環境因素和繁殖特性對真江蘺受精效率的影響*

張贏月, 楊金鑫, 齊 聰, 杜啟睿, 徐 滌

(中國海洋大學海洋生命學院, 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室, 山東 青島 266003)

作為廣泛分布在沿海潮間帶的大型海洋紅藻,真江蘺(Gracilariavermiculophylla)具有重要的經濟價值。與近源物種龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)一樣,真江蘺也可作為提取瓊膠的重要原料,其瓊膠含量高達16%～28%,且藻膠質量較高,屬于重要的海洋生物資源[1-2]。此外,真江蘺提取物具有對黃嘌呤氧化酶和酪氨酸酶進行抑制作用藥用價值[3-4]。真江蘺對氮磷營養物質和重金屬具有較強的吸收能力,可顯著降低海水富營養化,改善水質環境,抑制有害赤潮藻的生長[5-6]。

據報道,江蘺已成為栽培規模超1萬hm2的全國第二大栽培海藻,年產約36萬t干品[7]。目前國際上對江蘺的養殖,無論是智利江蘺(G.chilensis)還是龍須菜都是采用依賴營養繁殖的夾苗生產方式[8-9],優點是增殖速度快,對養殖戶來說操作簡單易行。但隨著養殖范圍的擴大以及養殖品種栽培時間和密度的增加,栽培海區會出現病害頻現和藻種性狀退化的問題。此外,栽培季節苗種需求量的不斷增加也制約著產業的發展。而這些問題的解決方法之一就是需要建立以有性繁殖為基礎的采孢子育苗體系,這涉及對江蘺的生活史及發育調控的深入研究。

真江蘺擁有真紅藻綱(Florideophyceae)典型的三世代型生活史,包括二倍體的四分孢子體世代(Tetrasporophyte)和果孢子世代(Carposporophyte),以及單倍體的配子體世代(Gametophyte)[10-12]。真江蘺的四分孢子體及雌、雄配子體盡管屬于等世代的分枝狀藻體,但成熟后特征明顯,表觀上很容易區分,可分別觀察到深紅色的四分孢子囊、突出的果孢子體和開口較大的精子囊窩[13],是進行江蘺科物種發育研究的好材料。

要實現完全人工可控的孢子采苗必須能在實驗室保存優良品系并建立起成熟的促進孢子形成和釋放的方法和流程。但到目前,對孢子放散過程和存活率影響條件的研究較多[14-16],而對孢子形成過程的影響因子研究較少。常用于采苗的果孢子是由江蘺雄、雌配子體分別產生的精、卵受精后形成的果孢子體產生和釋放的,因此其產量會受到決定受精效率的各種因素的影響。本實驗將研究真江蘺的繁殖特征因素(如精子數量、共培養時間(雌、雄配子體)、精子放置時間、配子體脫水時間)和環境因素因素(溫度、光照強度、光照周期)對受精效率的影響,以期為其依賴有性生殖的采孢子育苗以及雜交育種提供數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 用于雜交實驗的真江蘺雌、雄配子體

本實驗所用真江蘺雌配子體和雄配子體的成熟藻株于2021年6月采自青島浮山灣潮間帶(36°0′N,120°2′E)。材料采集回實驗室后首先使用毛刷進行清理,去除雜藻及其它附生物,然后用消毒海水多次沖洗。下列實驗若無特殊說明則培養條件為:改良的f/2海水培養基、溫度23 ℃、光照35 μmol·m-2·s-1、光照周期12L/12D。實驗前將真江蘺雌、雄藻株在恒溫培養箱中預培養兩周,使藻體適應實驗室環境,同時排除采集時雌配子體上可能已有果胞受精而引起的實驗誤差。

實驗時所用雌、雄配子體藻段都是保留有尖部生長點且長度大約為3～4 cm的一、二級分枝,平均分配到每個實驗組,以消除分枝間可能出現的個體差異。

1.2 真江蘺雌、雄配子體的受精實驗設置

下列實驗如無特別說明都采用雌、雄配子體共培養的方式完成受精過程,具體設置如下:將預培養的真江蘺雄配子體和雌配子體藻段各3段放在一個三角瓶中共培養,每日手動搖晃3次,7 d后每3 d更換一次培養基,30 d后對每條雌配子體上形成的果孢子體進行計數,結果取平均值。所有實驗設3個平行樣。

1.3 精子數量對受精效率的影響

真江蘺雄配子體藻枝表面遍布精子囊窩,為避免藻枝從尖端到基部不同位置精子成熟度不同,本實驗中只取成熟度相似的藻枝中段大約5 cm的部分進行實驗。將不同長度的雄配子體與共培養的雌配子體藻枝進行受精,其長度分別為2、6、10、14、16 cm,由1條或多條藻枝組成。

1.4 雌、雄配子體共培養時間對受精效率的影響

在雌、雄配子體共培養的時間為0.5、1、3、5 h時,分別取出雌配子體,瀝干水分后放入到新的含150 mL f/2海水培養基的三角瓶中繼續培養。

1.5 精子放置時間對受精效率的影響

選取總長度約90 cm的成熟雄配子體藻段置于500 mL錐形瓶中,加入400 mL f/2海水培養基,100 r/min搖床振蕩6 h促進精子釋放,然后取出雄配子體,獲得精子懸液。將該精子懸液平均分裝后分別靜置0、2、4、6、12 h,放入雌配子體藻枝進行受精,7 d后開始每3 d換一次水,30 d后進行計數。

1.6 雄配子體脫水時間對精子放散的影響

用吸水紙吸去成熟雄配子體藻段的表面水分后,平均分為4組,分別干燥脫水0、0.5、1、2 h,然后將各組藻枝分別放入三角瓶中100 r/min搖床振蕩6 h,使精子放散。將振蕩獲得的精子懸液平均分裝到3個150 mL三角瓶中,每瓶100 mL,分別放入3根成熟雌配子體藻段,于搖床上溫和旋轉的情況下,與精子共培養12 h,后進行換水和計數,過程同上。

1.7 溫度對受精效率的影響

按溫度15、20、25 ℃將實驗材料分為3組,對真江蘺雌、雄配子體進行共培養。

1.8 光照強度對受精效率的影響

按光照強度15、25、35、45 μmol·m-2·s-1將實驗材料分為4組,對真江蘺雌、雄配子體進行共培養。

1.9 光照周期對受精效率的影響

按光照周期8L/16D、12L/12D、14L/10D、16L/8D、24L/0D(全光照)將實驗材料分成5組,對真江蘺雌、雄配子體進行共培養。

1.10 受精效率計算方法及統計學分析

據報道和觀察,真江蘺雌配子體果胞頂端的受精絲不延伸出藻體表面,顯微觀察無法直接判斷受精情況,因此只能間接使用單位長度藻枝上形成的果孢子體數量來表示受精效率。

各實驗組在培養30 d后記錄每條雌配子體上形成的果孢子體數量,然后取平均值。數據采用ANOVA分析及t-檢驗來確定各實驗組果孢子體數的差異,P<0.05為差異顯著,P<0.01為極顯著。各圖數據上都標明標準誤差(SD)誤差線。

2 結果

2.1 精子數量對受精效率的影響

如圖1所示,以不同雄配子體長度代表的精子數量對受精效率影響顯著(P<0.05)。前4組的果孢子體數目隨著雄配子體長度的增加而顯著增加,在雄配子長度為14 cm時,果孢子體數量出現最大值,而當雄配子體長度增加到16 cm時,果孢子體數沒有明顯增長。

圖1 精子數量對真江蘺受精效率的影響

2.2 雌、雄配子體共培養時間對受精效率的影響

如圖2所示,雌、雄配子體共培養的時間對受精效率有極顯著影響(P<0.01),隨著共培養時間的逐漸延長,果孢子體數目呈現增加趨勢。本實驗在雌、雄配子體的共培養時間僅有0.5 h時,雌配子體上就可以形成果孢子體,而在5 h時果孢子體數目出現最大值。

圖2 真江蘺雌、雄配子體共培養時間對受精效率的影響

2.3 精子放置時間對精子活性的影響

如圖3所示,精子放置時間對其受精效率有顯著的影響(P<0.05)。精子釋放后隨著放置時間的增加,雌配子體上產生的果孢子體數逐漸減少,說明精子活力逐漸降低。放置12 h后,共培養的雌配子體上已沒有果孢子體形成。多重比較結果可知,在放置2 h時,精子仍能保持較高活性,同對照組相比無顯著性差異(P>0.05);而4、6、12 h處理組均同0 h對照組有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 真江蘺精子懸液放置時間對精子活性的影響

2.4 雄配子體脫水時間對受精效率的影響

如圖4所示,真江蘺雄配子體的脫水時間對受精效率有極顯著影響(P<0.01),說明放散的精子量差異顯著。多重比較可知,2 h處理組同0、0.5、1 h處理組果孢子體數均有顯著性差異,而0、0.5、1 h處理組間沒有顯著差異。結果表明脫水處理2 h后可顯著刺激精子的釋放。

圖4 真江蘺雄配子體脫水時間對受精效率的影響

2.5 溫度對真江蘺受精效率的影響

如圖5所示,溫度對真江蘺受精效率影響極顯著(P<0.01)。20和25 ℃條件下真江蘺能正常受精,而15 ℃組中沒有果孢子體形成。25 ℃時雌配子體形成的果孢子體數量最高,是20 ℃組的2倍左右。因此,本實驗中25 ℃是真江蘺受精的最適溫度。

圖5 溫度對真江蘺受精效率的影響

2.6 光照強度對真江蘺受精效率的影響

如圖6所示,光照強度對真江蘺受精存在顯著影響(P<0.05)。結果顯示,光照強度為25 μmol·m-2·s-1時,果孢子體數量出現最大值(P<0.01),為真江蘺受精的最適光照強度,而更低和更高的光強并不適合真江蘺的受精過程。

圖6 光照強度對真江蘺受精過程的影響

2.7 光照周期對真江蘺受精效率的影響

如圖7所示,光照周期對真江蘺受精具有顯著影響(P<0.05)。隨著光照時間的延長,雌配子體上的果孢子體數呈現先上升后下降的趨勢。當光照周期為14L/10D時,雌配子體上的果孢子體數出現最大值,為真江蘺受精的最適光照周期。

圖7 光照周期對真江蘺受精效率的影響

3 討論

江蘺孢子育苗的研究主要集中在孢子放散和培育后期的條件優化。例如有研究顯示,溫度、光照強度和鹽度對真江蘺四分孢子放散和發育具有顯著影響(P<0.05),溫度20～25 ℃、光照強度15～60 μmol·m-2·s-1、鹽度28～36等環境條件有利于真江蘺四分孢子的放散和成活[17]。另有研究表明,同真江蘺情況相似,溫度、光照強度和鹽度對龍須菜果孢子的釋放也具有顯著的影響(P<0.05)[15]。但孢子的形成過程也會受到各種條件的影響,例如四分孢子的形成同減數分裂這一有性繁殖中心事件相關,而果孢子的形成會受到決定受精效率的各種因素的影響。本實驗室針對江蘺受精過程的影響以及在該過程中的一些繁殖特征進行了系列研究。

本研究結果證明,在真江蘺的受精過程中,溫度、光照強度和周期這3個外界條件因素都會產生顯著影響。但是根據單因素方差分析結果顯示,溫度的影響極顯著,對真江蘺受精過程的影響大于光照強度和周期,該結果同在龍須菜中的實驗結果一致[18]。溫度是影響大型藻類生長、發育和繁殖的重要因素之一,可能通過改變光合作用相關的酶活性,導致藻體不同的生理狀態[19]。本單因素影響實驗的結果顯示,25 ℃、25 μmol·m-2·s-1、14L/10D是最適合真江蘺受精的條件。

以往對龍須菜的研究發現,雌配子體的不同分枝間生殖力有差異,一級分枝最高且最尖端也可以形成大量果孢子體[18],這同龍須菜四分孢子體的生殖力非常相似,有研究發現80%以上的龍須菜四分孢子囊生長在其一級分枝上[20]。然而針對江蘺受精特征的研究較少,故本文對于真江蘺自身受精過程進行探究,進而揭示了3條規律:(1)精子放散出來后活性會不斷降低,本實驗使用的精子懸液在放置了12 h后同雌配子體雜交就再沒有果孢子體產生,4個實驗組均同對照組有顯著差異,說明精子釋放后活性大約可保持6 h;(2)精子同受精絲的識別和融合所需的時間可以很短,例如在一種絲狀紅藻麗絲藻(Aglaothamnionoosumiense)中的研究顯示,30 min內即可完成精子同受精絲的細胞膜融合[21],在本實驗所設的0.5 h組也觀察到已有果孢子體生成。不過隨著受精時間的延長,果孢子體數目也極顯著地增加,說明多數精子完成受精的過程可能需要幾個小時。(3)在實驗所設置的受精小體系中,采用增加雄配子體的長度來增加產生精子的量,當長度達到14 cm時,在設置的200 mL體系中受精產生的果孢子體數量已達到最高,而2 cm組產生的果孢子體數量遠大于14 cm組的1/7,說明精子放散數量超過了雌配子體接受的上限值,不再成為受精過程的限制因素。以上幾點可能共同表示真江蘺存在著快速受精的現象,以保證大量活性精子可參與受精作用,提高受精效率[22]。此外有研究結果還顯示,對雄配子體進行適當的脫水刺激有利于精子的釋放,這同經過干燥刺激可以促進孢子放散的結果相似[23-24]。有研究證明,果孢子的放散機制是果孢子囊內水動力環境的改變,產生黏液,黏液推動了孢子放散[25-26],由此推測,雄配子體脫水后重新浸入水中,生殖窩中精子的附屬物可能發生了水合作用,從而推動了精子的放散。

本實驗通過對真江蘺受精過程內在繁殖特性與外界環境因素影響的探究,加深了對江蘺受精的了解,以期提高受精效率。同時,這也為建立全程可控的雌、雄配子體雜交受精體系提供了理論依據與技術支持,使大規模栽培產業所需同步成熟孢子的數量得以滿足。