凝膠表面和內部培養時具有良好的生長狀態,表現出低細胞毒性和良好的細胞相容性。